一种HPLC法分离测定度他雄胺原料药及制剂中降解杂质的方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种采用高效液相色谱法分离和测定度他雄胺原料药及制剂中降解杂质的方法。

背景技术：

度他雄胺是一种白色结晶固体的化学品，其分子式为c27h30f6n2o2，临床上主要用于治疗前列腺肿大、男性型脱发、脂溢性脱发和遗传性脱发。

度他雄胺的结构式如下：

2,5-二三氟甲基苯胺为度他雄胺软胶囊在强酸、强碱、高温条件下生成的降解杂质，也是合成度他雄胺时的起始原料，其分子式为c8h5f6n，结构式如下：

经查询，目前各国药典上均未有度他雄胺软胶囊质量标准，也没有相关的任何文献或者标准报道。按照进口质量标准jx20130056有关物质方法进行检测，主成分峰相对保留时间约6.5min，而降解杂质2,5-二三氟甲基苯胺出峰时间约为5min，位于大量辅料峰的中间，干扰明显，故进口标准不适用于本降解杂质的检测。因此需要开发一套能准确检测该杂质含量且不受干扰的方法，对度他雄胺软胶囊的质量控制能起到提供技术支持的作用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种采用高效液相色谱法分离和测定度他雄胺原料药及制剂中2,5-二三氟甲基苯胺的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种hplc法分离测定度他雄胺原料药及制剂中降解杂质的方法，该方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，用乙腈-水-三氟乙酸的混合液作为流动相a和用甲醇作为流动相b进行梯度洗脱，进入检测器检测；所述降解杂质为2,5-二三氟甲基苯胺，结构式如下：

本发明中采用的色谱柱规格为kromasil100-5c18，250mm×4.6mm，5μm，或其他性能相当的色谱柱。

进一步，动相a中乙腈、水、三氟乙酸的体积比为500-520:450-480:0.2-0.3，作为一种优选为520:480:0.25。

进一步，检测器的检测波长为300-320nm，作为一种优选，本发明的检测波长为310nm；检测柱温为35℃。

进一步，梯度洗脱条件为：0min，流动相a与流动相b的体积比为70：30；13min，流动相a与流动相b的体积比为70：30；15min，流动相a与流动相b的体积比为10：90；30min，流动相a与流动相b的体积比为10：90；31min，流动相a与流动相b的体积比为70：30；40min，流动相a与流动相b的体积比为70：30；梯度洗脱的流速为1.0ml/min。

进一步，根据以上描述的方法，具体检测包括以下步骤：

1)取度他雄胺样品，加稀释剂溶解稀释制得样品溶液；

2)取2,5-二三氟甲基苯胺对照品，加稀释剂溶解稀释制成每1ml中约含0.75μg和0.25μg的溶液，分别作为对照品溶液和灵敏度测试溶液；

3)取灵敏度测试溶液50μl，注入色谱仪，记录色谱图，主峰的信噪比应不小于10；再取供试品溶液和对照品溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，2,5-二三氟甲基苯胺与相邻峰的分离度应大于1.5，理论塔板数按2,5-二三氟甲基苯胺计应不低于3000。

4)2,5-二三氟甲基苯胺的出峰时间应不小于10min且不大于13min。

进一步，以上方法中所用的稀释剂为质量浓度为70％-90％的乙腈水溶液，作为一种优选为70％的乙腈水溶液。

本发明还提供一种hplc法分离测定度他雄胺软胶囊在强制降解条件下产生的杂质的方法，包括在强制降解条件为5mol/l硫酸溶液、5mol/l氢氧化钠溶液、高温80℃30min条件下产生的杂质，该方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(kromasil100-5c18，250mm×4.6mm，5μm，或其他性能相当的色谱柱)，采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，所述流动相a为乙腈-水-三氟乙酸的混合液，流动相b为甲醇。

进一步，流动相a中乙腈、水、三氟乙酸的体积比500-520:450-480:0.2-0.3；作为一种优选的体积比为520:480:0.25。

进一步，梯度洗脱条件为：0min，流动相a与流动相b的体积比为70：30；13min，流动相a与流动相b的体积比为70：30；15min，流动相a与流动相b的体积比为10：90；30min，流动相a与流动相b的体积比为10：90；31min，流动相a与流动相b的体积比为70：30；40min，流动相a与流动相b的体积比为70：30。

进一步，检测器的检测波长为300-320nm，作为一种优选，本发明的检测波长为310nm。

一种采用十八烷基硅烷键合硅胶、乙腈-水-三氟乙酸混合液和甲醇水溶液在hplc法中分离测定2,5-二三氟甲基苯胺的应用，其特征在于，该hplc法中采以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱、乙腈-水-三氟乙酸的混合液作为流动相a、用甲醇作为流动相b进行梯度洗脱；所述乙腈-水-三氟乙酸的混合液的体积比为乙腈:水:三氟乙＝500-520:450-480:0.2-0.3。

本发明的有益效果在于：

1)本发明自建了一套hplc方法检测度他雄胺软胶囊中2,5-二三氟甲基苯胺的含量，该方法在测定时，度他雄胺、bht、各已知杂质和空白辅料均不干扰2,5-二三氟甲基苯胺测定。

2)经验证，该方法专属性好，重现性好，准确度高，对度他雄胺软胶囊的质量控制能提供技术支持。

附图说明

图1采用本发明方法检测2,5-二三氟甲基苯胺的色谱图

图2不同波长下检测2,5-二三氟甲基苯胺的色谱图

图3不同浓度稀释剂条件下检测2,5-二三氟甲基苯胺的色谱图

图4不同流动相检测2,5-二三氟甲基苯胺的色谱图

具体实施方式

以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

仪器设备及色谱条件：

日本岛津shimadzulc-2010aht液相色谱仪；检测器：uv；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(kromasil100-5c18，250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈-水-三氟乙酸(520:480:0.25)为流动相a，甲醇为流动相b，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为310nm；进样量为50μl。

梯度洗脱条件：

检测步骤：

1.供试品溶液制备：取度他雄胺软胶囊10粒，用剪刀刺穿胶囊顶部，将内容物挤入25ml量瓶中，用70％乙腈水溶液分次将剪刀及胶囊壳上的内容物洗净，洗液合并于上述量瓶中，加70％乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀，即得；。

2.对照品溶液、灵敏度溶液制备：取2,5-二三氟甲基苯胺对照品适量，精密称定，加70％乙腈水溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.6μg和0.2μg的溶液，分别作为对照品溶液和灵敏度测试溶液。

3.进样，检测。

4.取灵敏度测试溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，主峰的信噪比应不小于10。再精密量取供试品溶液和对照品溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，2,5-二三氟甲基苯胺与相邻峰的分离度应满足要求，理论塔板数按2,5-二三氟甲基苯胺计应不低于3000。

检测结果

色谱图如图1所示。各物质出峰时间如下表：

从上表可知，杂质c峰在310nm波长下与2,5-二三氟甲基苯胺峰能完全分离；度他雄胺、bht和其它已知杂质在310nm处紫外吸收较弱，且均不干扰2,5-二三氟甲基苯胺测定，空白辅料在310nm处也不干扰2,5-二三氟甲基苯胺的测定。

实施例2

实施例2为检测2,5-二三氟甲基苯胺时检测波长的条件摸索。

检测方法：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(kromasil100-5c18，250mm×4.6mm，5μm，或性能相当的色谱柱)；以乙腈-水-三氟乙酸为流动相a，以甲醇为流动相b；流速为1ml/min；柱温为35℃；检测波长为220nm和240nm。

检测结果：

如图2所示。通过紫外吸收图谱发现，2,5-二三氟甲基苯胺在240nm、310nm附近处有最大吸收。采用240nm作为检测波长，空白辅料干扰检测，因此，初步选择检测波长为310nm。此外，相比220nm和240nm，在310nm波长处，其它已知杂质和空白辅料响应较低，而2,5-二三氟甲基苯胺响应较高，无干扰，因此最后选择310nm作为检测波长。

实施例3

实施例3为检测2,5-二三氟甲基苯胺时稀释剂浓度的条件摸索。

检测方法：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(kromasil100-5c18，250mm×4.6mm，5μm，或性能相当的色谱柱)，以乙腈-水-三氟乙酸(520:480:0.25)为流动相a，以甲醇为流动相b；流速为1ml/min，柱温为35℃，检测波长为310nm。

稀释剂：筛选乙腈、90％乙腈水溶液、80％乙腈水溶液、70％乙腈水溶液、60％乙腈水溶液、50％乙腈水溶液。

检测步骤：用不同浓度的稀释剂溶剂稀释供试品，按本发明的色谱方法分别进样检测。

检测结果：

如图3所示。1)采用60％乙腈、50％乙腈作为稀释剂：样品溶液混浊；2)采用90％乙腈作为稀释剂：有溶剂效应；3)采用80％乙腈作为稀释剂：2,5-二三氟甲基苯胺峰的灵敏度较70％乙腈作为稀释剂差。故最终选择70％乙腈作为稀释剂。

实施例4

实施例4为检测2,5-二三氟甲基苯胺时流动相选用的条件摸索。

检测方法：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(kromasil100-5c18，250mm×4.6mm，5μm，或性能相当的色谱柱)，以乙腈-水-三氟乙酸(520:480:0.25)为流动相a，以甲醇为流动相b；流速为1ml/min，柱温为35℃，检测波长为310nm。

流动相：选用甲醇或乙腈作为流动相b进行梯度洗脱。

检测结果

如图4。在310nm波长处，按本发明确定的色谱系统对该杂质进行检测，2,5-二三氟甲基苯胺的出峰时间约为12min，而此处空白辅料未有任何色谱峰，说明该色谱条件下空白辅料不干扰2,5-二三氟甲基苯胺的检测。经方法学验证，该方法专属性好，重现性好，准确度高，能有效保证度他雄胺软胶囊的质量。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照优选实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。