一种病原微生物快速检测方法与流程

本发明涉及一种病原微生物快速检测方法，具体涉及一种基于双功能au@超薄pt纳米材料和免疫磁珠的病原微生物快速、无标记拉曼检测方法。

背景技术：

背景技术

食品安全是公共卫生的重要事项，其中的食源性疾病更是一个严重的全球化问题。它不仅严重影响人们的生命健康、而且影响全球经济的发展。据美国疾病控制与预防中心(cdc)估计每年约有六分之一的美国人因食用被污染的食物或水源而患病，且其中有3000人因此而死亡，至此造成的经济损失高达156亿元。病原微生物作为引发食源性疾病的重要因素，已经引起社会各界的广泛重视，主要包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌等。其中，沙门氏菌是世界上最常见的食物中毒原因之一。全球每年有超过1亿人感染沙门氏菌，其中大多数人会在短期内自行恢复，但也有大约15.5万人会死亡。该微生物导致的疾病轻则上吐下泻肠胃炎，重则败血症、伤寒。我国的细菌性食物中毒有70％-80％也是沙门氏菌引起，其中抵抗力低下的人群，老年、婴幼儿尤其容易中招。

传统沙门氏菌等病原微生物的检测方法为琼脂培养法，其主要是依据病原微生物的形态特征和生理性状，进行分离、培养及一系列生化反应，整个过程通常需要两到三天，需要专业的操作人员且程序繁琐。这对货架寿命较短的食品在产品卫生状况方面的评估作用不大，难以满足食品生产厂家特别是出口厂家的检测期较短的需求。近年来，不断发展的pcr技术、酶联免疫技术、放射免疫技术等方法已逐步应用于沙门氏菌等病原微生物的快速检测。尽管这些方法可以提供灵敏的微生物定性、定量数据，然而它们当中有些耗时太长、操作复杂；有些仪器昂贵、需要专业的操作人员，且存在一定的假阳性；有些灵敏度不够高，均难以满足当前病原微生物现场快速检测的迫切需求。因此，发展一种简单、快速、廉价、高灵敏的病原微生物检测方法，对有效预防和控制食源性疾病的暴发，减轻病原微生物对人类造成的危害意义重大。

技术实现要素：

针对现有检测技术中存在的问题，本发明提供了一种病原微生物快速检测方法，该方法基于双功能au@超薄pt纳米材料和免疫磁珠对病原微生物含量进行快速、无标记拉曼检测，其传感器构建过程和检测过程均不需要大型仪器，操作简单、快速，灵敏度高。

本发明的目的是通过以下的技术方案实现的：

一种病原微生物快速检测的方法，具体包括如下步骤：

s1、在au@超薄pt纳米材料表面通过静电吸附作用修饰上待测病原微生物抗体,所得产物记为无标记sers检测探针；

s2、筛选获得磁学性能优良、同时具有一定模拟酶活性的羧基化磁珠，在所述羧基化磁珠表面，通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)活化偶联的方式修饰上s2中所述的待测病原微生物抗体，所得产物记为免疫磁珠捕获探针；

s3、将s2所述捕获探针与一系列已知浓度的病原微生物样品于室温(25-37℃)下孵育30min，磁分离洗涤，重悬，再加入s2所述检测探针于室温下孵育30min，磁分离洗涤，将获得的夹心结构产物重悬处理；

s4、将s3所得产物在酸性条件下与3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)、h2o2混合，构成催化反应体系，反应1-2min后，取部分混合液滴至锡箔纸上进行拉曼测试，以病原微生物浓度的对数为横坐标，以对应的1608cm^-1处tmb催化氧化产物的拉曼峰的强度变化值为纵坐标，绘制定量分析标准工作曲线；

s5、将待测未知浓度病原微生物样品依次与捕获探针和检测探针孵育后，所得产物在酸性条件下与tmb、h2o2混合，检测混合液在1608cm^-1处拉曼峰的强度变化值，根据定量分析标准工作曲线计算出样品待测病原微生物的浓度。

优选地，所述检测探针制备方法为：将au@超薄pt纳米材料加入磷酸盐缓冲液(pb)溶液中，然后再加入病原微生物抗体，混匀后，室温静置或温和振荡30-60min；然后再加入聚乙二醇溶液，混匀；室温静置20-30min后，离心处理，重悬。

优选地，所述au@超薄pt纳米材料同时具有拉曼活性和模拟酶催化活性，其呈规则球形，粒径均一，直径为30-80nm。且其制备方法为：采用晶种增长法合成纳米金，然后通过蠕动泵缓慢加样的方式，在纳米金表面包裹上铂层。

优选地，所述捕获探针的制备方法为：在羧基化磁珠中加入edc溶液，快速振荡10-30min，继续加入病原微生物抗体，快速振荡2-4h，然后加入牛血清白蛋白溶液(bsa)，快速振荡30-60min，离心洗涤，将获得的捕获探针重悬，冰箱4℃保存备用。

优选地，所述羧基化磁珠粒径为100-400nm。

优选地，所述病原微生物为沙门氏菌。

优选地，所述重悬溶液和洗涤溶液均为0.01m磷酸盐缓冲液(pb)。

优选地，s4所述催化反应体系为10μlbritton-robinson缓冲溶液(br)、20μl夹心产物、4.0μl5mmtmb、1.0μl2mh2o2。

更加优选地，所述构成催化反应体系的br初始ph为4.0-5.0。

优选地，拉曼测试采用便携式拉曼光谱仪，测试条件为：激光波长为785nm，曝光时间为20s，平均测量3-5次。

本发明的有益效果体现在以下几个方面：

(1)本发明提供的au@超薄pt纳米材料其胶体稳定性很好、粒径均一，整体呈规则球形，其中铂以均匀超薄壳层包裹在au表面，该材料既保持了纳米金的拉曼增强活性，而且具有铂材料优良的模拟酶催化活性。

(2)将au@超薄pt纳米材料与免疫磁珠结合起来，利用超薄pt层与磁珠对tmb的原位协同催化作用，构建一种可以现场快速、高灵敏检测病原微生物的新型无标记拉曼平台，其最低可检测到的病原微生物浓度低至10cfu/ml。

(3)本发明中使用的双功能au@超薄pt纳米材料，不仅性能优于常见的双功能au@小粒径pt纳米材料，而且其均匀的球形结构方便抗体的直接静电吸附修饰。

(4)tmb被催化后氧化产物在au@超薄pt纳米材料的拉曼增强下，其特征峰明显增强可直接用于定量检测，因而传感器的构建过程中无需进行拉曼信号分子修饰，这不仅简化了检测探针的制备过程、同时间接提高了检测探针的稳定性。

(5)au@超薄pt纳米材料中超薄pt层与磁珠优良的模拟酶活性，使之不仅可以取代天然酶的使用，而且可以降低传感器的构建成本。

(6)本发明中磁珠优良的分离富集能力，不仅简化了病原微生物的检测过程，而且有利于复杂样本中病原微生物的分离与提取，间接提高了方法的选择性。

(7)本发明中提供的检测方法在使用过程中不需要依赖大型仪器以及专业的操作人员，可广泛用于资源匮乏的农村以及发展中国家的现场定量检测。

附图说明

图1为纳米金和au@超薄pt纳米材料的tem和eds表征图；其中(a)和(c)分别为纳米金的tem和eds图，(b)和(d)分别为au@超薄pt纳米材料的tem和eds图。

图2为au@超薄pt纳米材料的拉曼测试图；其中(a)为au@超薄pt纳米材料与甲酚紫混合后的拉曼测试图；(b)为au@超薄pt纳米材料催化tmb后的拉曼测试图。

图3为沙门氏菌检测示意图。

图4为检测沙门氏菌的灵敏度实验图(a)和相应的标准工作曲线(b)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明做进一步的描述，但并不是限制本发明的范围，仅作示例说明。

实施例1：

本发明是基于双功能au@超薄pt纳米材料和免疫磁珠对病原微生物含量进行快速、无标记拉曼检测的。所述的au@超薄pt纳米材料的制备方法具体包括以下步骤：

(1)晶种的合成：将2.5mlhaucl4·3h2o(0.2％w/v)溶液稀释至50ml，加入150ml烧瓶中；剧烈搅拌，加热至沸腾后，快速加入2ml柠檬酸钠-柠檬酸混合溶液(其w/v分别为1％和0.05％)。继续加热搅拌5min，冷却至室温备用。

(2)第一步增长：取3ml步骤(1)合成的晶种稀释至20ml加入100ml烧瓶中，室温下剧烈搅拌，将a液和b液采用蠕动泵同时缓慢加入烧瓶中(蠕动泵参数设置为2.5-3)；待溶液加完后，在油浴条件下加热至沸腾，继续搅拌30min，最后冷却至室温。其中a液：2mlhaucl4·3h2o(0.2％w/v)溶液用水稀释至10ml；b液：0.5ml抗坏血酸和0.25ml柠檬酸钠(其w/v均为1％)混合用水稀释至10ml。

(3)纳米金的合成：取4.5ml步骤(2)合成的溶液稀释至20ml，室温下剧烈搅拌，将a液和b液分别同时缓慢加入烧瓶中(蠕动泵参数设置为2.5～3)；待溶液加完后，在油浴中加热至沸腾，继续搅拌30min，最后冷却至室温备用。a液：1mlhaucl4·3h2o(0.2％w/v)溶液用水稀释至10ml；b液：0.5ml抗坏血酸和0.25ml柠檬酸钠(其w/v均为1％)混合用水稀释至10ml。

(4)au@超薄pt纳米材料的合成：将8ml步骤(3)合成的纳米金加入50ml圆底烧瓶中，搅拌，油浴加热至80～90℃。恒定10min后，用蠕动泵将a液和b液分别同时缓慢加入烧瓶中(蠕动泵参数设置为0.6)。待溶液加完后，继续加热搅拌30min，冷却至室温即可获得au@超薄pt纳米材料。其中a液：5μl38.5mmh2ptcl6溶液稀释至4ml超纯水中；b液：4ml含4.0mm抗坏血酸和1％柠檬酸钠的溶液。

首先，对所合成的纳米金以及au@超薄pt纳米材料进行tem表征和eds表征，结果见图1。从中可以看出，纳米金为球形，粒径约为40nm。相对于纳米金，au@超薄pt纳米材料仍为规则球形，且粒径均一、分散性良好，超薄pt层已成功包裹在au表面。然后，对合成的该au@超薄pt纳米材料进行了拉曼活性和催化活性表征。图2a为200μlau@超薄pt纳米材料与10μl0.1mm甲酚紫溶液混合约5min后的拉曼表征图。从中可以看到混合物在591cm^-1处有很强的甲酚紫特征峰，表明au@超薄pt纳米材料具有良好的拉曼增强活性。图2b为125μlbr(ph4.0)、20μlau@超薄pt纳米材料、50μl5mmtmb与5μl2.0mh2o2室温混合2min后的拉曼测试图。从中可以看到催化反应后，产物在1187cm^-1、1334cm^-1、1608cm^-1处有很强的tmb氧化产物特征拉曼峰，表明合成的au@超薄pt纳米材料具有良好的拉曼增强活性和催化活性。

实施例2：

以沙门氏菌为例，本实施例提供了一种沙门氏菌快速检测方法的构建过程。

(1)将1ml实施例1合成的au@超薄pt纳米材料加入1ml0.01mpb(ph7.4)中，然后再加入1μl20μg/ml沙门氏菌抗体，混匀后，室温温和振荡30min；然后再加入500μl1％peg水溶液，混匀；静置20min后，离心处理，最后将获得的的产物——检测探针重悬到250μlpb中。

(2)200μl羧基化磁珠中加入80μl4mg/mledc溶液，37℃快速振荡10min；接着，继续加入10μl2mg/ml沙门氏菌抗体溶液，37℃快速振荡2h；然后，继续加入20μl5mg/mlbsa溶液，37℃快速振荡30min；最后，用0.01mpb(ph7.4)溶液洗涤两次，将获得的产物——捕获探针重悬到100μl0.01mpb中，冰箱4℃保存备用。

(3)45μl0.01mpb(ph7.4)中依次加入10μl步骤(2)获得的捕获探针和5μl不同浓度的沙门氏菌溶液(10，50，10²，500，10³，10⁴cfu/ml)，室温快速振荡30min，磁场分离洗涤2次，最后重悬到60μlpb中。

(4)在步骤(3)所得产物中加入100μl检测探针，37℃快速振荡30min，磁场分离洗涤2次，最后将获得的夹心产物重悬到60μlpb中。

(5)10μlbr(ph4.0)溶液中依次加入20μl夹心产物、4.0μl5mmtmb、1.0μl2mh2o2，混匀约2min后，取10μl混合液至锡箔纸上进行拉曼测试。测试条件：激光波长785nm，曝光时间20s，平均测量3次。记录tmb氧化产物在1608cm^-1处拉曼峰的强度变化值。

由于检测探针和捕获探针上抗体与待测病原微生物的作用，因此形成三明治的夹心结构，其示意图如图3所示。检测不同浓度沙门氏菌的拉曼测试图见图4a。从中可以看出，随着沙门氏菌浓度的增加，tmb氧化产物在1608cm^-1处拉曼峰的强度逐渐增大，且当其浓度低至10cfu/ml时，响应仍明显，表明该方法检测限可低至10cfu/ml。以沙门氏菌浓度的对数为横坐标，tmb氧化产物在1608cm^-1处拉曼峰的强度变化值为纵坐标，获得了如图4b所示的标准工作曲线。曲线方程为y＝1920.13x-2360.96，r²为0.987。检测沙门氏菌的线性范围为50-10000cfu/ml。

实施例3：沙门氏菌模拟样本的测试

首先，将超市购买回来的常温牛奶(3000rpm，5min)离心处理，除去不纯物。然后将其用pb溶液稀释10倍处理。往其中分别加入500和1000cfu/ml的沙门氏菌标准溶液，充分混匀后进行实施例2所示的沙门氏菌检测。通过测量其在1608cm^-1处拉曼峰强的变化值，根据实施例2获得的工作曲线，得知模拟样本中沙门氏菌的浓度，进而得知两份样本的回收率均在95％-105％之间。表明本发明建立的方法可以用于实际样本中沙门氏菌的快速、高灵敏检测。

上述实施例只是对本发明的解释，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。