本发明涉及保健食品领域，特别地涉及海洋降糖保健食品生物功能成分的鉴定方法。
背景技术：
保健食品是指适用于特定人群，具有调节机体功能，可预防疾病，增进健康或有助于机体恢复，但不以治疗为目的，供人食用的无毒无害，符合应有营养要求的食品。海洋保健食品是保健食品的一类，它是指使用纯粹的海洋保健食物、功能因子或以海洋保健食物、功能因子为主要成分形成的保健食品。是近年来深受研发人员与广大消费者青睐的一类保健食品。
虾青素(astaxanthin)又称“虾黄素”，是一种从虾蟹外壳、牡蛎、鲑鱼及藻类、真菌中发现的红色类胡萝卜素。近年来已有研究表明,天然虾青素有较强的抗氧化活性，具有清除自由基、保护血管、降低胆固醇、降糖、缓解关节疼痛等多方面的营养保健作用；特别是天然虾青素具有强烈的抗氧化活性，被称为“超级维生素e”、“超级抗氧化剂”。
天然虾青素的大量人体试验和动物试验已经证明它是一种非常安全的类胡萝卜素。由于它有多种生物功效，在营养和医药中的应用具有广阔的发展前景，虾青素作为人类的高级保健食品有着非常广阔的应用前景。但天然虾青素价格较高，合成虾青素又不具备其天然成分功效，这限制了其工业产业上的大规模生产及应用。
糖尿病(diadetes)是一组以长期高血糖为主要特征的代谢综合征，近二十年来，保健食品发展非常迅猛，逐渐被人们所重视。具有辅助降血糖功能的海洋降糖保健食品对糖尿病患者生活质量的改善十分有益，受到越来越多患者的青睐。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供海洋降糖保健食品生物功能成分的鉴定方法。
本发明是以如下技术方案实现的：
海洋降糖保健食品生物功能成分的鉴定方法，所述方法运用高效液相色谱二极管阵列检测器鉴定了海洋降糖保健食品中的主要成分，通过对一系列色谱条件的优化，得到分离度良好，峰形较佳的指纹图谱，跟标准品比对鉴定所述海洋降糖保健食品生物功能成分。
进一步地，所述海洋降糖保健食品活性成分主要为虾青素、岩黄芪提取物、白藜芦醇以及叶黄素。
进一步地，所述海洋降糖保健食品活性成分按质量份数包括虾青素85份、岩黄芪提取物5.5份、白藜芦醇3份以及叶黄素1.5份。
进一步地，所述虾青素产自基因改造酵母菌。
进一步地，所述酵母菌为转基因巴斯德毕赤酵母。
进一步地，所述转基因巴斯德毕赤酵母的获得方法包括：获得虾青素高产促表达基因，将虾青素高产促表达基因转入克隆载体，验证载体正确连接后，制备巴斯德毕赤酵母的原生质体，将虾青素高产促表达基因转入巴斯德毕赤酵母原生质体。
进一步地，虾青素高产促表达基因核苷酸序列如seqidno.1所示。
进一步地，所述酵母菌包含seqidno.1所示核苷酸序列和/或转入seqidno.1核苷酸序列的表达盒或构建体。
本发明具有以下有益效果：获得了源自海洋红酵母菌的虾青素高产促表达基因并通过对其基因进行改造获得了适合在巴斯德毕赤酵母中表达的虾青素高产促表达基因，使巴斯德毕赤酵母能够通过大规模培养高纯天然虾青素，本发明还提供了以本发明所述天然虾青素为生物功能成分的海洋降糖保健食品，其具有显著的自由基消除作用，能有效预防糖尿病带来的肾损伤。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：虾青素高产促表达基因的获得
海洋红酵母(rhodotorulabenthica)菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号cgmcc2.5690，前期研究证明该菌具有较高的虾青素产量，但是其生长于海洋高压、高盐环境，不易大规模工业化培养，不能直接应用于工业化虾青素生产，未解决上述问题，本发明通过挖掘海洋红酵母虾青素高产促表达基因，探索其分子机制，提取其基因组dna进行全基因组测序，基因组测序委托南京金斯瑞公司通过solexa测序平台完成，利用大肠杆菌表达系统(e.colidh5a)构建盐胁迫后地中海富盐菌的cdna文库，具体方法为：分别利用超声随机打断基因组dna至50bp、100bp、250bp、500kb、1.0kb、1.2kb、1.5bp的片段，将dna片段与接头连接，之后50bp、100bp、250bp和500bp文库进行pcr扩增，上机测序，1.0kb、1.2bp和1.5kb大片段文库采用cre-lox建库技术构建，在dna大片段两端连接loxp接头后再进行环化、测序；按照基因组构建步骤分别构建插入片段为50bp、100bp、250bp、500kb、1.0kb、1.2kb、1.5bp的片段插入文库。
将上述插入外源基因的大肠杆菌接种至盐浓度为2.5％的lb液体培养基培养，接种量分别为s1：5％，s2：7.5％，s3：10％，于28℃培养一周，分别测定s1、s2、s3液体培养基内的虾青素产量，测定方法为高效液相色谱法，测定结果表明s3组虾青素产量较高，观察其生长情况，挑取生长旺盛的菌落进行纯培养，划线培养若干次直至获得单克隆(划线培养采用盐浓度为2.5％的lb培养基)，挑取50个长势旺盛的克隆以10％接种量接种至lb液体培养基(a1-a50)，于28℃培养一周，分别测定a1-a50液体培养基内的虾青素产量，测定方法为高效液相色谱法，选取虾青素表达量最高的10组(a6,a13,a14,a35,a21,a33,a46,a49,a4,a29)，用通用引物f-t7和r-pyes2检测a6,a13,a14,a35,a21,a33,a46,a49,a4,a29纯培养插入片段长度及具体序列，具体由上海生工完成测序，将所得到的序列去除载体后，获得虾青素高产促表达基因，对上述虾青素高产促表达基因分别进行点突变，最终获得10条核苷酸序列：xqs1、xqs2、xqs3、xqs4、xqs5、xqs6、xqs7、xqs8、xqs9、xqs10，。
实施例2：虾青素高产促表达基因转入克隆载体
所述xqs1、xqs2、xqs3、xqs4、xqs5、xqs6、xqs7、xqs8、xqs9、xqs10的核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的序列5’端还连接有ncoi酶切位点，3’端还连接有swai酶切位点。将合成的xqs1、xqs2、xqs3、xqs4、xqs5、xqs6、xqs7、xqs8、xqs9、xqs10核苷酸序列分别连入克隆载体pgem-t(promega，madison，usa，cat：a3600)上，操作步骤按promega公司产品说明书进行，得到重组克隆载体pgem-xqs01、pgem-xqs02、pgem-xqs03、pgem-xqs04、pgem-xqs05、pgem-xqs06、pgem-xqs07、pgem-xqs08、pgem-xqs09、pgem-xqs10，载体结构包括：amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；lacz为lacz起始密码子；sp6为sp6rna聚合酶启动子；t7为t7rna聚合酶启动子；xqsx为xqs1-10核苷酸序列；mcs为多克隆位点)。
实施例3：巴斯德毕赤酵母的原生质体的制备
制备巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)的原生质体，巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏号cgmcc1.2.5688)，菌株来源为福州大学生命科学与工程学院，制备过程如下：将巴斯德毕赤酵母菌体细胞培养液稀释到1×106个/ml，在5ml的稀释液中，加入15ml的edta(0.05mol/l),1mlb-巯基乙醇(015mol/l)，35℃预处理15min，之后于低温离心机3500r/min离心10min收集菌体，用高渗缓冲液洗涤两次，之后加入5ml1％的纤维素酶充分混匀后置于30℃水浴锅中处理60min，之后于低温离心机3500r/min离心10min收集菌体，用高渗缓冲液洗涤两次得原生质体悬液，将原生质体悬液稀释到约1×103个/ml，4℃保存备用。
实施例5：靶标基因转染巴斯德毕赤酵母
将重组克隆载体pgem-xqs01、pgem-xqs02、pgem-xqs03、pgem-xqs04、pgem-xqs05、pgem-xqs06、pgem-xqs07、pgem-xqs08、pgem-xqs09、pgem-xqs10分别用peg方法转化巴斯德毕赤酵母原生质体，具体地：接种5ml液体ypd，30℃下振荡培养过夜，计数过夜培养物细胞密度，以最终5×105个/ml的细胞密度接种50mlypd培养液，室温放置30℃，200r/min振荡培养至细胞密度约5×107个细胞/ml，用50ml无菌离心管以3000g(2500r/min)离心5分钟，弃上清液收获细胞，把细胞悬浮在25ml无菌水中，弃上清液收获细胞，把细胞悬浮在1ml的100mmol/l醋酸锂中，转悬浮物至无菌1.5ml离心管，高速离心5秒钟沉淀细胞，用微量移液器吸出醋酸锂，悬浮细胞到最终500μl体积其中大约含400μl的100mmol/l醋酸锂，将重组克隆载体样品(pgem-xqs01、pgem-xqs02、pgem-xqs03、pgem-xqs04、pgem-xqs05、pgem-xqs06、pgem-xqs07、pgem-xqs08、pgem-xqs09、pgem-xqs10)，煮沸3分钟，快速冷却至0℃，振荡细胞悬浮液，取20μl样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，用微量取样器除去醋酸锂，加入转化液，转化液由下列成分组成：
剧烈振荡每个反应管每个反应管直到细胞完全混匀，静置于30℃，30min，置42℃水浴中热激30min，以6000～8000r/min离心15秒，用微量移液器除去转化混合液，以无菌水清洗沉淀并弃上清，提取的质粒经ncoi和swai酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组表达载体bsd01、bsd02、bsd03、bsd04、bsd05、bsd06、bsd07、bsd08、bsd09、bsd10中分别对应的插入的所述xqs1、xqs2、xqs3、xqs4、xqs5、xqs6、xqs7、xqs8、xqs9、xqs10的核苷酸序列。
实施例6：基因改造巴斯德毕赤酵母产虾青素含量测定
将上述插入外源基因的巴斯德毕赤酵母分别接种至nacl浓度为2.5％的ypd液体培养基，于28℃培养14天，观察其生长情况，分别在2、4、6、7、12、14天测定培养基中的虾青素含量，测定结果如表1所示：
表1液体培养基中随天数变动的虾青素含量测定结果(mg/g)
结果表明，转入xqs3、xqs4、xqs8核苷酸序列的巴斯德毕赤酵母具有显著的虾青素产量提升，并且在ypd液体培养基上长势旺盛，可以满足工业生产要求，xqs3的核苷酸序列如seqidno:1所示、xqs4的核苷酸序列如seqidno:2所示、xqs8的核苷酸序列如seqidno:3所示。
实施例7：海洋降糖保健食品生物功能成分及其鉴定方法
制备海洋降糖保健食品，具体地为，活性成分主要为产自基因改造酵母菌虾青素、岩黄芪提取物、白藜芦醇以及叶黄素，按质量份数包括产自基因改造酵母菌虾青素85份、岩黄芪提取物5.5份、白藜芦醇3份以及叶黄素1.5份。
本发明还提供检测上述生物功能成分的方法，具体地，所述方法包括：运用高效液相色谱—二极管阵列检测器鉴定了所述制备海洋降糖保健食品中的主要成分，通过对一系列色谱条件的优化，得到分离度良好，峰形较佳的指纹图谱，跟标准品比对获得自基因改造酵母菌虾青素、岩黄芪提取物、白藜芦醇以及叶黄素具体成分含量。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
seqidno.1xqs3核苷酸序列
seqidno.2xqs4核苷酸序列
seqidno.3xqs8核苷酸序列
序列表
<110>江苏辰星药业股份有限公司
<120>海洋降糖保健食品生物功能成分的鉴定方法
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