一种碳酸钙D3咀嚼片的有关物质检测方法与流程

本发明涉及药物分析技术的
技术领域：
，特别是一种碳酸钙d3咀嚼片的有关物质检测方法的
技术领域：
。全文所述的碳酸钙d3咀嚼片，国家标准的名称为碳酸钙d3咀嚼片(ⅱ)。
背景技术：
：碳酸钙d3咀嚼片是一种复方制剂，本品含维生素d3(c27h44o)应为标示量的90.0％～120.0％；含碳酸钙(caco3)应为标示量的95.0％～105.0％。钙是维持人体神经、肌肉、骨骼系统、细胞膜和毛细血管通透性正常功能所必需的物质。维生素d能参与钙和磷的代谢，促进其吸收并对骨质形成有重要作用，碳酸钙d3咀嚼片是一种含钙与维生素d的复方制剂，用于妊娠和哺乳期妇女、更年期妇女、老年人和儿童等的钙补充剂，并帮助防治骨质疏松症。在目前我国居民的膳食条件下，单靠食物往往难以满足人体对钙和维生素d的需要。随着人们补钙意识的提高，国内对补钙产品的需求量很大。维生素d3不稳定，中国药典标准中规定维生素d3原料药需要遮光、充氮、密封，于冷处保存。维生素d3遇光或空气均易变质产生有关物质，主要是其光热转化的异构体，包括前维生素d3、反式维生素d3和速甾醇d3，它们的转化途径如图4所示，即维生素d3受热产生前维生素d3、见光产生反式维生素d3，前维生素d3受光产生速甾醇d3，由于前维生素d3属于有效成分，因此主要有关物质是反式维生素d3和速甾醇d3。然而目前全世界范围内所售的含碳酸钙和维生素d3的补钙制剂，均欠缺对维生素的有关物质控制。目前，尚未检索到“碳酸钙和维生素d3的补钙制剂”中维生素d3的有关物质的测定方法。国内外均暂未对“碳酸钙和维生素d3的补钙制剂”中维生素d3的有关物质进行控制。为了把好药品质量关，保证产品质量，保证人民群众用药安全。需要对碳酸钙d3咀嚼片中维生素d3的有关物质进行有效的控制。因此，研究一种碳酸钙d3咀嚼片中维生素d3的有关物质hplc测定方法，这对医药生产企业来说显得尤为迫切。技术实现要素：本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种碳酸钙d3咀嚼片的有关物质检测方法，可操作性强、准确度高，可以控制极微量维生素d3制剂的关键有关物质。为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：一种碳酸钙d3咀嚼片的有关物质检测方法，包括如下步骤：a)制备供试品溶液：避光操作，取相当于含有维生素d330μg的碳酸钙d3咀嚼片研细的颗粒，置棕色量瓶中，加入20～100ml的浓度为0.2mg/ml的2,6-二叔丁基对甲酚的二甲基亚砜与水的混合溶液，所述二甲基亚砜与水的混合溶液中二甲基亚砜：水的体积比为10:2，接着，超声振荡，并时时摇动，精密加质量分数为0.02％的2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液5～25ml，振摇后，进行离心，精密量取上层清液0.5～10ml，用氮气吹干，残渣加质量分数为0.02％的2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液0.5～2ml使溶解，作为供试品溶液；b)制备对照溶液:精密量取供试品溶液100μl，置10ml量瓶中，加质量分数为0.02％的2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；c)制备对照品溶液：另精密称取反式维生素d3对照品，用正己烷溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1μg的溶液，作为对照品溶液；d)液相色谱检测：精密量取供试品溶液、对照溶液与对照品溶液各200μl，分别注入液相色谱仪，记录至主成分峰保留时间的1.5倍，供试品溶液色谱图中，如有与反式维生素d3峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过1.0％，如有与速甾醇d3峰保留时间一致的色谱峰，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1.0％，所述速甾醇d3峰与维生素d3相对保留时间约为1.1。作为优选，步骤a)中所述超声振荡的时间为5～30min，并保持超声水浴温度不超过30℃，所述振摇时间为5～30min，所述离心时间为10～30min，离心的转速为4000～12000rpm。作为优选，检测条件包括如下：①色谱柱的固定相为硅胶，硅胶柱的粒径为5μm，柱长为150～250mm，内径为4.6mm；②流动相由体积比为2.5～3.5:996.5～997.5的正戊醇和正己烷组成的混合液；③流速为1.0～2.5ml/min；④检测波长为254nm；⑤进样体积为50～250μl。上述中所述的碳酸钙d3咀嚼片，国家标准的名称为碳酸钙d3咀嚼片(ⅱ)。本发明的有益效果：本发明通过大量实验后优选出最佳的分析条件和供试品溶液制备方法。经多次实验验证表明，本发明提供的碳酸钙d3咀嚼片中维生素d3的有关物质hplc测定方法稳定性和重复性好、分离度好，可以准确的定性、定量检测碳酸钙d3咀嚼片中维生素d3的主要有关物质，从而客观、全面、准确的评价碳酸钙d3咀嚼片的质量，对产品质量的控制和保证临床疗效具有重要的现实意义。本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。【附图说明】图1是杂质对照品混合溶液hplc图；图2是缺维生素d3的阴性空白溶液hplc图；图3是碳酸钙d3咀嚼片供试品溶液hplc图；图4是维生素d3和其异构体的转化途径图；图5是维生素d3线性图；图6是速甾醇d3线性图。图1中，1-前维生素d3；2-反式维生素d3；3-异速甾醇d3；4-维生素d3；5-速甾醇d3和6-维生素d3原。【具体实施方式】为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特殊说明均能从公开商业途径获得。一、具体实施方式：仪器采用日本岛津lc-10mavp高效液相色谱仪；日本岛津auw220d电子分析天平。材料为本公司固体车间生产的碳酸钙d3咀嚼片。维生素d3对照品购自中国食品药品检定研究院，批号为100061-201208。正己烷为色谱纯。其他试剂为分析纯。1、杂质对照品混合溶液配制：分别取维生素d3、前维生素d3、反式维生素d3、速甾醇d3、异速甾醇d3和维生素d3原对照品，用正己烷制成杂质对照品混合溶液。2、供试品溶液制备：避光操作，取相当于含有维生素d330μg的碳酸钙d3咀嚼片研细的颗粒，置200ml棕色量瓶中，加入50ml的浓度为0.2mg/ml的2,6-二叔丁基对甲酚的二甲基亚砜与水的混合溶液，所述二甲基亚砜与水的混合溶液中二甲基亚砜：水的体积比为10:2，接着，超声振荡15min，并时时振摇，保持超声水浴温度不超过30℃，精密加质量分数为0.02％的2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液10ml，振摇15min后，以8000转/分钟的转速离心15min，精密量取上层清液2ml，用氮气吹干，残渣加质量分数为0.02％的2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液1ml使溶解，作为供试品溶液。3、缺维生素d3的阴性空白溶液制备：取按处方比例混合的缺维生素d3的空白辅料，重量与含有维生素d330μg的碳酸钙d3颗粒中的辅料相同，约32.4g，置200ml棕色量瓶中，加入50ml的浓度为0.2mg/ml的2,6-二叔丁基对甲酚的二甲基亚砜与水的混合溶液，所述二甲基亚砜与水的混合溶液中二甲基亚砜：水的体积比为10:2，接着，超声振荡15min，并时时振摇，保持超声水浴温度不超过30℃，精密加质量分数为0.02％的2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液10ml，振摇15min后，以8000转/分钟的转速离心15min，精密量取上层清液2ml，用氮气吹干，残渣加质量分数为0.02％的2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液1ml使溶解，作为缺维生素d3的阴性空白溶液。按照如下方法记录色谱图，检测条件如下所示：色谱柱：硅胶柱inertsilsil100a5μm,250×4.6mm；流动相由体积比为3:997的正戊醇和正己烷组成的混合液；流速为2ml/min；检测波长为254nm；进样体积为200μl。杂质对照品混合溶液色谱图中，出峰顺序依次为前维生素d3、反式维生素d3、异速甾醇d3、维生素d3、速甾醇d3和维生素d3原，对照品混合溶液色谱图中维生素d3峰与前后峰的分离度均大于2.0，各杂质峰与相邻峰的分离度均大于1.0。已知杂质均在前维生素d3峰后出峰。缺维生素d3的阴性空白溶液色谱图结果表明空白辅料对有关物质其他杂质测定有干扰，但对反式维生素d3与速甾醇d3测定无干扰。本品每片约1.62g，含维生素d3仅1.5μg(1.5ppm)，辅料多，维生素d3含量非常低，为了满足有关物质检查的灵敏度要求，需要称取大量供试品，而片剂中含有大量辅料约占总量的54％，供试品制备需提取浓缩进行测定。提取浓缩过程中容易将辅料中的杂质富集，经反复试验均表明无有效方法、手段去除辅料出峰影响。故有关物质方法规定：供试品溶液色谱图中，如有与反式维生素d3峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过1.0％；如有与速甾醇d3峰保留时间一致的色谱峰，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1.0％，所述速甾醇d3峰与维生素d3相对保留时间约为1.1。验证试验结果表明方法合理、可控。二、供试品溶液配制方法的准确度试验：为验证本方法萃取维生素d3的效果，用回收率来验证萃取效率。照处方量在空白辅料中加入已知量的维生素d3粉。所述的维生素d3粉是原料药维生素d3粉包合物，不是维生素d3对照品，按供试品溶液配制方法配制成供试品溶液，结果用回收率表示。表1供试品溶液配制方法的准确度试验结果注：加入量＝称样量×0.257％，0.257％为维生素d3粉中维生素d3的含量；回收率＝测得量/加入量×100％。本品处方量中维生素d3粉仅占0.04％，按“药品质量标准分析方法验证指导原则”(中国药典2015年版四部通则9101)准确度项下要求，回收率限度为90％～108％。结果表明，100％浓度回收率重复6次均在92％～100％范围内，符合回收率限度要求，平均回收率94.4％，rsd为2.83％，说明用0.02％2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液10ml可以把维生素d3从提取溶液中完全萃取出来。三、反式维生素d3回收率：反式维生素d3回收率试验按照标准限度的50％、100％、150％进行：精密称取反式维生素d3对照品10.28mg，置50ml量瓶中，加正己烷使溶解并稀释至刻度，为反式维生素d3对照品母液。取对照品母液用乙醇稀释至含反式维生素d3为0.163μg/ml的溶液，为回收率对照品储备液。缺维生素d3的空白辅料32.4g，置200ml棕色量瓶中，分别精密加入回收率对照品储备液1ml、2ml、3ml(50％、100％、150％)，按供试品溶液配制方法配制成回收率供试品溶液。回收率各浓度各平行制备3份。精密称取反式维生素d3对照品加正己烷溶解并稀释制成反式维生素d3浓度约0.1μg/ml的溶液，为反式维生素d3对照品溶液。分别精密量取为反式维生素d3对照品溶液与上述供试品溶液各200μl测定，计算回收率并计算rsd值。表2反式维生素d3回收率试验结果注：回收率＝测得量/加入量×100％。结果表明，各浓度回收率均在93.5～107.5％之间，平均回收率为101.6％，rsd为4.5％，说明本方法准确度良好。四、反式维生素d3线性关系考察：精密称取反式维生素d3对照品加正己烷稀释制成含反式维生素d30.163μg/ml的溶液，摇匀，作为线性贮备液。精密量取线性贮备液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、8ml，分别置10ml量瓶中；用正己烷稀释至刻度，摇匀，制成不同浓度的线性溶液，作为供试品溶液。分别测定。如图5所示，以反式维生素d3浓度c为横坐标，峰面积a为纵坐标，得线性回归方程：a＝198644c-212.11，r2＝0.9999。结果表明，反式维生素d3浓度在0.016μg/ml～0.130μg/ml范围内，线性关系良好。五、速甾醇d3线性范围考察：精密称取速甾醇d3对照品加正己烷稀释制成含速甾醇d3为0.170μg/ml的溶液，摇匀，作为线性贮备液。精密量取线性贮备液2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml，分别置10ml量瓶中；用正己烷稀释至刻度，摇匀，制成不同浓度的线性溶液，作为供试品溶液。分别测定。如图6所示，以速甾醇d3浓度c为横坐标，峰面积a为纵坐标，得线性回归方程：a＝200102c-3842.2，r2＝0.9998。结果表明，速甾醇d3浓度在0.034μg/ml～0.119μg/ml范围内，线性关系良好。六、专属性试验：表3强制降解试验的破坏条件表4破坏试验主要降解物变化列表从表中可以看出，经强酸、强碱、氧化、高温、光照试验，维生素d3降解途径如下：(1)光照条件下，反式维生素d3明显增加，原料药维生素d3粉中检出速甾醇d3；(2)高温条件下，前维生素d3显著增加；(3)氧化、强酸、强碱条件下，维生素d3相对稳定。强制降解试验表明，本品的主要降解产物为前维生素d3、反式维生素d3和速甾醇d3；前维生素d3为有效成分，根据本品特性，所以本品的质量标准中主要控制已知杂质反式维生素d3和速甾醇d3。本品在有关物质检查和含量测定的样品处理过程中，加入抗氧剂2,6-二叔丁基对甲酚、避光、不高于30℃低温处理，尽可能的保护了维生素d3降解，处理方法合理。本品在生产过程中，也应尽量避光，低温操作。本品的储藏条件应密封、避光、低温。七、维生素d3检测限、定量限：精密称取维生素d3对照品适量，用异辛烷溶解，加正己烷逐级稀释制成测试溶液。结果表明：按信噪比3∶1为最低检测限，进样量为200μl，使用单波长紫外-可见分光检测器，最低检测限为4ng/ml，即进样量0.8ng，约为供试品溶液浓度的0.07％。表5维生素d3检测限结果精密称取维生素d3对照品适量，用异辛烷溶解，加正己烷逐级稀释制成测试溶液。按信噪比10∶1为最低定量限，当维生素d3浓度为16ng/ml，进样量为200μl，测得维生素d3平均峰面积约为2848.3，约为附近最大噪声的10.3倍，平行六份的主峰保留时间rsd为0.30％，峰面积rsd为0.76％。结果表明：最低定量限为16ng/ml，即3.2ng，约为供试品溶液浓度的0.27％。表6维生素d3定量限结果八、反式维生素d3检测限、定量限：精密称取反式维生素d3对照品适量，用正己烷溶解并逐级稀释制成测试溶液。结果表明：按信噪比3∶1为最低检测限，进样量为200μl，使用单波长紫外-可见分光检测器，最低检测限为4ng/ml(即进样量0.8ng)，约为供试品溶液浓度的0.07％。保留时间(分钟)峰面积检测限s/n相当于供试品溶液浓度21.6134440.8ng3.000.07％表7反式维生素d3检测限结果按信噪比10∶1为最低定量限，当反式维生素d3浓度为16ng/ml，进样量为200μl，测得维生素d3平均峰面积约为2454.5，约为附近最大噪声的10.2倍，平行六份的主峰保留时间rsd为0.45％，峰面积rsd为1.31％。结果表明：最低定量限为16ng/ml(即进样量3.2ng)，约为供试品溶液浓度的0.27％。表8反式维生素d3定量限结果上述中所述的碳酸钙d3咀嚼片，国家标准的名称为碳酸钙d3咀嚼片(ⅱ)。上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。当前第1页12