一种细胞涂片的制备方法及其应用与流程

本发明属于生物及医学检测领域，具体地涉及一种细胞涂片的制备方法及其应用。

背景技术：

循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,ctcs)是指在肿瘤生长过程中，从肿瘤原发灶脱落并进入外周血循环系统的实体瘤上皮细胞。ctcs会通过血液循环系统依附到远端组织上生长形成新的肿瘤组织——转移灶。大量临床数据表明，肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的直接原因，因而及早发现ctcs对于癌症的早诊断、术后预判以及疗效评估等具有重要意义。但是ctcs在外周血中的存在数量非常稀少，仅占外周血白细胞的1/10⁶～1/10⁷，并且它的数量在外周血中呈现动态分布，会存在滞后现象，因此对于检测ctcs的要求很高。

外周血样本ctcs的检测通常包含富集和鉴定两步。富集时先通过适当离心将含有ctcs的白细胞悬浮液同红细胞分开，为后面进行ctcs的筛选、染色、干燥固定、鉴定做准备。其中，细胞悬浮液干燥、细胞固定的条件通常为烘箱32℃过夜，并且不开鼓风。但是，过久的烘干时间极大地影响了鉴定操作的时长，且细胞的回收率不够理想。《循环肿瘤细胞检测预测肝细胞癌微血管侵犯的临床研究》(第二军医大学硕士学位论文，作者：汪宇，导师：施乐华)公开了一种细胞涂片的制备方法，其操作中先细胞干燥再细胞固定，烘干时间较短，仅15-30分钟，但其细胞回收率仅为52.41％。所以，目前还缺少一种用于ctcs检测的能够保持或提高细胞回收率、不影响细胞核型和膜蛋白抗体染色后的细胞形态，并且操作时间较短的细胞涂片的制作方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中缺乏一种既能保持或提高细胞回收率、保留完整细胞核型且不影响膜蛋白抗体染色，又能缩减干燥时间、加快整体实验进度的细胞涂片方法，提供一种细胞涂片的制备方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：提供一种细胞涂片的制备方法，其包括配制细胞悬液、细胞固定、细胞染色和细胞干燥的步骤，其中，所述细胞干燥为将所述细胞涂片在50℃、鼓风条件下培养40-60分钟。在本领域中，以上的细胞干燥过程又称为“烤片”。

本领域中的恒温培养箱除了能够控制不同条件的培养温度以外，有一些还具有鼓风功能，因此上述的“鼓风条件”指将此类恒温培养箱鼓风功能开启。理论上所有具有鼓风功能的恒温培养箱都可以用于本发明，在本发明一较佳的具体实施例中，使用了上海叶拓仪器仪表有限公司的电热恒温干燥箱(型号：101)。在本发明技术方案中的其他参数不变的前提下，鼓风功能(包括风速)与本发明的电热恒温干燥箱相同或接近相同的电热恒温干燥箱均可以达到本发明的效果。

在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述细胞固定的步骤在所述细胞干燥的步骤之前。现有技术中细胞固定的步骤在所述细胞干燥的步骤之后，其细胞回收率低于本发明，仅为52.41％。

在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述鼓风条件下培养的时间为50分钟以上；例如50分钟。在其他条件相同的情况下，50分钟的烤片时间可带来最佳的细胞回收率(72.99±5.37％)。

在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述细胞固定使用的固定液为多聚甲醛固定液。本领域常规的细胞固定液理论上均可以用于本发明。多聚甲醛是多种组织细胞的良好固定液，对脂类、酶类的保存优于其他固定剂。此外，多聚甲醛的自发荧光非常微弱，不会影响免疫荧光抗体的荧光表达。在本发明一更佳的具体实施例中，使用了4％的多聚甲醛溶液，所述％为重量体积百分比。

在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述细胞悬液的浓度为5×10⁴个/ml。

可用本领域常规的各种缓冲液制备细胞悬液。在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述细胞悬液为pbs细胞悬液。优选地，所述4％的多聚甲醛固定液和所述pbs细胞悬液的体积百分比为1:1。

在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述细胞为哺乳动物细胞，优选为人细胞，更优选为人血细胞；最优选地，在配制细胞悬液的步骤之前，还包括将人血细胞与血浆分离的步骤。将人血细胞与血浆分离，有利于细胞的染色和后期的观察与检测。

在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述细胞染色使用cd45抗体染色液和/或dapi染色液。cd45抗体染色液优选人cd45抗体染色液，cd45是白细胞表面共同抗原，一般白细胞都具有该抗原，人cd45抗体染色液对血细胞尤其是白细胞有特异性染色效果。dapi染色液即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够和dna强力结合的荧光素，常用于荧光显微镜观测。dapi可以透过完整的细胞膜，常用于活细胞和固定细胞的染色。

在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，在加入所述dapi染色液前，还包括用pbs缓冲液洗涤和用无水乙醇处理的步骤。优选地，所述无水乙醇处理后，还包括吹干的步骤。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为：提供一种细胞涂片在制备防治疾病的药物中的应用。优选地，所述疾病为癌症；更优选地，所述癌症为恶性b细胞淋巴瘤、包括急性b淋巴细胞白血病(b-all)、慢性b淋巴细胞白血病(b-cll)、套细胞淋巴瘤(mcl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)和多发性骨髓瘤(mm)，肝癌，腺癌，肺癌，结肠癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，胃癌，胆管癌，非小细胞癌，胆囊癌，食管癌，黑色素瘤，胰腺癌，尿路上皮癌，头颈癌和前列腺癌中的一种或多种。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

大大缩短了干燥时间的同时，还提高了细胞的回收率，样本中富集出的细胞可以被较多地保留在载玻片上，且细胞核型与细胞整体形态保留完整、膜蛋白抗体染色不受影响，极大地提高了实验效率。

附图说明

图1为不同干燥温度、不同干燥时间条件下的细胞染色图；

图2为不同干燥温度、同一干燥时间条件下的细胞染色图；

图3为细胞涂片后进行cd45抗体细胞免疫荧光染色的结果，其中a为本发明50℃鼓风、干燥60分钟的结果；b为现有技术的方法制作获得的细胞涂片的结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

微型台式真空泵：海门市其林贝尔仪器制造有限公司

高速离心机：thermofisherscientific

电热恒温干燥箱(型号：101)：上海叶拓仪器仪表有限公司

涡旋混合器：haimenkylin-belllabinstruments

荧光扫描显微镜：carlzeiss

密度梯度分离液：ficoll-pague，gehealthcare

4％多聚甲醛溶液：kingmorn

cd45抗体染色液：biolegend

pbs缓冲液：corning

台盼蓝染液：sigma-aldrich

无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司

dapi染色液：上海翊圣生物科技有限公司

制备实施例1细胞涂片的制备

1.分离红细胞与血浆

1)取已采集的离体的健康人6ml外周血，轻柔颠倒采血管混匀并室温200g离心15分钟；

2)将离心结束后的上清(即血浆)使用真空泵吸弃，并加入pbs缓冲液至6ml体积，轻柔颠倒采血管混匀；

3)在标记好的50ml离心管a中加入3ml密度梯度分离液；

4)然后缓慢将上述步骤2)的血细胞混合液加至离心管a中分离液的上方，室温400g离心机30分钟；

5)离心结束后，离心管a中的液体分成四层，从上至下分别为黄色液体层、白膜层、透明或淡红色液体层和深棕红色液体层。按照先吸取白膜层再吸取深棕红色液体层上方所有液体的顺序，依次将液体加入到50ml离心管b中；

6)补加pbs缓冲液至45ml，配平后室温500g离心5分钟，弃上清至500μl；

7)补加pbs缓冲液至45ml，配平后室温400g离心5分钟，弃上清至100μl。

2.细胞固定

1)吸取100μl的4％多聚甲醛溶液加入至100μl细胞悬液中，并用涡旋混合器轻柔振荡，固定15分钟；

2)补加pbs缓冲液至45ml，配平后室温500g离心5分钟，弃上清至500μl；

3)补加pbs缓冲液至45ml，配平后室温400g离心5分钟，弃上清至100μl。

3.细胞染色

1)加入1μlcd45抗体染色液至100μl细胞悬液中，室温避光孵育20分钟，每10分钟使用涡旋混合器轻柔混匀一次；

2)补加pbs缓冲液至45ml，配平后室温500g离心5分钟，弃上清至100μl。

4.细胞计数、干燥

从100μl细胞悬液中吸取10μl，用pbs缓冲液梯度稀释10倍，加等体积台盼蓝染色液进行染色，利用细胞计数器进行细胞计数。

根据计数结果和实验样本量的需求，吸取适量b管中的细胞悬液和pbs缓冲液，重新配制浓度为5×10⁴个/ml的细胞悬液。

吸取200μl细胞悬液滴加于载玻片样本框内，并置于不同干燥条件下的烘箱内进行干燥。不同干燥条件包括：(1)50℃干燥50min、55℃干燥40min和60℃干燥30min的鼓风实验组与32℃干燥过夜的对照组；以及(2)鼓风干燥的条件下，50℃、55℃和60℃不同干燥时间处理的实验组。

5.细胞鉴定

1)干燥后取出玻片，沿标本框内侧边角轻柔滴加200μlpbs缓冲液，立即吸弃；共重复2次；

2)沿标本框内侧边角轻柔滴加200μlpbs缓冲液，静置2分钟，吸弃；共重复两次；

3)沿标本框内侧边角轻柔滴加200μl无水乙醇后，立即吸弃；共重复2次；

4)将玻片插入装有无水乙醇的染色缸中静置2分钟后取出玻片，竖立在滤纸上完全吸干玻片流下的残留液，并使用微型吹风机将玻片轻柔吹干；

5)取10μldapi染色液滴加于标本框中央，置放盖玻片后，固定盖玻片防止其滑动，用真空泵吸头或滤纸挤压并吸干溢出的多余液体，封干标本；

6)立即在荧光扫描显微镜下观察或于4℃避光保存。

效果实施例1最快干燥条件下的细胞回收情况

为了最大限度地加快干燥过程，找到细胞悬液最快的干燥时间，发明人设置了50min(50℃)、40min(55℃)和30min(60℃)的鼓风实验组(即下表1中的2-1、3-1、4-1组)，并以32℃过夜干燥为对照组(即1-1组)，进行了三次、每次平行三组重复实验。通过对前期处理的细胞进行计数并计算，于每片载玻片方框内滴入含有约1×10⁴个细胞的细胞悬液，后分别放置于50℃、55℃和60℃中、鼓风条件下的烘箱内进行干燥，待时间到后取出，经过后期处理后再于镜下扫片计数，细胞回收情况统计结果如表1所示，部分细胞核型及膜蛋白抗体染色情况如图1所示。

表1不同干燥条件与现有技术下的细胞回收率对比

注释：细胞回收率一栏的字母a、b可表征组间是否存在显著性差异，相同字母的组别间无显著性差异，不同字母的组别间存在显著性差异。

从表1中可以看出，实验组2-1在干燥温度50℃、干燥时间50min、鼓风开启的条件下，其细胞回收率同对照组1-1之间存在显著性差异，而其他干燥条件下的细胞回收率同对照组间无显著性差异。

从图1中可以看出，各实验组的细胞核形态良好，无明显变形，但组3-1在55℃、40min、鼓风开启和组4-1在60℃、30min、鼓风开启下的细胞膜外红圈(cd45抗体表达阳性)存在明显缺失和变形，而组2-1在50℃、50min、鼓风开启下的细胞膜外红圈完整。

上述结果表明干燥温度50℃、鼓风开启的条件下干燥50min即可获得比现有技术中32℃过夜干燥、鼓风关闭条件下更高的细胞回收率，并且细胞核型、膜蛋白抗体染色效果良好。

效果实施例2干燥1小时条件下的细胞回收情况

在干燥时间控制在1小时之内的前提下，为了了解干燥温度与细胞回收率之间的关系，发明人在不同的干燥温度下，对比了最短干燥时间和干燥1小时下的细胞回收率，并以32℃过夜干燥为对照组，进行了三次，每次平行三组重复实验。同样地，通过对前期处理的细胞进行计数并计算，于每片载玻片方框内滴入含有约1×10⁴个细胞的细胞悬液，后放置于表2参数显示的特定温度、鼓风条件下的烘箱内进行干燥，待1小时后取出，经过后期处理后再于镜下扫片计数，细胞回收情况统计结果如表2所示，部分细胞核型及膜蛋白抗体染色情况如图2所示。

表2不同温度和时间条件下的细胞回收情况

注释：细胞回收率一栏的字母a、b、c可表征各干燥温度、干燥时间的组合间是否存在显著性差异，相同字母的表示组合间无显著性差异

由表2可以看出，在最短干燥时间和干燥1小时条件下，实验组：2-1与2-2(50minvs.60min)之间、3-1与3-2(40minvs.60min)之间、4-1与4-2(30minvs.60min)之间的细胞回收率都无显著性差异。

再以32℃过夜无风干燥为对照组，各温度下干燥1小时为实验组，统计数据如表3所示。

表3不同温度与鼓风条件下的细胞回收率

注释：细胞回收率一栏的字母a、b、c可表征组间是否存在显著性差异，相同字母的组别间无显著性差异，不同字母的组别间存在显著性差异。

表3表明，实验组2-2在50℃、鼓风开启组和实验组3-2在55℃、鼓风开启组的细胞回收率与对照组1-1间存在显著性差异，并且实验组2-2在50℃、鼓风开启组的细胞回收率最高。

图2结果显示，各实验组的细胞核形态良好，无明显变形，实验组3-2在55℃、60min、鼓风开启和实验组4-2在60℃、60min、鼓风开启条件下的细胞膜外红圈(cd45抗体表达阳性)变形较严重，甚至呈现放射状。相比之下，实验组2-2在50℃、50min、鼓风开启下的细胞膜外形态紧凑完整。

上述结果表明干燥温度为50℃、鼓风开启的条件下干燥50-60min即可获得比过去32℃过夜干燥、鼓风关闭条件下更高的细胞回收率，并且细胞核型、膜蛋白抗体染色效果良好。

对比例1

根据效果实施例2中的条件，取50℃作为干燥温度，在鼓风条件下延长干燥时间分别至70分钟、80分钟和90分钟，结果如下表4所示：

表4不同干燥时间下的细胞回收率

根据表4所示的结果，当延长干燥时间至60分钟以上时，细胞的回收率明显下降。即在其他参数固定的前提下，延长干燥时间并不总是能提高细胞的回收率，而是有一定的温度限制。

对比例2

《循环肿瘤细胞检测预测肝细胞癌微血管侵犯的临床研究》(第二军医大学硕士学位论文，作者：汪宇，导师：施乐华)第19页记载了一种细胞涂片的制作方法，其步骤中先烤片，后多聚甲醛固定，滴加到玻片上的细胞悬液体积为50μl，烤片温度为52℃，烤片时间15-30min。按照该文中的方法制作的细胞图片的细胞回收率为52.41％，低于效果实施例1和2中各条件的细胞回收率。

根据本发明效果实施例2中50℃鼓风干燥60分钟的条件下制作细胞图片后进行cd45抗体细胞免疫荧光染色的结果与通过该文中第19页记载的“6、细胞图片制作过程”与“7、免疫荧光染色制作过程”的方法获得的cd45抗体细胞免疫荧光染色的结果如图3a-3b所示。

图3a-3b显示，根据本发明的方法制作的cd45抗体细胞免疫荧光染色的结果较清晰，如图3a所示。而根据上述论文中公开的方法制作的相同的细胞免疫荧光染色结果背景染色较为严重，如图3b所示，对cd45阳性细胞的判断产生了严重的干扰，不利于获取可靠的结论。