检测血清中的不饱和铁结合力的试剂盒及方法与流程

本申请涉及体外检测领域，特别是涉及血清中的不饱和铁结合力的检测。

背景技术：

铁是血红素的必需元素，血红素是合成血红蛋白和肌红蛋白的原料，也是促进b族维生素代谢必不可少的物质。血清中的铁离子全部与转铁蛋白结合，是铁离子的运输形式，称为血清铁(fe)。通常血清中的转铁蛋白相对于铁离子是过量的，其中约有三分之一的转铁蛋白会被血清铁结合，而未被血清铁结合的转铁蛋白的量用不饱和铁结合力(uibc)表示。不饱和铁结合力是指血清中为被血清铁饱和的转铁蛋白能够结合的铁离子的量。血清中所有转铁蛋白能结合的最大铁离子的量称为总铁结合力(tibc)，它等于血清铁与不饱和铁结合力之和。血清铁、不饱和铁结合力、总铁结合力的检测可用于辅助临床疾病诊断。例如，血清铁增高时常见于溶血性贫血、再生障碍性贫血、巨红细胞性贫血等；血清铁降低见于缺铁性贫血、慢性长期失血、恶性肿瘤等；总铁结合力升高见于缺铁性贫血、急性肝炎等；总铁结合力降低见于肝硬化、肾病、尿毒症和血色素沉着症等。因此，血清铁、不饱和铁结合力、总铁结合力的测定具有重要的临床意义。

目前，测定不饱和铁结合力的方法中应用较为广泛的是比色法，可应用于全自动化生化仪上，进行大批量临床样本的检测。

转铁蛋白与铁离子是可逆结合的，在酸性条件铁离子从转铁蛋白上解离下来，在碱性条件下铁离子则与转铁蛋白结合。因此，比色法测定不饱和铁结合力的原理是在ph大于7.5的碱性条件下，用标准浓度的铁离子溶液饱和样本中的转铁蛋白后，检测剩下的游离铁离子浓度，用加入的铁离子的量减去游离的(即过量的)铁离子的量即可得到不饱和铁结合力。为了测定游离的(即过量的)铁离子的量，需要加入还原剂使得铁离子还原成亚铁离子，再用能与亚铁离子络合的发色试剂去络合亚铁离子，在特定检测波长下进行比色测定。

根据不饱和铁结合力的检测原理，过量且定量的亚铁离子在ph大于7.5的缓冲液中与发色试剂反应。该反应在碱性条件下进行，而亚铁离子在碱性条件下不稳定。另外，在自动生化仪中测定不饱和铁结合力的过程中，在自动生化仪的反应杯、试剂针、搅拌杆等部件上可能残留亚铁离子，特别是在检测完毕后用碱性清洗剂清洗自动生化分析仪之后，亚铁离子残留问题更为显著，导致下次使用该反应杯、试剂针、搅拌杆等部件时因为残留的亚铁离子而存在交叉污染。这样的交叉污染包括对不饱和铁结合力检测的污染，也包括对其他生化试剂项目的污染。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测血清中的不饱和铁结合力的试剂盒和方法，本发明能够使用于检测不饱和铁结合力的亚铁离子或铁离子在碱性条件下更加稳定并且显著减少、甚至避免对检测装置，例如自动生化仪造成的交叉污染。

为此，本发明的第一方面提供一种检测血清中的不饱和铁结合力的试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括ph值为7.5～9.0的缓冲液、还原剂、亚铁离子以及能与亚铁离子螯合的螯合剂，所述第二试剂包括缓冲液、尤其是ph值为7.5～9.0的缓冲液以及能与亚铁离子络合而显色的发色试剂。

本发明通过在第一试剂中加入一定浓度的既能与亚铁离子结合、又不干扰亚铁离子与转铁蛋白的结合且不干扰亚铁离子与发色试剂的反应的螯合剂，使得未与转铁蛋白或发色试剂结合的亚铁离子在碱性条件下呈被螯合的状态，不与氢氧根离子结合生成沉淀，从而亚铁离子在碱性条件下更加稳定。此外，如果在自动生化仪的反应杯、试剂针、搅拌杆等部件中残留有亚铁离子，则残留的亚铁离子由于与螯合剂结合而更容易被清洗，从而避免产生交叉污染。

由于所述第一试剂包含亚铁离子，因此需要同时在该第一试剂中加入还原剂，以便能够使亚铁离子保持不被氧化为铁离子。因此，存在于第一试剂中的还原剂不仅在整个检测过程中防止亚铁离子被氧化，还可在试剂盒的有效期内防止亚铁离子被氧化。当然，在所述第二试剂中也可以包括还原剂。

在一种实施方式中，所述第二试剂的缓冲液可以为酸性或碱性的，只需要确保所述第二试剂与所述第一试剂混合后的混合液为碱性的即可。

根据一种实施方式，所述第一试剂和所述第二试剂的缓冲液可以分别选自磷酸盐缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(tris)-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的至少一种，优选可以为tris-盐酸缓冲液。用于本发明的缓冲液的浓度为常规检测试剂的浓度例如可在0.1～1mol/l的范围内、优选可以在0.2～0.6mol/l的范围内。

在此应该指出的是，本文所述试剂中的组分浓度是指该组分在所在试剂中的浓度，另有说明的除外。

根据具体实施方式，所述螯合剂可以选自酒石酸、酒石酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、次氮三乙酸、氮氚三乙酸中的至少一种。酒石酸盐可为酒石酸的碱金属盐，例如酒石酸钾钠。柠檬酸盐可为柠檬酸的碱金属盐，例如柠檬酸钠或柠檬酸钾。所述螯合剂优选为柠檬酸盐、特别是柠檬酸钠或柠檬酸钾。

本发明中，螯合剂的浓度可在1～40mmol/l的范围内、优选在1～20mmol/l的范围内。

根据一种具体实施方式，第一试剂中的亚铁离子源可以为水溶性的亚铁盐。例如，水溶性的亚铁盐可选自氯化亚铁、硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、草酸亚铁铵、柠檬酸亚铁铵、甘氨酸亚铁和乳酸亚铁中的至少一种，优选为硫酸亚铁铵。第一试剂中的亚铁离子的浓度为8～50μmol/l，优选15～40μmol/l，更优选15～20μmol/l。

本发明的发色试剂没有特别限制，可以是任何常规的用于不饱和铁结合力检测中的发色试剂，例如可为选自红菲绕啉、3-(2-吡啶基)-5,6-双(4-苯磺酸)-1,2,4-三嗪(亚铁嗪)、2-亚硝基-5-[n-n-丙基-n-3-丙磺基氨基]苯(nitroso-psap)、呋喃三嗪二钠盐和三吡啶基三啉中的一种。所述发色试剂优选为2-亚硝基-5-[n-n-丙基-n-3-丙磺基氨基]苯。

所述发色试剂在第二试剂中的浓度同样没有特别限制，只要发色试剂相对于亚铁离子是过量的即可。发色试剂的浓度通常为1～10mmol/l，优选为2～5mmol/l。

用于本发明的还原剂可以是任何用于不饱和铁结合力测试中常用的那些还原剂。例如，所述还原剂可选自巯基乙醇、抗坏血酸、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、盐酸羟胺、硫代硫酸钠、碳酰肼、硫酸肼、亚硝酸钠和二硫苏糖醇中的至少一种，优选盐酸羟胺。

根据一个实施方式，所述还原剂的浓度可为10～500mmol/l，优选20～200mmol/l，更优选50～100mmol/l。

根据一个实施方式，所述第一试剂和/或所述第二试剂还可包括0.1～10g/l、优选1～3g/l的表面活性剂。表面活性剂用于增大各物质的溶解性，并有利于抗脂浊干扰。用于本发明的表面活性剂没有特别限制，只要不干扰反应的表面活性剂均可用于本发明。

根据一种具体实施方式，所述表面活性剂可选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性离子表面活性剂中的至少一种。其中，非离子表面活性剂可列举的有tween系列(如tween20、tween40、tween60、tween80等)、tritonx系列(如tritonx-100、brij35等)。阴离子表面活性剂可列举的有胆酸钠、脱氧胆酸钠等。两性离子表面活性剂可列举的有甜菜碱型两性离子表面活性剂，例如烷基甜菜碱(如十二烷基二甲基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二甲基甜菜碱等)、烷基酰胺甜菜碱(如月桂酰胺基丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、十八酰胺基丙基甜菜碱等)、磺基甜菜碱(如十二烷基磺丙基甜菜碱、十四烷基磺丙基甜菜碱、十八烷基磺丙基甜菜碱、十二烷基二甲基羟丙基磺基甜菜碱、十二烷基磺丙基甜菜碱等)等。本发明中，表面活性剂优选tritonx-100。

根据一个实施方式，所述第一和/或第二试剂还可包括防腐剂。所述防腐剂可列举的有叠氮化钠、proclin系列(proclin150、proclin200、proclin300、proclin950等)、卡松、bnd、硫柳汞等，优选叠氮化钠。所述防腐剂的浓度可以为0.1～10g/l。

根据一个实施方式，本发明的第一和/或第二试剂中还可包括去干扰剂，用于消除血清中铜离子对检测的干扰。所述去干扰剂可为硫脲或氨基硫脲，优选硫脲。所述去干扰剂的浓度可以为10～200mmol/l。

本发明的第二方面提供另一种检测血清中的不饱和铁结合力的试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括ph值为7.5～9.0的缓冲液、铁离子以及能与铁离子螯合的螯合剂，所述第二试剂包括缓冲液、用于将铁离子还原成亚铁离子的还原剂以及能与亚铁离子络合而显色的发色试剂。

按照本发明的第二方面的试剂盒的第一试剂中的铁离子源可以选自水溶性铁盐中的至少一种，例如选自硫酸铁、氯化铁、硫酸铁铵、甘氨酸铁、次氮基三乙酸铁等水溶性盐中的至少一种。

所述第一试剂中的铁离子的浓度为8～50μmol/l，优选15～40μmol/l，更优选15～20μmol/l。

本发明通过在第一试剂中加入一定浓度的既能与亚铁离子和铁离子结合、又不干扰铁离子与转铁蛋白的结合且不干扰亚铁离子与发色试剂的反应的螯合剂，使得未与转铁蛋白或发色试剂结合的铁离子和亚铁离子在碱性条件下呈被螯合的状态，不与氢氧根离子结合生成沉淀，从而铁离子和亚铁离子在碱性条件下更加稳定。此外，如果在自动生化仪的反应杯、试剂针、搅拌杆等部件上残留有亚铁离子和/或铁离子，则残留的亚铁离子和/或铁离子由于与螯合剂结合而更容易被清洗，从而避免产生交叉污染。

按照本发明的第二方面的试剂盒中的缓冲液、螯合剂、还原剂、发色试剂如上按照本发明的第一方面所定义。

按照本发明的第二方面的试剂盒的第一试剂和/或第二试剂也可以包括以上按照本发明的第一方面所说明的表面活性剂、防腐剂、去干扰剂中的至少一种。

根据本发明的第三方面，提供一种检测血清中的不饱和铁结合力的方法，所述方法包括：

在所述血清中加入上文所定义的第一试剂；

在预定的主波长和次波长下检测第一吸光度；

在所述血清中加入上文所定义的第二试剂；

在所述预定的主波长和次波长下检测第二吸光度；和

根据所述第一吸光度和所述第二吸光度计算血清中的不饱和铁结合力。

具体地，所述第一和第二试剂如上文第一方面及第二方面中所定义。

血清中的不饱和铁结合力的计算方法为本领域的常规方法，在此不再赘述。

所述预定的主波长可以为570或740nm。优选地，所述预定的主波长为740nm。由于胆红素的特征吸收峰在430-470nm，血红蛋白的特征吸收峰在414nm、540nm、576nm处，因此当选择主波长为740nm时，离胆红素的特征吸收峰更远，从而胆红素的干扰更小，同时可避开血红蛋白的吸收峰而降低其干扰。此外，内源性酯没有特异的吸收峰，其光吸收是内源性酯本身乳浊液的光散射造成的，主波长选取的越小光被散射的越严重，干扰越严重；反之，主波长越大，光散射越小，干扰越小。而且抗坏血酸只在紫外区264nm处有吸收，在血清基质中该吸收峰被血清中的蛋白质的吸收峰掩盖，因此选取740nm的主波长同样能够降低抗坏血酸(如果存在的话)的干扰。

此外，所述预定的副波长可以为605nm或700nm。

按照本发明的检测血清中的不饱和铁结合力的试剂盒和方法能够使亚铁离子和/或铁离子在碱性条件下更加稳定，并且能够在很大程度上避免在检测设备中产生交叉污染。

附图说明

图1是实施例2中柠檬酸钠浓度为20mmol/l时，检测体系的吸光度随时间变化的曲线图；

图2是实施例2中柠檬酸钠浓度为55mmol/l时，检测体系的吸光度随时间变化的曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式及附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

实施例1采用不同螯合剂减少交叉污染

按照以下配方分别制备四种根据本发明的检测试剂盒a、b、c、d，其中：

检测试剂盒a

第一试剂r1：

第二试剂r2：

检测试剂盒b

第一试剂r1：

第二试剂r2：

磷酸缓冲液(ph8.5)0.3mol/l

nitroso-psap1.8mmol/l

叠氮化钠0.2g/l

检测试剂盒c

第一试剂r1：

第二试剂r2：

tris缓冲液(ph8.3)0.5mol/l

nitroso-psap2mmol/l

叠氮化钠0.2g/l

检测试剂盒d

第一试剂r1：

第二试剂r2：

tris缓冲液(ph8.3)0.5mol/l

nitroso-psap2mmol/l

bnd0.2g/l

此外，按照以下配方制备用于与本发明进行对比的对比检测试剂盒，其中：

第一试剂r1：

第二试剂r2：

按照两点终点法在自动生化仪(例如迈瑞bs800生化分析仪)上对同一血液样本分别用实施例1的各个检测试剂盒a、b、c、d和对比检测试剂盒进行不饱和铁结合力测定。检测条件为：温度37℃，第一试剂r1:第二试剂r2:样本的混合体积比为200:100:20，测定主波长为740nm，副波长为605nm。在第一试剂r1加入样本或校准品后37℃孵育4分钟后，记录吸光度a1，然后加入第二试剂r2继续孵育5分钟后记录吸光度值a2。不饱和铁结合力(uibc)的浓度的计算公式如下：

δa样本＝[(a2－a1)样本管]－[(a2－a1)空白管]

δa校准＝[(a2－a1)校准品管]－[(a2－a1)空白管]

uibc浓度＝(δa样本/δa校准)×校准品浓度

每种试剂盒在自动生化仪上进行两整圈的检测，其中一整圈的检测是指使全部反应杯进行一次检测。迈瑞bs800生化分析仪共有165个反应杯，因而一整圈的检测是指相同来源的样本(可将足量的血清样本混匀之后使用)在所有反应杯中用同一试剂盒分别检测一次，一共进行165次检测。而两整圈的检测是指相同来源的样本在所有反应杯中用同一种试剂盒前后各检测一次，一共330次检测。测试两整圈的目的是第一圈测试会占用所有的反应杯，如果在第一圈测试中在生化分析仪中有亚铁离子残留则会对第二圈测试造成交叉污染，根据不饱和铁结合力的测试原理会影响第二圈的测试结果，亚铁离子的残留可能会导致第二圈的测试结果较第一圈的偏低。记录各次测定得到的不饱和铁结合力值，并计算第一整圈和第二整圈测定的平均结果以及第二整圈平均结果相对于第一整圈平均结果的绝对偏差和相对偏差，结果如表1。

表1采用不同螯合剂的检测结果

由表1可见，不加螯合剂时，生化分析仪系统内(反应杯、试剂针、搅拌杆)残留的fe²⁺会使得测得的结果偏低，而按照本发明的加入了螯合剂的不饱和铁结合力检测试剂盒能够显著减少生化分析仪系统内的交叉污染。

实施例2：采用柠檬酸钠作为螯合剂

按照以下配方制备根据本发明的包含不同浓度的柠檬酸钠的检测试剂盒，其中：

第一试剂r1：

第二试剂r2：

tris缓冲液(ph8.3)0.5mol/l

nitroso-psap2mmol/l

bnd0.1g/l

采用与实施例1相同的方法对与实施例1相同的血液样本分别用实施例2的试剂盒进行不饱和铁结合力测定。同样每种试剂盒均进行两整圈的测定，记录各次测定得到的不饱和铁结合力值，并计算第一整圈和第二整圈测定的平均结果以及第二整圈平均结果相对于第一整圈平均结果的绝对偏差和相对偏差，结果如表2。

表2采用不同浓度的柠檬酸钠的检测结果

由表2可知，在试剂盒中加入浓度为约1mmol/l至约50mmol/l的柠檬酸钠能够显著降低、甚至消除交叉污染。当加入的柠檬酸钠达到一定的浓度、例如约20mmol/l时，随着柠檬酸钠的浓度增加，其消除交叉污染的能力变化不大，因此加入浓度约1mmol/l至约20mmol/l的柠檬酸钠能够在保证良好的消除交叉污染的能力的情况下减少试剂盒成本。

当所加的螯合剂浓度较低时，在生化分析仪系统内(反应杯、试剂针、搅拌杆)仍然会残留fe²⁺，使得测得的结果偏低，当螯合剂浓度达到一定值时能够将系统内残留的fe²⁺螯合住并通过生化分析仪的清洗系统清洗掉，表现出较好的防止交叉污染的能力，同时也不会影响反应平衡，如图1。然而当螯合剂浓度超过一定浓度时，随着螯合剂浓度的增加，螯合剂螯合fe²⁺的能力也在增加，虽然能够表现出较好的消除交叉污染的能力，但这致使发色剂与螯合剂在结合fe²⁺时产生的竞争关系更大，从而表现出在一定时间内不能使得反应达到平衡，即fe²⁺没有反应完全，如图2。在该实施例中，柠檬酸钠的浓度不宜超过55mmol/l。

实施例3：采用不同浓度的酒石酸钾钠

按照以下配方制备根据本发明的包含不同浓度的酒石酸钾钠的检测试剂盒，其中：

第一试剂r1：

第二试剂r2：

tris缓冲液(ph8.3)0.5mol/l

nitroso-psap2mmol/l

bnd0.1g/l

采用与实施例1相同的方法对与实施例1相同的血液样本分别用实施例3的试剂盒进行不饱和铁结合力测定。同样每种试剂盒均进行两整圈的测定，记录各次测定得到的不饱和铁结合力值，并计算第一整圈和第二整圈测定的平均结果以及第二整圈平均结果相对于第一整圈平均结果的绝对偏差和相对偏差，结果如表3。

表3采用不同浓度的酒石酸钾钠的检测结果

由表3可知，在试剂盒中加入浓度为约1mmol/l至约40mmol/l的酒石酸钾钠能够显著减少交叉污染。当加入的酒石酸钾钠达到一定的浓度、例如约20mmol/l时，随着酒石酸钾钠的浓度增加，其消除交叉污染的能力变化不大，因此加入浓度约1mmol/l至约20mmol/l的酒石酸钾钠能够在保证良好的消除交叉污染的能力的情况下减少试剂盒成本。在该实施例中，酒石酸钾钠的浓度不宜超过45mmol/l。

实施例4：采用柠檬酸作为螯合剂

按照以下配方制备根据本发明的包含不同浓度的柠檬酸的检测试剂盒，其中：

第一试剂r1：

第二试剂r2：

tris缓冲液(ph8.3)0.5mol/l

nitroso-psap2mmol/l

bnd0.1g/l

采用与实施例1相同的方法对与实施例1相同的血液样本分别用实施例4的试剂盒进行不饱和铁结合力测定。同样每种试剂盒均进行两整圈的测定，记录各次测定得到的不饱和铁结合力值，并计算第一整圈和第二整圈测定的平均结果以及第二整圈平均结果相对于第一整圈平均结果的绝对偏差和相对偏差，结果如表4。

表4采用不同浓度的柠檬酸的检测结果

由表4可知，在试剂盒中加入浓度为约1mmol/l至约50mmol/l的柠檬酸能够显著降低、甚至消除交叉污染。当加入的柠檬酸达到一定的浓度、例如约20mmol/l时，随着柠檬酸的浓度增加，其消除交叉污染的能力变化不大，因此加入浓度约1mmol/l至约20mmol/l的柠檬酸能够在保证良好的消除交叉污染的能力的情况下减少试剂盒成本。在该实施例中，柠檬酸的浓度也不宜超过55mmol/l。

实施例5：采用柠檬酸钾作为螯合剂

按照以下配方制备根据本发明的包含不同浓度的柠檬酸钾的检测试剂盒，其中：

第一试剂r1：

第二试剂r2：

tris缓冲液(ph8.3)0.5mol/l

nitroso-psap2mmol/l

bnd0.1g/l

采用与实施例1相同的方法对与实施例1相同的血液样本分别用实施例5的试剂盒进行不饱和铁结合力测定。同样每种试剂盒均进行两整圈的测定，记录各次测定得到的不饱和铁结合力值，并计算第一整圈和第二整圈测定的平均结果以及第二整圈平均结果相对于第一整圈平均结果的绝对偏差和相对偏差，结果如表5。

表5采用不同浓度的柠檬酸钾的检测结果

由表5可知，在试剂盒中加入浓度为约1mmol/l至约50mmol/l的柠檬酸钾能够显著降低、甚至消除交叉污染。当加入的柠檬酸钾达到一定的浓度、例如约20mmol/l时，随着柠檬酸钾的浓度增加，其消除交叉污染的能力变化不大，因此加入浓度约1mmol/l至约20mmol/l的柠檬酸钾能够在保证良好的消除交叉污染的能力的情况下减少试剂盒成本。在该实施例中，柠檬酸钾的浓度同样不宜超过55mmol/l。

实施例6采用铁离子检测不饱和铁结合力

按照以下配方制备根据本发明的采用铁离子的检测试剂盒，其中：

第一试剂r1：

第二试剂r2：

采用与实施例1相同的方法对与实施例1相同的血液样本分别用实施例6的试剂盒进行不饱和铁结合力测定。同样每种试剂盒均进行两整圈的测定，记录各次测定得到的不饱和铁结合力值，并计算第一整圈和第二整圈测定的平均结果以及第二整圈平均结果相对于第一整圈平均结果的绝对偏差和相对偏差，结果如表6。

表6采用铁离子的检测结果

由表6可知，在采用铁离子检测不饱和铁结合力的试剂盒中加入螯合剂同样能够显著降低交叉污染。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。