苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法与流程

本发明涉及一种中药方剂的检测方法，具体涉及苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法。
背景技术：
：指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的dna，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段。它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的、能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。苓桂术甘汤方出自张仲景《伤寒杂病论》。《伤寒杂病论》第67条云：“伤寒，若吐、若下后，心下逆满，气上冲胸，起则头眩，脉沉紧，发汗则动经，身为振振摇者，茯苓桂枝白术甘草汤主之。”《金匮要略·痰饮咳嗽病篇第十二》云：““心下有痰饮，胸胁支满，目眩者，苓桂术甘汤主之。”又曰：“夫短气有微饮，当从小便去之，苓桂术甘汤主之。肾气丸亦主之”。本方由茯苓、桂枝、白术、甘草四味药组成，主治心下有停饮、胸胁支满、眩晕及心下逆满、气上冲胸、起则头眩、脉沉紧之阳虚饮停证，乃“病痰饮者，当以温药和之”的代表方剂。“稠者为痰，清者为饮”，痰饮为患，流动不拘，涉及范围广泛，从内到外，从上到下，均可因痰饮停聚而成病。目前关于苓桂术甘汤指纹图谱检测方法研究较少。本发明采用高效液相色谱法建立苓桂术甘汤的指纹图谱检测方法，可对苓桂术甘汤中的有效成分进行准确的分析，对全面客观评价苓桂术甘汤的质量具有重要的意义。技术实现要素：发明目的：本发明的目的是解决现有技术的补足，提供一种苓桂术甘汤的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价苓桂术甘汤的质量，对控制苓桂术甘汤的质量和保证临床疗效具有重要意义。技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、苓桂术甘汤供试品溶液的制备精密称取茯苓40g、桂枝30g、白术20g与甘草20g，加水超声，过滤收集药液，旋转蒸发药液至干，然后加入95％乙醇加热回流提取，过滤，取上清液，水浴蒸干后加入甲醇溶解，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；步骤2、混合对照品溶液的制备：精密称定甘草苷、肉桂酸和反式肉桂醛对照品，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得对照品溶液；步骤3、分别精密吸取按步骤1方法制备得到的供试品溶液和步骤2制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；步骤4、将步骤3中获得的苓桂术甘汤供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a；选择苓桂术甘汤的色谱图中均存在的的色谱峰作为共有峰；利用平均值计算法生成苓桂术甘汤的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。作为优选方案，以上所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，步骤1苓桂术甘汤供试品溶液制备方法为：精密称取苓桂术甘汤的药材茯苓40g、桂枝30g、白术20g与甘草20g，加入1l水超声提取，过滤收集药液，旋转蒸发药液至干，加入4倍量95％乙醇加热回流提取3h，过滤取上清液，水浴蒸干后加入20ml甲醇溶液溶解，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。作为优选方案，以上所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备方法为：精密称定甘草苷、甘草酸铵和肉桂醛对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成甘草苷0.265mg/ml、肉桂酸0.28mg/ml、反式肉桂醛0.315mg/ml的混合对照品溶液。作为优选方案，以上所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：gs-120-5-c18-ap，流动相：a相为乙腈-b相为水，二极管阵列检测器，检测波长254nm，柱温：30℃，流速0.6ml/min，进样体积：10μl，梯度洗脱。作为优选方案，以上所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，梯度洗脱程序如下表：程序时间(min)a相体积/％b相体积/％10595230356533535654654555590455569510007951000作为优选方案，以上所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，指纹图谱中选择6个共有峰作为苓桂术甘汤指纹图谱的特征峰，以这6个特征峰的峰面积作为质量评价的指标，6个共有峰中对照品甘草苷为2号峰，保留时间为31.132分钟，对照品肉桂酸为5号峰，相对保留时间为46.605分钟，对照品反式肉桂醛为6号峰，相对保留时间为61.179分钟，1号峰保留时间为30.288分钟，3号峰保留时间为33.157分钟，4号峰的保留时间为38.039分钟。指纹图谱检测条件的优化1.在样品溶液的制备优化方面本发明通过对不同提取方法(超声、回流、连续回流、煎煮)及不同提取溶剂(甲醇、水、乙醇)进行实验比较，结果发现超声处理与加热回流结合的提取方式所得的样品有效成分较多且杂质较少，故采用超声处理与加热回流相结合的提取方法：对提取溶剂的考察中发现95％乙醇提取物色谱图信息量最多，成分含量高，所以选用95％乙醇进行提取。2.在色谱条件进行优化方面本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取210nm、254nm、280nm、345nm处的色谱图，发现检测波长为254nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选取254nm为检测波长；3、流动相的优化：本发明比较了甲醇-乙腈、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、甲醇-0.1％冰醋酸水、乙腈-0.1％冰醋酸水7个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果，结果发现以乙腈-含0.1％体积磷酸的水为流动相时，苓桂术甘汤中各成分能达到较好的分离效果，故最终选定以乙腈-含0.1％体积磷酸的水为流动相。4、梯度洗脱筛选由于苓桂术甘汤活性成分复杂，且含有大量成分不明的杂质，普通洗脱方式在色谱柱难以达到好的分离度。本发明通过大量实验筛选其梯度洗脱方式，得到最佳的梯度洗脱程序，可使各化合物进行有效分离。有益效果：1、本发明根据苓桂术甘汤中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、梯度洗脱程序、流速、检测波长、色谱柱、柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的苓桂术甘汤指纹图谱检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价苓桂术甘汤的质量，为保证其临床疗效具有重要意义。2、用本发明所提供的方法所建立的苓桂术甘汤指纹图谱，能有效地表征苓桂术甘汤的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定苓桂术甘汤质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。3、本发明提供的苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现好等优点。附图说明图1为本发明的对照品的色谱图。图2为本发明的苓桂术甘汤样品的10批次供试品指纹图谱。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所述试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例用到的仪器与试剂如下：实验器材1.1仪器日本岛津公司全波段扫描(200-800nm)高效液相色谱系统，，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统prominencesil-20a，二极管阵列检测器spd-m20a和自动温控柱温箱cto-20a，kq3200db型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，bp121s电子分析天平(sartorius)。1.2药品与试剂10批苓桂术甘汤样品的药材见表2；甘草苷(批号180808南京森贝伽生物科技有限公司)；肉桂酸(批号180607南京森贝伽生物科技有限公司)；反式肉桂醛(批号180910南京森贝伽生物科技有限公司)；甲醇(分析纯)；磷酸(分析纯)；乙腈(分析纯)。实施例11、一种苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、苓桂术甘汤供试品溶液的制备：精密称取10批次的茯苓、桂枝、白术与甘草药材，其中茯苓40g、桂枝30g、白术20g与甘草20g。加入1l水超声提取，过滤收集药液，旋转蒸发药液至干，加入4倍量95％乙醇加热回流提取3h，过滤取上清液，水浴蒸干后加入20ml甲醇溶液溶解，过0.45μm微孔滤膜，得10批供试品溶液；步骤2、对照品溶液的制备：，步骤2中对照品溶液的制备方法为：取精密称定的甘草苷、肉桂酸与反式肉桂醛对照品，置于容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀，制成甘草苷0.265mg/ml、肉桂酸0.28mg/ml、反式肉桂醛0.315mg/ml的混合对照品溶液；步骤3、分别精密吸取步骤1的10批供试品溶液和步骤2的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图(对照品色谱图如图1)；步骤4、将步骤3中获得的10批次的苓桂术甘汤的hplc数据导出为aia格式，导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统2004版”，生成标准指纹图谱，进行指纹图谱相似度评价。10个样品的指纹图谱共有模式见图2，指纹图谱中选择6个共有峰作为苓桂术甘汤指纹图谱的特征峰，6个共有峰中对照品甘草苷为2号峰，保留时间为31.132分钟，对照品肉桂酸为5号峰，相对保留时间为46.605分钟，对照品反式肉桂醛为6号峰，相对保留时间为61.179分钟，1号峰保留时间为30.288分钟，3号峰保留时间为33.157分钟，4号峰的保留时间为38.039分钟。步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱为ymc-pack-ods-a的c18色谱柱；流动相：乙腈为a相和含0.1％体积磷酸的水为b相，二极管阵列检测器，检测波长254nm，流速0.6ml/min，进样体积：10μl，梯度洗脱程序如下表1：表1梯度洗脱程序程序时间(min)a相体积/％b相体积/％1059523035653353565465455559045556951000795100010批苓桂术甘汤共有峰相对保留时间如表3，苓桂术甘汤共有峰相对峰面积如表4，相似度评价结果见表5。根据指纹图谱相似度评价结果显示，不同批次的苓桂术甘汤具有一定的差异，研究结果显示，指纹图谱相似度分析可以用于区分不同批次的苓桂术甘汤，可以用于苓桂术甘汤的质量控制。表2十批次苓桂术甘汤药材来源表3苓桂术甘汤共有峰相对保留时间编号峰1峰2峰3峰4峰5峰6s130.40331.08933.10938.11046.54261.166s230.17631.02633.04538.07446.51561.086s330.19631.15233.15336.32746.90160.971s430.14931.10433.16338.12246.66741.017s530.26331.31733.15138.35246.62161.226s630.29831.16933.13638.14746.58360.970s730.11231.10533.18338.21446.62361.187s830.31831.15233.28838.50346.62061.755s930.57631.07833.17938.28146.40360.987s1030.38931.13333.16338.27746.58161.427平均值30.28831.13233.15738.03946.60661.179rsd0.460.240.180.160.270.40表4苓桂术甘汤共有峰相对峰面积编号峰1峰2峰3峰4峰5峰6s11191794714555313664482470476521945452921472056s21185625214984621685547276406981948014722754759s31209591614215997637254170734721982298622695921s4118428751414084640327573350011955179221911082s51211547514495661659105573877862066402222773991s61179985414467159635742175625742013856521773316s71198192714812755629401973320181972853021972451s81183625814571266668796174927671997424520978411s91207145214234209638637475855261988846122458205s101185195614703105662477476022392034772621212586平均值1193699114575506652177174059731990510022000277rsd1.01.652.812.871.962.91。表5不同批次苓桂术甘汤指纹图谱相似度实施例2方法学考察1.精密度实验精密吸取实施例1下的对照品溶液，按实施例1下色谱条件连续进样6次，其主要共有峰保留时间的rsd均小于0.95％，相对峰面积rsd均小于2.44％，表明仪器的精密度良好。具体实验结果见表6和表7。表6相对保留时间序号峰1峰2峰3峰4峰5峰6130.22831.12733.15638.20946.37761.193230.50731.09633.25338.18546.18261.137330.10331.22433.08738.31146.13461.353430.86231.03433.07638.40946.13861.527530.13031.52533.17438.24446.27161.556630.24631.43133.10938.13946.19361.468平均值30.34631.23933.14238.24946.21561.372rsd0.950.630.200.250.200.28。表7相对峰面积序号峰1峰2峰3峰4峰5峰6111842156142287466533728758805519714845212159132117852461426229865899017192076199213752158925431198557414397421660754374361201996138520993681411953664146948866579577759237820015744218741165120029811469320864551227701706198637322197330961188552114227717654436673847451977626321964736平均值1190919014417379655170674825131987555721601834rsd0.721.540.832.440.571.92。2、稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样进行测定，其主要共有峰相对保留时间的rsd均小于0.61％、相对峰面积rsd均小于2.93％，结果表明：供试品溶液在24h内稳定。具体实验结果见表8和表9。表8相对保留时间序号峰1峰2峰3峰4峰5峰6130.55431.08633.21238.15446.23661.112230.27931.11433.27738.11046.3061.875330.44831.15833.37138.20446.38561.391430.27131.14833.04738.28846.37461.557530.06831.35033.43638.15646.42161.318630.53731.33732.98838.50046.22361.260平均值30.35931.19833.22138.21846.32361.418rsd0.610.360.530.410.180.43。表9相对峰面积3、重复性试验结果精密吸取同一批样品，按照实施例1下方法制备供试品溶液，以实施例1下的色谱条件进样，其主要共有峰相对保留时间的rsd均小于1.02％，相对峰面积rsd均小于2.74％，表明方法的重复性良好。具体实施例结果见表10和表11。表10相对保留时间序号峰1峰2峰3峰4峰5峰6130.10131.14233.26738.10746.18361.228230.08631.27733.21938.32446.07761.031330.58231.23433.17538.35246.26461.169430.81731.34233.32438.17946.36961.137530.69631.17033.31138.19146.62161.308630.61631.18433.18538.24746.25561.370平均值30.48331.22433.24638.23346.29461.207rsd1.020.230.190.240.400.19。表11相对峰面积序号峰1峰2峰3峰4峰5峰61121113351457882463381807638741200193702155581422119401581473966365325917668217210254382092987331195742514342756634792973558242008763921152220412005775149401726585527770022520526933208572475118357421466150166410027698741199779462147952861196224715526335644574275830892014775221647930平均值1196878014798208648182876074722029751321270435rsd0.752.741.931.712.001.58。以上实验结果表明，本发明提供的苓桂术甘汤指纹图谱检测方法，稳定性好、精密度高、重复性好，能全面客观评价苓桂术甘汤的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本发明技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。当前第1页12