一种烟叶中苏糖酸和苏糖酸酯的GC-MS分析方法与流程

本发明属于烟叶成分分析测定技术领域，具体涉及一种气相色谱-质谱法检测烟叶中苏糖酸及苏糖酸内酯。

背景技术：

l-苏糖酸广泛地存在于自然界和动物体内。早在20世纪30年代，人们就发现苏糖酸是维生素c的降解产物之一，是一个四碳手性酸，具有良好的穿透生物膜效应，从而具有重要的生物功能。l-苏糖酸作为离子的载体使金属离子易与氨基酸或蛋白质结合而被动物吸收和利用。正是由于l-苏糖酸在自然界中和动物体内的广泛存在，以及在人体内较高的生物活性和生理作用，使得人们越来越多地将目光投向了苏糖酸及其化合物的研究。烟草中存在各种内酯类香味物质，-co-o-c-是致香基团，它们是水果和奶制品中的主要香味成分。在烟草中研究较多的有二氢猕猴桃内酯，α-当归内酯等，但至今未见有苏糖酸内酯的报道。

人们通过gc、glc、hplc等方法分离鉴定了一些植物中的苏糖酸，在动物体内，通过hplc-ms-ms等方法，在尿液、血浆乃至组织中鉴定出了苏糖酸。但到目前为止，苏糖酸的分析方法依然有待改善。而关于苏糖酸内酯的分析报道至今没有。

本研究发现烟草中同时存在苏糖酸及苏糖酸内酯，为了更好的研究烟草的生理活性及致香机理，建立了分析检测烟草中苏糖酸及苏糖酸内酯的gc-ms同时分析方法。

技术实现要素：

本发明的目的正是针对上述现有技术状况而专门提供一种检测烟叶中苏糖酸及苏糖酸内酯的衍生化gc-ms方法。利用该方法可以测定烟叶中的苏糖酸内酯及苏糖酸。

本发明的目的是通过以下方案来实现的：

一种同时测定烟叶中苏糖酸及苏糖酸内酯的衍生化gc-ms方法：烟叶进行粉碎后过筛备用。用二氯甲烷和水依次涡旋提取烟粉中苏糖酸内酯及苏糖酸，硅烷化反应后，进gc-ms分析。

本发明的具体步骤如下：

(1)烟叶的粉碎：将烟丝或调制烟叶过的烟叶粉碎至40～60目，放于-20℃冰箱保存；

(2)烟叶中苏糖酸及苏糖酸内酯的萃取：称量0.5～1g粉碎后的烟叶于16ml离心管中，加入5～10ml二氯甲烷(含内标氘代十六烷酸50μg/ml)涡旋萃取15～30min，取二氯甲烷萃取液备用。取1～2ml二氯甲烷萃取液过滤后，风干，再加入5～10ml水(含内标氘代十六烷酸50μg/ml)，涡旋萃取15～30min，取水萃取液备用。

(3)硅烷化衍生反应：取水萃取液过水相滤膜，取萃取液0.5ml，用氮吹仪吹干。取二氯甲烷萃取液过有机相滤膜，取萃取液0.5ml直接与水萃取液吹干样品合并；加入双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bstfa)衍生试剂50～150μl于60℃下衍生化反应10～40min，然后进gc-ms/ms仪器检测。

(4)检测：采用gc-ms进行检测分析。色谱条件如下：

进样口温度：280℃；进样量：1.0μl；分流比10:1；载气：氦气，恒流流速1.0ml/min；色谱柱：db-5ms色谱柱(60m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.)；程序升温：60℃保持2min，然后以3℃/min的速率升至150℃，再以5℃/min的速率升至200℃，最后以30℃/min的速率升至280℃，保持20min。

电离方式：ei；传输线温度：280℃；离子源温度：300℃。

扫描方式：采用全扫描模式或sim同时扫描模式；

其中，全扫描模式的采集质量数范围：40-500。

sim模式定量、定性离子分别为，苏糖酸内酯：定量离子247，定性离子147，73，217；苏糖酸：定量离子292，定性离子220，205，147。

本发明的有益效果如下：

(1)首次建立了烟叶中苏糖酸内酯及苏糖酸的提取方法；(2)将二氯甲烷提取液与水提取液吹干物合并进行硅烷化衍生，首次建立了一种能同时测定烟叶中苏糖酸及苏糖酸内酯的分析方法；(3)本发明采用了硅烷化gc-ms技术，方法灵敏度更高，检测限更低。例如，本方法中苏糖酸定量限为0.1μg/ml，而文献(王洪允等，药物分析杂志，2004,24,367-371)中为0.25μg/ml，有关苏糖酸内酯的分析至今未见报道。

附图说明

图1为本发明的检测步骤流程图。

图2为本发明所得gc-ms的sim色谱图。

具体实施方式

本发明以下将结合实施例作进一步说明：

样品分析步骤流程图见图1。

实施例1

将烟叶样品磨成粉末，过40目筛。称量0.5g粉碎后的烟叶于16ml离心管中，加入5ml二氯甲烷(含内标氘代十六烷酸50μg/ml)涡旋萃取30min，取二氯甲烷萃取液备用。样本过滤后，再加入5ml水(含内标氘代十六烷酸50μg/ml)，涡旋萃取30min，取水萃取液备用。

取水萃取液过水相滤膜，取萃取液0.5ml，用氮吹仪吹干。取二氯甲烷萃取液过有机相滤膜，取萃取液0.5ml直接与水萃取液吹干样品合并；加入双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bstfa)衍生试剂150μl于60℃下衍生化反应40min，然后进gc-ms仪器检测。

gc-ms仪器条件为进样口温度：280℃；进样量：1.0μl；分流比10:1；载气：氦气，恒流流速1.0ml/min；色谱柱：db-5ms色谱柱(60m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.)；程序升温：60℃保持2min，然后以3℃/min的速率升至150℃，再以5℃/min的速率升至200℃，最后以30℃/min的速率升至280℃，保持20min。

电离方式：ei；传输线温度：280℃；离子源温度：300℃。

扫描方式：采用全扫描模式；采集质量数范围：40-500。

在连续10日，每日进行重复实验。计算10次实验中色谱峰的面积，并计算10次实验各色谱峰“峰面积/内标面积”值(s/s内)的相对标准偏差(rsd，％)和保留时间的相对标准偏差，列于表1。其中，s/s内的rsd<5％,保留时间rsd<2％,证明该方法具有较好的重现性。

表1保留时间及重复性

实施例2

方法回收率考察：采集云南宜良地区品种为k326的烟叶，并磨碎至40目。称量0.5g粉碎后的烟叶于16ml离心管中，加入5ml二氯甲烷(含内标氘代十六烷酸50μg/ml)萃取液，100μl的苏糖酸标准品溶液及100μl苏糖酸酯标准品溶液(各标准品加入浓度为20μg/ml、100μg/ml、200μg/ml三个量级，见表2)，涡旋萃取30min，取二氯甲烷萃取液备用。样本过滤后，再加入5水(含内标氘代十六烷酸50μg/ml)，涡旋萃取30min，取水萃取液备用。取水萃取液过水相滤膜，取萃取液0.5ml，用氮吹仪吹干。取二氯甲烷萃取液过有机相滤膜，取萃取液0.5ml直接与水萃取液吹干样品合并；加入双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bstfa)衍生试剂150μl于60℃下衍生化反应40min，然后进gc-ms仪器检测。色谱条件如实施例1。

测定的各化合物回收率如表2所示，对苏糖酸及苏糖酸酯在加入浓度为20μg/ml、100μg/ml、200μg/ml下，回收率在86.5％-117.8％之间。

表2方法的回收率

本发明所得的苏糖酸内酯、苏糖酸sim图见图2。