一种免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置及其在牛奶中抗生素残留分析中的应用的制作方法

本发明属于分析化学领域，特别提供了一种专门用于牛奶中抗生素残留分析的免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置。

背景技术：

兽药残留是当前食品安全的重要问题，各国政府纷纷制定了相应的法律法规来限制各种兽药的滥用。因此，食品中，特别是牛奶中抗生素残留的检测越来越受到人们的重视。为了帮助保护消费者免受这些潜在有害化合物的危害并控制这些牛奶中抗生素的含量，许多国家制定了严格的法规，包括喹诺酮类药物和磺胺类药物等的最高残留量(mrl)。目前针对抗生素残留的检测系统主要是高效液相色谱—质谱联用系统，该装置检测准确，但是分析时间长，操作过程繁琐，需要有经验的专业人员操作，且很多过程不能实现自动化。由于简单性，高选择性和高通量的分析能力，免疫传感方法已逐渐用于评估牛奶质量和安全性。但基于荧光和显色的检测技术免疫传感方法往往会带来假阳性的结果，且仍然需要对样本进行前处理，自动化程度不高。因此，急需一种简单、快速且准确的抗生素分析方法。

微流控芯片因其小尺寸，低样品/试剂消耗，快速分析速度，高集成度，高通量和便携式等优点而受到广泛关注。微流控芯片联用质谱是传统液相色谱—质谱联用系统的替代方案，通常具有更好的性能。但尚无利用微流控芯片技术与质谱仪器结合检测牛奶中抗生素药物残留的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种可以用于牛奶中抗生素检测的免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置，包括基于恒流注射泵的自动进样单元、牛奶样本前处理单元、基于免疫亲和技术的在线富集单元、磁控分离与样品洗脱单元和电喷雾质谱分析单元；

所述微流控芯片置于恒流注射泵和电喷雾质谱之间，所述具微流控芯片上设有若干个并联平行微通道，所述微通道上设有样本进口和样本出口，所述样本进口通过连接管与进样针相连；所述样本出口通过连接管和毛细管与电喷雾质谱相连；所述微通道靠近进口的一端为样本前处理区域；所述微通道的中间的区域为样品混合和反应区域；所述微通道靠近样本出口的一端为磁分离区域和样品洗脱区域，在磁分离区域和样品洗脱区域的正下方设有磁铁；所述的牛奶样本前处理单元为多孔微/纳米材料填充柱、原位合成的阵列柱、商品化多孔膜、高分子聚合物等，用于牛奶中的蛋白质聚集颗粒的去除，实现牛奶样本的提取操作。

微流控芯片的制作方法，包括以下步骤：

(1)将微流控芯片通道图案打印到透明胶片上；

(2)通过光刻刻蚀技术将上述图案转移到0.5-200微米厚的su-8负光胶的铬层玻璃基片上，并得到微流控芯片的玻璃凸面模板；

(3)将pdms预聚物的聚合体和交联剂充分混合，真空脱气后浇筑于玻璃凸面模板上，加热固化，形成pdms膜；

(4)将pdms膜从玻璃凸面模板剥离后，打孔，与玻璃片一起进行氧等离子体亲水处理，并贴合，形成封闭微通道；

(5)将连接管插入微流控芯片的进出口，并与恒流注射泵和电喷雾质谱相连，即得到所述微流控芯片。

免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置在检测奶制品样品中抗生素残留中的应用在本发明的保护范围之内。

利用本发明中免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置检测奶制品样品中抗生物残留，包括以下步骤：

(1)将含有已知量内标物的待测牛奶样本、提取试剂、中和试剂、缓冲溶液和抗体功能化磁性微球溶液，用恒流注射泵通过样本进口推入样本混合区域，流速为1～20μl/min，其中流速比为待测牛奶样本：提取试剂：中和试剂：缓冲溶液：抗体功能化磁性微球溶液＝1：1：(1-10)：(1-10)：(1-20)，时长5～30min，反应后的磁性微球被逐渐固定在磁分离区域和样品洗脱区域，形成长度为1～20mm，宽度为0.1～1mm的填充床；

(2)将清洗液以5～20μl/min的流速从样本进口流入微流控芯片通道进行冲洗；

(3)将洗脱液以0.5～5μl/min的流速从进口流入磁分离区域和样品洗脱区域，将富集的抗生素从磁性微球上解离并流出；

(4)微流控芯片流出的抗生素洗脱液通过电喷雾质谱实时监测，以质谱峰信号的相对强度或离子流的相对强度来定量，以特定目标峰的分子量以及二级质谱来定性。

其中，所述的抗生素包括喹诺酮类药物、磺胺类药物、β-内酰胺类药物、四环素类药物、氯霉素类药物。

所述待测牛奶样本的制备方法为：

(1)预先将牛奶样本中加入已知量的内标分子，即与所测定抗生素同类别的¹³c或d同位素标记的抗生素分子；

(2)对牛奶样本进行稀释。

步骤(1)中，所述提取试剂的流速与待测牛奶样本流速一致。

其中，所述提取试剂三氯乙酸溶液、乙腈或者乙醇；所述缓冲溶液为pbs缓冲溶液。

本发明中的装置可以只使用其中一部分功能，即可将离线前处理的样本直接通入微流控芯片进行在线分离和富集。

本发明的优点在于：(1)能够直接对牛奶样本进行在线的分析。(2)在目标物抗生素残留的提取富集、检出限、准确度方面能更好满足实际检测需求。(3)可以实现多个样本的同时操控，便于同时进行多组实验。(4)具有更快速的分析能力，满足快检的要求。

附图说明

图1为本发明实施例的免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置用于牛奶中抗生素残留分析的原理示意图；

图2为本发明实施例的免疫亲和微流控芯片的牛奶样本前处理单元的显微镜图；

图3为利用本发明的免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置对牛奶提取液加标溶液进行分析时，5分钟分析时间内其中的七种目标物和一种内标物的离子流色谱图；

图4为利用本发明的免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置对牛奶提取液加标溶液进行分析时，分析时间内的典型质谱图；

图5为利用本发明的免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置对牛奶加标溶液分析时，洗脱液洗脱前2.5分钟分析时间内其中的七种目标物和一种内标物的离子流色谱图；

图6为利用本发明的免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置对牛奶加标溶液分析时，检出物的典型二级质谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本发明中微流控芯片采用湿法软光刻技术制作而成，其制备方法如下：

模具的制作：设计和绘制微流控芯片通道图案，并打印到透明胶片上；通过光刻刻蚀技术将上述图案转移到一定厚度的su-8负光胶的铬层玻璃基片上，并得到微流控芯片的玻璃凸面模板。

芯片的制作：将pdms预聚物的聚合体和交联剂充分混合，真空脱气后浇筑于玻璃凸面模板上，加热固化，形成pdms膜；将pdms膜从玻璃凸面模板剥离后，打孔，与干净的玻璃片一起进行氧等离子体亲水处理，并贴合，形成封闭微通道；将连接管插入微流控芯片的进出口，并与恒流注射泵和电喷雾质谱相连。

实施例1：芯片的组装。

该装置由五个基本功能单元顺序连接构成。包括基于恒流注射泵的自动进样单元，牛奶样本前处理单元，基于免疫亲和技术的在线富集单元，磁控分离与样品洗脱单元和电喷雾质谱分析单元。微流控芯片具有若干个并联平行微通道；所述微通道有五个进口，通过连接管与进样针相连；所述微通道的出口通过连接管和毛细管与电喷雾质谱相连；靠近所述进口的一端为牛奶样本前处理单元；靠近所述出口的一端的腔室为磁分离区域和样品洗脱区域。磁铁置于微流控芯片的磁分离区域和样品洗脱区域的正下方。

图1为免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置用于牛奶中抗生素残留分析的原理示意图；图2为免疫亲和微流控芯片的牛奶样本前处理单元的原位合成的pdms阵列柱的显微镜图。

实施例2：牛奶提取液加标溶液的分析。

(1)将待测牛奶与提取试剂混合均匀；(2)将步骤(1)得到的混合物用滤膜过滤、收集滤液；(3)将无色透明的滤液用pbs缓冲溶液稀释，加入喹诺酮药物标样和内标物，得到基质标准溶液。(4)将基质标准溶液和抗体功能化磁性微球用恒流注射泵通过进口推入样品混合区域，流速为5-20μl/min，时长5-30min。反应后的磁性微球被逐渐固定在磁分离区域和样品洗脱区域，形成长度为1-20mm，宽度为0.1-1mm的填充床。(25)将清洗液以5-20μl/min的流速从进口流入微流控芯片通道进行冲洗，洗去物理吸附的样品杂质。(6)将洗脱液以0.5-5μl/min的流速从进口流入磁分离区域和样品洗脱区域，将富集的抗生素从磁性微球上解离并流出进入质谱。(7)从微流控芯片流出的抗生素洗脱液通过电喷雾质谱实时监测，以质谱峰信号的相对强度来定量。图3为免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置对牛奶提取液加标溶液进行分析时，5分钟分析时间内其中的七种目标物和一种内标物的离子流色谱图；图4为免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置对牛奶提取液加标溶液进行分析时，分析时间内的典型质谱图

实施例3：牛奶加标溶液的分析。

(1)将含有已知量内标物的待测牛奶样本、三氯乙酸、氢氧化钠、缓冲溶液和抗体功能化磁性微球溶液用恒流注射泵通过五个进口推入样品混合区域，流速为1-20μl/min，时长5-30min。反应后的磁性微球被逐渐固定在磁分离区域和样品洗脱区域，形成长度为1-20mm，宽度为0.1-1mm的填充床。(2)将清洗液以5-20μl/min的流速从进口流入微流控芯片通道进行冲洗，洗去物理吸附的样品杂质。(3)将洗脱液以0.5-5μl/min的流速从进口流入磁分离区域和样品洗脱区域，将富集的抗生素从磁性微球上解离并流出进入质谱。(4)从微流控芯片流出的抗生素洗脱液通过电喷雾质谱实时监测，采集前2.5分钟的一级质谱图和离子流色谱图。通过一级质谱图的特定目标峰的分子量来定性，以相对强度来定量。2.5分钟后采集特定目标峰的串联质谱，来进一步确证定性。图5为免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置对牛奶加标溶液分析时，洗脱液洗脱前2.5分钟分析时间内其中的七种目标物和一种内标物的离子流色谱图；图6为免疫亲和微流控芯片—质谱联用装置对牛奶加标溶液分析时，检出物的二级质谱图。