本发明属于生命科学领域，具体涉及一种基于微量法的叶绿体复合体ⅴ活性测定试剂盒及方法。
背景技术：
叶绿体复合体ⅴ又称f1f0-atp合酶，该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化atp合成，也可逆过程水解atp。复合体ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成atp的关键酶。目前，测定线粒体复合体ⅴ活性的方法鲜有报道，但尚未发现有效的检测叶绿体复合体ⅴ活性的测定方法。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明旨在提供一种基于微量法的叶绿体复合体ⅴ活性测定试剂盒及方法，具有检测专一性极高，检测准确度高，重复性较好等特点。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种基于微量法的叶绿体复合体ⅴ活性测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：
试剂一，液体100ml×1瓶，由tris-hcl、蔗糖、egta混合而成，-20℃保存；
试剂二，粉剂×1支，由atp组成，置于2mlep管中，-20℃保存；
试剂三，液体8ml×1瓶，由tris-hcl、mgcl2、kcl、nacl混合而成，4℃保存；
试剂四，粉剂×1瓶，由tca组成，置于5ml试剂瓶中，4℃保存；
试剂五，粉剂×1瓶，由asa组成，置于10ml试剂瓶中，4℃保存；
试剂六，粉剂×1瓶，由钼酸铵组成，置于10ml试剂瓶中，4℃保存；
试剂七，液体10ml×1瓶，由硫酸和水混合而成，置于10ml试剂瓶中，室温保存。
进一步的，所述试剂一中所含的tris-hcl的物质的量浓度为50mm，ph为7.4，体积为100ml，蔗糖的质量为10.96g，egta的质量为380mg。
进一步的，所述试剂二中所含的atp的质量为36.3mg。
进一步的，所述试剂三中所含的tris-hcl的物质的量浓度为50mm，ph为7.2，体积为8ml，mgcl2的质量为61mg，kcl的质量为60mg，nacl的质量为47mg。
进一步的，所述试剂四中所含的tca的质量为0.8g。
进一步的，所述试剂五中所含的asa的质量为1g。
进一步的，所述试剂六中所含的钼酸铵的质量为0.25g。
进一步的，所述试剂七中所含的硫酸的体积为1.4ml，水的体积为8.7ml。
一种利用上述试剂盒的基于微量法的叶绿体复合体ⅴ活性测定方法，其原理为复合体ⅴ水解atp产生adp和pi，通过测定pi增加速率来测定复合体ⅴ活性；
本发明首次建立了包含叶绿体中复合体ⅴ提取和活性检测的方法，其具体步骤如下：
步骤1仪器和用品的准备；
准备可见分光光度计或酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰、蒸馏水；
步骤2试剂的配制；
在存放有试剂二的试剂瓶中加入2ml蒸馏水，充分溶解，制得试剂二溶液备用；
在存放有试剂四的试剂瓶中加入4ml蒸馏水，充分溶解，制得试剂四溶液备用；
在存放有试剂五的试剂瓶中加入10ml蒸馏水，充分溶解，制得试剂五溶液备用；
在存放有试剂六的试剂瓶中加入10ml蒸馏水，充分溶解，制得试剂六溶液备用；
按蒸馏水：试剂五溶液：试剂六溶液：试剂七溶液=2:1:1:1的体积比配制定磷试剂，配好的定磷试剂应为浅黄色，若为无色则试剂失效，若为蓝色则为磷污染；
步骤3叶绿体的提取；
称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1ml试剂一，用研钵匀浆，快速研磨或捣碎，30秒内完成，使之成为匀浆液；
将匀浆液于离心率200g，4℃下离心1min；
弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，离心率1500g，4℃下离心5min；
弃上清液，于沉淀中加入0.5ml试剂一，混匀，配成叶绿体悬浮液；
步骤4叶绿体复合体ⅴ活性的测定操作；
a.酶促反应：
1）取2支ep管，分别设定为第一对照管和第一测定管；
2）在第一对照管中加入10μl试剂二溶液和40μl试剂三，同时在第一测定管中加入50μl样本提取液、10μl试剂二溶液和40μl试剂三；
3）分别将第一测定管和第一对照管混匀，在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴30min；
4）在第一对照管中加入20μl试剂四溶液和50μl样本提取液，同时在第一测定管中加入20μl试剂四溶液；
5）分别将第一测定管和第一对照管混匀，用离心率4000g，25℃离心10min，取上清液；
b.定磷；
1）另取2支ep管，分别设定为第二对照管和第二测定管；
2）在第二对照管中加入30μl第一对照管中的上清液和170μl的定磷试剂；同时在第二测定管中加入30μl第一测定管中的上清液和170μl的定磷试剂；
3）分别将第二对照管和第二测定管混匀，室温静置10min后，在660nm波长处分别读取测定管的吸光值a测定管和对照管的吸光值a对照管；
4）计算δa=a测定管-a对照管；
步骤5叶绿体复合体ⅴ活性的计算；
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y=1.274x+0.004；
其中，x为标准品浓度，单位为mmol/l，y为吸光值，y=δa；
1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位；此法需要自行测定样本蛋白质浓度；
复合体ⅴ活性（nmol/min/mgprot）=[(δa-0.004)÷1.274×v反总×106]÷(v样×cpr)÷t=62.8×(δa-0.004)÷cpr；
2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位；
复合体ⅴ活性（nmol/min/g鲜重）=[(δa-0.004)÷1.274×v反总×106]÷(w×v样÷v样总)÷t=31.37×(δa-0.004)÷w；
3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位；
复合体ⅴ活性（nmol/min/104cell）=[(δa-0.004)÷1.274×v反总×106]÷(500×v样÷v样总)÷t=0.063×(δa-0.004)；
其中，v样=0.05ml，表示加入样本体积；
v样总=0.5ml，表示加入提取液体积；
v反总=1.2×10-4l，表示反应体系总体积；
t=30min，表示反应时间；
cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示细菌或细胞总数500万；
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y=0.637x+0.004；
其中，x为标准品浓度，单位为mmol/l，y为吸光值，y=δa；
1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位；此法需要自行测定样本蛋白质浓度；
复合体ⅴ活性（nmol/min/mgprot）=[(δa-0.004)÷0.637×v反总×106]÷(v样×cpr)÷t=125.6×(δa-0.004)÷cpr；
2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位；
复合体ⅴ活性（nmol/min/g鲜重）=[(δa-0.004)÷0.637×v反总×106]÷(w×v样÷v样总)÷t=62.74×(δa-0.004)÷w；
3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位：
复合体ⅴ活性（nmol/min/104cell）=[(δa-0.004)÷0.637×v反总×106]÷(500×v样÷v样总)÷t=0.126×(δa-0.004)；
其中，v样=0.05ml，表示加入样本体积；
v样总=0.5ml，表示加入提取液体积；
v反总=1.2×10-4l，表示反应体系总体积；
cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示细菌或细胞总数500万；
t=30min，表示反应时间。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明首次利用抗坏血酸-钼酸铵比色法测定叶绿体复合体ⅴ活性，在测定原理上具有独创性。
2、本发明的检测方法通过合理设置对照管，可以排除杂质影响，检测专一性极高。
3、本发明的检测方法能够有效分离胞浆蛋白、线粒体蛋白和叶绿体蛋白，准确测定位于叶绿体中的复合体ⅴ活性。
4、本发明的检测方法重复性较好，变异系数(cv值)在2％以内。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种基于微量法的叶绿体复合体ⅴ活性测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：
试剂一，液体100ml×1瓶，由100ml，50mmtris-hcl（ph7.4）、10.96g蔗糖、380mgegta混合而成，-20℃保存；
试剂二，粉剂×1支，由36.3mgatp组成，置于2mlep管中，-20℃保存；
试剂三，液体8ml×1瓶，由8ml50mmtris-hcl（ph7.2）、61mgmgcl2、60mgkcl、47mgnacl混合而成，4℃保存；
试剂四，粉剂×1瓶，由0.8gtca组成，置于5ml试剂瓶中，4℃保存；
试剂五，粉剂×1瓶，由1gasa组成，置于10ml试剂瓶中，4℃保存；
试剂六，粉剂×1瓶，由0.25g钼酸铵组成，置于10ml试剂瓶中，4℃保存；
试剂七，液体10ml×1瓶，由1.4ml硫酸和8.7ml水混合而成，置于10ml试剂瓶中，室温保存。
一种利用上述试剂盒的基于微量法的叶绿体复合体ⅴ活性测定方法，其原理为复合体ⅴ水解atp产生adp和pi，通过测定pi增加速率来测定复合体ⅴ活性；
本发明首次建立了包含叶绿体中复合体ⅴ提取和活性检测的方法，其具体步骤如下：
步骤1仪器和用品的准备；
准备可见分光光度计或酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰、蒸馏水；
步骤2试剂的配制；
在存放有试剂二的试剂品种加入2ml蒸馏水，充分溶解，制得试剂二溶液备用；
在存放有试剂四的试剂瓶中加入4ml蒸馏水，充分溶解，制得试剂四溶液备用；
在存放有试剂五的试剂瓶中加入10ml蒸馏水，充分溶解，制得试剂五溶液备用；
在存放有试剂六的试剂瓶中加入10ml蒸馏水，充分溶解，制得试剂六溶液备用；
按蒸馏水：试剂五溶液：试剂六溶液：试剂七溶液=2:1:1:1的体积比配制定磷试剂，配好的定磷试剂应为浅黄色，若为无色则试剂失效，若为蓝色则为磷污染；
步骤3叶绿体的提取；
称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1ml试剂一，用研钵匀浆，快速研磨或捣碎，30秒内完成，使之成为匀浆液；
将匀浆液于离心率200g，4℃下离心1min；
弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，离心率1500g，4℃下离心5min；
弃上清液，于沉淀中加入0.5ml试剂一，混匀，配成叶绿体悬浮液；
步骤4叶绿体复合体ⅴ活性的测定操作；
b.酶促反应：
1）取2支ep管，分别设定为第一对照管和第一测定管；
2）在第一对照管中加入10μl试剂二溶液和40μl试剂三，同时在第一测定管中加入50μl样本提取液、10μl试剂二溶液和40μl试剂三；
3）分别将第一测定管和第一对照管混匀，在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴30min；
4）在第一对照管中加入20μl试剂四溶液和50μl样本提取液，同时在第一测定管中加入20μl试剂四溶液；
5）分别将第一测定管和第一对照管混匀，用离心率4000g，25℃离心10min，取上清液；
b.定磷；
1）另取2支ep管，分别设定为第二对照管和第二测定管；
2）在第二对照管中加入30μl第一对照管中的上清液和170μl的定磷试剂；同时在第二测定管中加入30μl第一测定管中的上清液和170μl的定磷试剂；
3）分别将第二对照管和第二测定管混匀，室温静置10min后，在606nm波长处分别读取测定管的吸光值a测定管和对照管的吸光值a对照管；
4）计算δa=a测定管-a对照管；
步骤5叶绿体复合体ⅴ活性的计算；
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y=1.274x+0.004；
其中，x为标准品浓度，单位为mmol/l，y为吸光值，y=δa；
1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位；此法需要自行测定样本蛋白质浓度；
复合体ⅴ活性（nmol/min/mgprot）=[(δa-0.004)÷1.274×v反总×106]÷(v样×cpr)÷t=62.8×(δa-0.004)÷cpr；
2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位；
复合体ⅴ活性（nmol/min/g鲜重）=[(δa-0.004)÷1.274×v反总×106]÷(w×v样÷v样总)÷t=31.37×(δa-0.004)÷w；
3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位；
复合体ⅴ活性（nmol/min/104cell）=[(δa-0.004)÷1.274×v反总×106]÷(500×v样÷v样总)÷t=0.063×(δa-0.004)；
其中，v样=0.05ml，表示加入样本体积；
v样总=0.5ml，表示加入提取液体积；
v反总=1.2×10-4l，表示反应体系总体积；
t=30min，表示反应时间；
cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示细菌或细胞总数500万；
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y=0.637x+0.004；
其中，x为标准品浓度，单位为mmol/l，y为吸光值，y=δa；
1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位；此法需要自行测定样本蛋白质浓度；
复合体ⅴ活性（nmol/min/mgprot）=[(δa-0.004)÷0.637×v反总×106]÷(v样×cpr)÷t=125.6×(δa-0.004)÷cpr；
2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位；
复合体ⅴ活性（nmol/min/g鲜重）=[(δa-0.004)÷0.637×v反总×106]÷(w×v样÷v样总)÷t=62.74×(δa-0.004)÷w；
3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位：
复合体ⅴ活性（nmol/min/104cell）=[(δa-0.004)÷0.637×v反总×106]÷(500×v样÷v样总)÷t=0.126×(δa-0.004)；
其中，v样=0.05ml，表示加入样本体积；
v样总=0.5ml，表示加入提取液体积；
v反总=1.2×10-4l，表示反应体系总体积；
cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示细菌或细胞总数500万；
t=30min，表示反应时间。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。