一种用于指示肉类新鲜度的凝胶比色型硫化氢传感器的制备方法与流程

本发明属于食品智能包装技术领域，具体涉及一种用于指示肉类新鲜度的凝胶比色型硫化氢传感器的制备方法。

背景技术：

食品质量与安全长期以来是人们关注的重大问题。鲜肉在运输储藏过程中极易受到微生物的污染，产生对人体有毒有害的物质。因此，对肉类新鲜度的检测具有十分重要的意思。目前，评价肉类新鲜度或腐败程度的方法有感官评定法、物理、化学测定法。其中感官评定法具有简单直接的优点，但是受人为主观因素影响较大；物理化学法，如硬度、总挥发性盐基氮等的测定等虽然更加可靠，但是需要借助专门的实验设备与仪器；对于普通消费者来说，能够实时获知包装内肉类的新鲜度信息是他们的迫切需求的。

食品智能包装是指能够监测包装内食品品质或者食品周围环境的包装。消费者可以通过识别智能包装中传感器来判别食品的品质信息。食品智能包装的指示功能通常由置于包装内部的传感器，指示器以及数据载体来实现。其中比色型的传感器因其具有易制备、易用肉眼观察等优点，研究较为广泛。目前，国内外报道的有关肉类的新鲜度的智能包装材料的比色指示型传感器主要有ph敏感型传感器，生物胺敏感型传感器和二氧化碳传感器等。

硫化氢是肉类在腐败过程中由细菌分解含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)所产生的一种挥发性气体。因此，硫化氢被视为一种评价肉类新鲜度的特征性成分。尽管国内外关于检测硫化氢的比色型传感器研究较为广泛，但是这些传感器绝大多数都含有对人体有毒有害的物质，这大大限制了它们在食品智能包装上的应用。因此，开发无毒的硫化氢比色型传感器用于食品智能包装具有很大的应用前景。

近些年来，贵金属纳米材料表现出优异的光学、电磁学、热学、力学以及催化等多种特性，因而在各行各业的得到了广泛应用。以金、银为代表的贵金属纳米颗粒表现出的局部表面等离子共振(localsurfaceplasmonresonance,lspr)现象是它们重要的光学特性之一。lspr是指当光线入射到由贵金属构成的纳米颗粒上时，如果入射光子频率与贵金属纳米颗粒或金属岛传导电子的整体振动频率相匹配时，纳米颗粒或金属岛会对光子能量产生很强的吸收作用。由于贵金属纳米颗粒的lspr吸收峰与其颗粒大小、形状、成分、颗粒间距和局部溶液的折射率等参数紧密相关，通过改变这些参数，便可以设计出众多各具特色的比色型传感器。

贵金属纳米颗粒的合成方法有很多，其中化学还原法是最简单和常用的合成方法。化学还原法一般是指在液相条件下，用还原剂还原金属的化合物而制备纳米金属粒子的方法。常见的化学还原剂有硼氢化钠、水合肼、柠檬酸钠等。同时，溶液中通常加入分散剂，如聚乙烯吡咯烷酮和十六烷基三甲基溴化铵等，以减少因粒子间的碰撞而引起的粒子枝联和团聚。然而，这些还原剂或者分散剂对生物组织具有一定的毒性，在某种程度上限制了它们在生物、食品等领域中的应用。为了解决这个问题，绿色合成贵金属纳米粒子是一个重要途径。

尽管有关绿色合成贵金属纳米粒子的专利和报道较多，但是将这些纳米传感器用于硫化氢的比色检测的研究较少。此外，将绿色合成的贵金属纳米粒子作为比色型的硫化氢传感器用于食品智能包装仍未见报道。因此，本发明的目的在于利用绿色合成的银纳米粒子作为比色型的硫化氢传感器，用于肉类的智能包装中。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明旨在解决所述问题之一；本发明提供一种能够指示肉类新鲜度的比色型硫化氢传感器的制备方法及其在智能包装中的应用。具体包括一种银纳米颗粒的绿色合成方法及其在食品智能包装中的使用方法。

为了实现以上目的，具体步骤如下：

(1)氢氧化钠溶液的配制：将氢氧化钠加入到超纯水中搅拌并溶解，制备成氢氧化钠溶液；

(2)结冷胶溶液的配制：将结冷胶粉末加入到步骤(1)制备的氢氧化钠溶液中，加热并搅拌溶解，制备成结冷胶溶液；

(3)银纳米粒子的合成：将硝酸银加入到步骤(2)制备的结冷胶溶液中，加热并搅拌，获得结冷胶-银纳米溶液；

(4)琼脂溶液的制备：将琼脂粉加入到超纯水中，加热并搅拌，制备成琼脂溶液；

(5)固态凝胶硫化氢传感器的制备：首先将步骤(3)中合成的结冷胶-银纳米溶液进行ph调节，然后加入步骤(4)合成的琼脂溶液，搅拌均匀；溶液在室温下冷却后，形成固态的凝胶，即为比色型硫化氢传感器；

优选的，步骤(1)所述氢氧化钠与超纯水的用量比为0.4～40mg:100ml。

优选的，步骤(2)所述加热的温度为95℃；所述的结冷胶粉末与氢氧化钠溶液的用量比为0.5～4g:100ml。

优选的，步骤(3)所述的硝酸银与结冷胶溶液的用量比为0.01～1mmol:1l；所述加热的温度为95℃，加热时间为3～10h。

优选的，步骤(4)所述加热的温度为100℃。

优选的，步骤(4)所述的琼脂粉与水的用量比为5g:100ml。

优选的，步骤(5)所述的ph调节是用0.2m的磷酸缓冲溶液调节ph为7.0。

优选的，步骤(5)所述的琼脂溶液与结冷胶-银纳米溶液的体积比为1～5:10。

本发明制备的结冷胶-银纳米溶液和凝胶对硫化氢气体具有高灵敏度的响应；与硫化氢进行反应时，溶液或者硫化氢的颜色由黄色逐渐变成无色；

其检测原理为硫化氢溶于水时，一部分保持气态的硫化氢(h2s)，一部分电离为硫氢根离子(hs^-)和硫离子(s^2-)；当它们与银纳米粒子接触时，会生成硫化银(ag2s)。反应方程如下：

4ag+2h2s+o2→2ag2s+2h2o

4ag+2hs^-+o2→2ag2s+2oh^-

4ag+2s^2-+o2+2h2o→2ag2s+4oh^-

在银纳米颗粒表面生成的硫化银显著地改变了银纳米颗粒的lspr特性，因此产生可见的颜色变化。

(7)将凝胶置于一次性保鲜盒中，并在保鲜盒中放入一定量的鲜肉；凝胶会与肉腐败过程中产生的硫化氢发生反应，产生肉眼可见的颜色变化，从而指示肉的新鲜度。

本发明的有益效果：

本发明采用食品级原料结冷胶作为还原剂和封端剂制备了一种安全无毒的比色型硫化氢传感器。该方法合成的银纳米具有良好的稳定性。由于银纳米直接通过水热法合成，因此具有制备简单、重现性高等优点，克服了许多复杂纳米材料合成步骤繁琐、重复性差、无法大批量合成等缺陷，有利于其工业化生产。考虑到所制备的结冷胶-银纳米溶液在实际食品包装应用中存在易泄露等局限性，因此在结冷胶-纳米银溶液中加入琼脂使之形成凝胶态。该凝胶具有易加工成型、易携带、不泄露等优点。该凝胶在使用过程中无需与包装中的肉接触，而是通过与肉产生的硫化氢发生反应产生信号，因此具有非接触、无损的优点，且产生的颜色信号易于识别。此外，该凝胶传感器的成本非常低，有利于其商业化应用。

附图说明

图1中a为实施例1制备的结冷胶溶液和结冷胶-银纳米溶液的光谱图，其中插图为结冷胶溶液和结冷胶-银纳米溶液的颜色图；b为实施例1制备的结冷胶-银纳米溶液与不同浓度的h2s(0-60μm)反应后溶液的光谱图，其中插图为结冷胶-银纳米溶液与不同浓度的h2s反应后溶液的颜色图；c为实施例1制备的银纳米颗粒的透射电镜图；d为实施例1制备的银纳米颗粒粒径分布图；e为实施例1制备的银纳米颗粒与h2s反应后的透射电镜图；f为实施例1制备的银纳米与h2s反应后的颗粒粒径分布图。

图2中a为实施例1制备的结冷胶-银纳米溶液在ph4-12下的紫外可见光谱，其中插图为结冷胶-银纳米溶液在ph4-12下颜色图；b为实施例1制备的结冷胶-银纳米溶液在ph4-12下的紫外可见光谱局部放大图；c为实施例1制备的结冷胶-银纳米溶液在不同ph下与h2s反应后的紫外可见光谱，其中插图为结冷胶-银纳米溶液在ph6-12下与20μm的h2s反应后的颜色图；d为实施例1制备的结冷胶-银纳米溶液在ph6-12下h2s反应后的紫外可见光谱在420nm处吸收值的相对变化量。

图3为实施例1制备的结冷胶-银纳米溶液与不同浓度的h2s反应后的紫外-可见光谱图，其中插图为结冷胶-银纳米溶液与不同浓度的h2s反应后颜色图。

图4中a为实施例1制备的结冷胶-银纳米溶液在500μm的(1)空白，(2)正己烷，(3)庚烷，(4)乙醇，(5)正丁醇，(6)苯酚，(7)丙酮，(8)乙醛，(9)己醛，(10)醋酸，(11)丙酸，(12)乙酸乙酯，(13)二甲胺，(14)三甲胺，(15)苯胺，(16)三氯甲烷，(17)二甲基二硫醚，(18)甲硫醇，以及(19)20μm和(20)500μm的h2s存在的条件下颜色变化图；b为实施例1制备的结冷胶-银纳米溶液在存在干扰物质和h2s存在条件下的光谱在420nm处的吸收值变化值(δa)；c为实施例1制备的结冷胶-银纳米溶液在500μm的干扰物质(1)空白，(2)正己烷，(3)庚烷，(4)乙醇，(5)正丁醇，(6)苯酚，(7)丙酮，(8)乙醛，(9)己醛，(10)醋酸，(11)丙酸，(12)乙酸乙酯，(13)二甲胺，(14)三甲胺，(15)苯胺，(16)三氯甲烷，(17)二甲基二硫醚和(18)甲硫醇存在的条件下与20μm的h2s反应后的颜色；d为实施例1制备的结冷胶-银纳米溶液在500μm的干扰物质存在的条件下与20μm的h2s反应后的光谱在420nm处的吸收值变化值(δa)。

图5为实施例1制备的凝胶与不同浓度的h2s(从左至右0，1，3，5，8，12，16，20，25，30，36，42μm)反应时颜色随时间的变化图。

图6为实施例1制备的凝胶与除h2s以外的干扰挥发物(500μm)反应的颜色图。

图7为实施例1中所制备的凝胶与鸡胸肉和鲢鱼肉挥发气体反应颜色随时间的变化图。

图8中为实施例1中所制备的凝胶在4℃和75％相对湿度下储藏时颜色随时间的变化图。

图9中为实施例1中所制备的凝胶中的银纳米粒子与a鸡胸肉和b鲢鱼肉共储藏8天后透射电镜图。

图10中a为实施例1制备的结冷胶-银纳米溶液在25℃下储藏30天后的紫外-可见光谱变化；b银纳米粒子的zeta电势；c为实施例1制备的结冷胶-银纳米溶液在不同nacl(0-1m)浓度下的紫外可见光谱图，其中插图为结冷胶-银纳米溶液在不同nacl(0-1m)浓度下的颜色图。

具体实施方式

实施例1：

准确称取4mg氢氧化钠溶于100ml水中，得到ph为11的氢氧化钠溶液；往该氢氧化钠溶液中加入1g结冷胶，在95℃下搅拌1h，接着往该结冷胶溶液中加入1ml的10mm硝酸银溶液，继续加热搅拌4.5h得到结冷胶-银纳米溶液，反应完成后将溶液冷却至室温，用0.2m的缓冲溶液调节ph为7.0；同时取5g琼脂于100ml水中，在100℃下搅拌1h；取10mlph为7的结冷胶-银纳米溶液加热至90℃，往其中加入1ml的琼脂溶液，搅拌均匀，趁热取0.4ml混合溶液至10ml的塑料离心管盖中；待冷却至室温后，即可形成凝胶，即为比色型硫化氢传感器。

实施例2：

准确称取0.4mg氢氧化钠溶于100ml水中，得到ph为10的氢氧化钠溶液；往该氢氧化钠溶液中加入0.5g结冷胶，在95℃下搅拌1h；接着往该结冷胶溶液中加入0.1ml的10mm硝酸银溶液，继续加热搅拌2h得到结冷胶-银纳米溶液。反应完成后将溶液冷却至室温，用0.2m的缓冲溶液调节ph为7.0；同时取5g琼脂于100ml水中，在100℃下搅拌1h，取10mlph为7的结冷胶-银纳米溶液加热至90℃，往其中加入2ml的琼脂溶液，搅拌均匀，趁热取0.4ml混合溶液至10ml的塑料离心管盖中，待冷却至室温后，即可形成凝胶，即为比色型硫化氢传感器。

实施例3：

准确称取40mg氢氧化钠溶于100ml水中，得到ph为12的氢氧化钠溶液；往该氢氧化钠溶液中加入4g结冷胶，在95℃下搅拌1h；接着往该结冷胶溶液中加入10ml的10mm硝酸银溶液，继续加热搅拌1h得到结冷胶-银纳米溶液；反应完成后将溶液冷却至室温，用0.2m的缓冲溶液调节ph为7.0；同时取5g琼脂于100ml水中，在100℃下搅拌1h，取10mlph为7的结冷胶-银纳米溶液加热至90℃，往其中加入5ml的琼脂溶液，搅拌均匀，趁热取0.4ml混合溶液至10ml的塑料离心管盖中，待冷却至室温后，即可形成凝胶，即为比色型硫化氢传感器。

性能测试：

将实施例1中制备的凝胶用于鸡胸肉与鲢鱼肉的新鲜度指示。

取200g鸡胸肉或鱼肉于一次性的塑料保鲜盒中，将凝胶也放置于该保鲜盒中但不与肉接触，将保鲜盒用保鲜膜密封，并置于4℃下冷藏。

取300g猪肉于一次性的塑料保鲜盒中，将凝胶也放置于该保鲜盒中但不与猪肉接触，将保鲜盒用保鲜膜密封，并置于4℃下冷藏。

如图7所示，随着储藏时间的延长，凝胶的颜色逐渐发生由亮黄到橙黄的变化。因此人们可以通过肉眼观察凝胶的颜色来判定肉的新鲜度；当凝胶单独储藏时，如图8所示，凝胶的颜色没有发生明显的变化，这说明图7中凝胶的颜色变化是由肉挥发出的气体所造成的。凝胶的颜色：红(r)，绿(g)，蓝(b)如表4所示。其中b值都随着储藏天数不断的增加，证明了黄色的逐渐消退(黄色为蓝色的补色)。这一颜色变化与结冷胶-银纳米溶液同h2s反应时的颜色变化相一致。从侧面证明了凝胶的颜色变化很可能是由于银纳米与h2s反应造成的。为了证实这一点，将包装中第8天的凝胶中的银纳米提取出来并用透射电镜进行观察，如图9所示，在透射电镜下观察到了ag@ag2s的核壳结构，证明了凝胶的颜色变化确实是由于银纳米与肉腐败产生的硫化氢反应引起的。

表1.结冷胶-银纳米溶液与不同浓度的h2s反应后的颜色变化

表1为图3中结冷胶-银纳米溶液与不同浓度h2s反应时的颜色变化。从表中可以看出，随着h2s浓度的上升，结冷胶-银纳米溶液的b值不断上升，证明了黄色的逐渐消退，这与图3插图中用肉眼观察到的颜色变化一致。

表2.鸡胸肉在4℃储藏条件下不同天数时的挥发性成分与含量

nd:未检出

表2为鸡胸肉在4℃下储藏8天，利用气相色谱-质谱联用(gc-ms)测得的挥发性成分与含量变化。可以看出硫化氢在第4天被检测到，证明了鸡胸肉的腐败变质会产生硫化氢。除了硫化氢，还有其它48种物质被鉴定出来，这些物质将被选为检验h2s传感器选择性的干扰物质。

表3.鲢鱼肉在4℃储藏条件下不同天数时的挥发性成分与含量

nd:未检出

表3为鲢鱼肉在4℃下储藏8天，利用气相色谱-质谱联用(gc-ms)测得的挥发性成分与含量变化。可以看出硫化氢在第5天被检测到，证明了鲢鱼的腐败变质会产生硫化氢。除了硫化氢，还有其它49种物质被鉴定出来，这些物质将被选为检验h2s传感器选择性的干扰物质。

表4.凝胶用于指示鸡胸肉与鲢鱼肉新鲜度时随时间的颜色变化

表4为图7中的凝胶的颜色变化值。可以看出随着肉储藏时间的延长，凝胶的b值呈不断上升趋势，说明了凝胶的黄色逐渐发生消退。

表5.比色型h2s传感器的化学试剂成本

*所列价格来自国药化学试剂网

表5为实施例1中所制备的凝胶的化学试剂成本。可以看出该凝胶的成本十分低，每制备10万个凝胶仅需27.896美元，有利于其商业化应用。

图1中a为结冷胶溶液和结冷胶-银纳米溶液的颜色和光谱图。从图中可以看出结冷胶溶液无色透明，在300-800nm范围内无吸收峰，而结冷胶-银纳米溶液成亮黄色，在420nm处有明显的吸收峰，证明了银纳米粒子的合成；图1中b为在结冷胶-银纳米溶液中加入不同浓度的h2s后溶液的颜色与光谱变化，其中所标数字指代h2s的浓度(0～60μm)；可以看出随着h2s浓度的增加，结冷胶-银纳米溶液的颜色由亮黄色逐渐变成橙黄色，最后变成无色，同时其在420nm处的紫外-可见吸收峰的吸收值逐渐下降；图1中c为合成的银纳米颗粒的透射电镜图；从中可以看出合成的银纳米大致呈球形。图1中d为合成的银纳米颗粒粒径分布，其平均直径为25.3±5.3nm。图1中e为合成的银纳米颗粒与h2s反应后的透射电镜图；从中可以看到明显的ag@ag2s核壳结构，证明了h2s与银纳米反应会在银纳米的表面形成ag2s。图1中f为合成的银纳米与h2s反应后的颗粒粒径分布，其平均直径为26.7±5.8nm，与反应前的银纳米颗粒的大小没有明显的差异。

图2中a为制备的银纳米在不同ph下的颜色与紫外-可见光谱图，其中所标数字指代ph值；可以看出当ph小于或者等于5时，银纳米溶液的颜色于在其他ph下有明显的不同，当ph为4和5时，溶液的的颜色为橙黄色，同时在420nm的处的吸收值有明显的下降(图2b)。但是在ph大于或者等于6时，溶液保持很好的稳定性，颜色都呈亮黄色。由于肉类的腐败会产生大量含氮的碱性气体，通常称为挥发性盐基氮。结冷胶-银纳米溶液在碱性条件下的稳定性，保证了其在使用过程中不受ph上升的干扰。图2中c为在ph6-12下，结冷胶-银纳米溶液与h2s反应后的颜色与光谱图。可以看出，在ph为6-12时，结冷胶-银纳米溶液与h2s都有很好的响应，颜色均明显发生了消退。根据光谱吸收值的相对变化(a0-a1)/a0可以看出在ph为7时，光谱相对变化值最大(图1d)，其中a0，a1分别为反应前和反应后溶液在420nm处的吸收值。因此，选用7为溶液的最佳ph值。

图3中所标数字指代h2s的浓度(0～85μm)；可以看出，随着h2s浓度的升高，结冷胶-银纳米溶液的紫外可见吸收光谱在420nm初度额吸收值不断减小，溶液的颜色由亮黄色逐渐变成橙黄色，直至无色。

图4中a和b中可以看出当结冷胶-银纳米溶液与除h2s以外的干扰物质进行反应时，没有发生明显的颜色变化，仍旧保持亮黄色。这里选择的干扰物质的为表1和表2中的gc-ms测得的鸡胸肉和鱼肉的挥发性物质。由于挥发性物质繁多，选择了其中同系物或者结构类似物中的一种或几种代表性物质。图3中c和d中可以看出在其他物质与硫化氢共同存在的条件下，结冷胶-银纳米与硫化氢仍有良好的响应；从图3的c中可以看出，溶液的颜色都明显发生了消退，这证明了结冷胶-银纳米对h2s具有非常好的选择性。

图5中可以看出，凝胶对不同浓度的h2s气体具有灵敏的响应；随着反应时间的延长，凝胶逐渐由黄色变成无色。其中h2s浓度越高，变化越快。说明凝胶也是一种可靠的h2s传感器。

图6中可以看出凝胶对除h2s以外的其他干扰物质没有响应，凝胶的颜色都保持黄色，证明了其对h2s良好的选择性。

图7中可以看出，将凝胶置于装有鸡胸肉和鲢鱼肉的包装盒中，随着储藏时间的延长，凝胶的颜色逐渐发生黄色到无色的变化趋势，说明了凝胶与挥发性物质发生了反应。

图8中可以看出，凝胶单独储藏时没有发生明显的颜色变化，仍保持亮黄色。说明凝胶有很好的稳定性，同时证明图7中凝胶的变色是由肉挥发性气体引起的。

图9为图7中第8d的凝胶中的银纳米结构，图中可以看到ag@ag2s的核壳结构，证明了图7中的凝胶的变色确实是由硫化氢与银纳米发生反应引起的。

图10中a可以看出结冷胶-银纳米溶液在25℃下储藏30天后的紫外-可见光谱与储存前的结冷胶-银纳米溶液的紫外-可见光谱几乎重合，证明了其良好的稳定性。这是由于其表面的结冷胶分子具有带负电的羧基基团，使得银纳米之间存在斥力，阻碍了银纳米之间的团聚；如图10中b所示，银纳米的zeta电势为-27.4±3.30mv；图10中c为结冷胶-银纳米溶液在不同浓度nacl的条件下的紫外可见光谱以及颜色图。当nacl的浓度等于或小于0.1m时，结冷胶-银纳米溶液保持量化色，说明其具有良好的稳定性。当nacl的浓度为1m时，颜色变成浅黄色，溶液发生了凝聚。这是因为结冷胶分子在高浓度阳离子下发生聚集造成的。尽管如此，在0.1m的nacl存在的条件下，仍保持很好的稳定性，这种稳定性有利于其实际生产应用。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。