基于超高效液相色谱的单面针质量控制方法与流程

本发明属于中药质量控制技术领域。更具体地，涉及一种基于超高效液相色谱的单面针质量控制方法。

背景技术：

单面针为芸香科植物蚬壳花椒zanthoxylumdissitumhemsley或刺壳花椒z.echinocarpumhemsley的干燥根和茎，两面针为芸香科植物两面针zanthoxylumnitidum(roxb.)dc.的干燥根。二者生长于我国广东、广西、湖南、云南等山地林中。具活血散瘀、祛风活络、续筋接骨之功效，用于治疗跌打损伤，骨折等。目前单面针作为妇科千金片的主要组方成分应用于临床，主要治疗子宫内膜炎、盆腔炎、慢性宫颈炎等妇科疾病。通过对单面针的研究发现，单面针具有抗菌抗乳腺癌等活性。两面针做为我国历史悠久的传统中药，已经被《中国药典》所收录。

单面针与两面针的化学成分及活性比较相似，因单面针缺乏完善的质量控制标准，而造成单面针与两面针混淆使用严重的现象，因此，单面针与两面针的比较研究亦越来越受到重视。

至今为止，单面针未被《中国药典》所收录，仅在《中国药典》中收录的妇科千金片处方中出现。《湖南中药材标准》(2009版)中收载了单面针药材标准，其药用部位为蚬壳花椒及刺壳花椒的根和茎，但仍缺乏专属性和可定量的指标，无含量测定项。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有单面针质量控制标准的薄弱，在原有单面针的质量标准研究基础上，增加了指纹图谱项，采用具有分析速度快、高灵敏度超高效液相色谱(uplc)技术，结合pca、opls-da的化学计量学方法分析单面针与两面针uplc指纹图谱，筛选出二者差异性的化学成分，同时对其含量进行测定，明确了质量控制检测标志物及其含量标准，建立了一套单面针饮片的质量控制标准，为单面针的药效物质基础和单面针的质量控制提供科学依据。

本发明的目的是提供一种基于超高效液相色谱的单面针质量控制方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种基于超高效液相色谱的单面针质量控制方法，是利用uplc技术检测饮片氯化两面针碱含量，氯化两面针碱的质量比含量要求不低于0.001％。

优选地，还可同时利用uplc技术检测饮片木兰花碱含量。

更优选地，还可同时利用uplc技术检测饮片白藓碱含量。

即上述的基于uplc的单面针质量控制方法中，检测标志物可以是如下三种方案：(1)检测氯化两面针碱的含量；(2)同时检测氯化两面针碱和木兰花碱的含量；(3)同时检测氯化两面针碱、木兰花碱和白藓碱的含量。

木兰花碱的质量比含量要求不低于0.1％。

白藓碱的质量比含量要求不低于0.0003％。

其中，所述uplc的色谱条件如下：

色谱柱：acquityuplcbehc18，柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm；acquityuplcshueldpr18；acquityuplccshc18；或acquityuplccortecsc18+；

流动相a为甲醇，流动相b为含有0.1％甲酸水；

梯度洗脱条件如下所示：

流速为0.3ml/min；柱温为30℃；检测波长为273nm。

另外，优选地，在上述uplc检测方法中，供试样品的提取条件为：液料比50:1～6:1，超声提取25～55min。

更优选地，在上述uplc检测方法中，供试样品的提取条件为：液料比10:1，超声提取45min。

优选地，在上述uplc检测方法中，供试样品溶液的制备方法为：样品40～60℃真空干燥至恒重，粉碎，过40～60目筛，按照50：1～6:1液料比，用30～90％甲醇浸泡12～24h，200～300w、40～100khz超声处理25～55min。

更优选地，在上述uplc检测方法中，供试样品溶液的制备方法为：样品45℃真空干燥至恒重，粉碎，过40目筛，按照10:1液料比，用70％甲醇浸泡12h，200w、40khz超声处理45min。

优选地，在上述uplc检测方法中，对照品溶液的制备：将氯化两面针碱、木兰花碱或白藓碱对照品分别加入甲醇中，分别制成0.2～2.0mg/ml的溶液。

更优选地，在上述uplc检测方法中，对照品溶液的制备：将氯化两面针碱对照品加入甲醇中制成0.2mg/ml的溶液。

优选地，在上述uplc检测方法中，上样量为1～5μl(优选2μl)。

另外，具体检测是将对照品溶液和供试品溶液各2μl分别注入高效液相色谱仪，测定，记录35分钟色谱图，供试品指纹图谱中，应分别呈现与对照品色谱保留时间相应的色谱峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算2～32分钟的色谱峰，供试品指纹图谱与对照品指纹图谱相似度不得低于0.90。

本发明上述单面针饮片质量标准的建立方法，包括如下步骤：

s1.样品收集：

s11.收集以下产地的单面针样品：陕西省汉中市南郊区、广东省广州市天河区、陕西省榆林市青云镇、湖南省吉首市双塘镇、陕西省安康市汉滨区、湖南省吉首市丹青镇、湖北省襄阳市保康县、湖南省湘西永顺县、湖北省襄阳市樊城区、湖南省张家界永定区、湖北省襄阳市南漳县、广东省广州市南沙区、四川省眉山市青神县、广西省南宁市江南区、四川省资阳市资中县、湖南省吉首市河溪镇、广西省来宾市象州县、湖南省湘西州永顺县、广西省玉林市玉州区、广西省桂林市资源县、广东省陆丰市碣石镇、湖南省湘西州花垣县、广东省广州市海珠区、湖南省湘西州芦溪县、广东省广州市番禺区；

s12.收集以下产地的两面针样品：广西玉林、湖南湘潭、湖南株洲、湖南岳阳、广西贺州、广西南宁、湖南常德、广东佛山、广东汕头、广东广州、广东清远、广东珠海、湖南长沙、湖北荆州、安徽亳州；

s2.制备供试品溶液和对照品溶液，方法分别如上文所述；

s3.以精密度试验、重复性试验、稳定性试验、标准曲线试验、加样回收试验确定uplc色谱条件，如上文所述；

s4.将供试品溶液按照s3的色谱条件进行uplc检测，建立指纹图谱；

s5.经过对指纹图谱分析、主成分分析和正交最小偏二乘-判别分析，筛选鉴定差异标记物，确定单面针有别于两面针的指标性成分，即白藓碱、木兰花碱、氯化两面针碱；

s6.确定s5所述指标性成分的含量标准，即氯化两面针碱的质量比含量不低于0.001％、木兰花碱的含量不低于0.1％、白藓碱的含量不低于0.0003％。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种基于超高效液相色谱的单面针质量控制方法，首次利用uplc技术建立了不同产地单面针及两面针的共同指纹图谱，并对差异性的生物碱进行了定性定量分析。给出了如下三种单面针饮片质量控制标准：

(1)样品中氯化两面针碱的含量不低于0.001％；

(2)样品中氯化两面针碱的含量不低于0.001％，且木兰花碱的含量不低于0.1％；

(3)样品中氯化两面针碱的含量不低于0.001％，且木兰花碱的含量不低于0.1％，白藓碱的含量不低于0.0003％。

与现有hplc建立的指纹图谱相比，具有分析速度快，时间可明显缩短，35min即可完成分析，灵敏度高，分离效果佳，能显示出样品中各成分的信息，较直观反映药材质量。

经实验验证，该方法重复性好，可操作性强，可用于单面针及两面针药材的特征指纹图谱的定性鉴别，结合二者共有生物碱含量测定结果，可确定出单面针的化合物最低及最高限量的界限，为单面针的含量测定项提取依据，为单面针质量控制提供了提供科学依据和切实可行的质量控制标准。

附图说明

图1为25批单面针(s1～s25)uplc叠加图谱及其对照指纹图谱。

图2为15批两面针(s26～s40)uplc叠加图及其对照指纹图谱。

图3为单面针(a)及两面针(b)的共有峰和特征峰及混合对照品c(273nm)、d(246nm)；注：7-木兰花碱(7-(+)-magnoflorine)，14-氯化两面针碱(14-nitidinechloride)，16-白藓碱(16-dictamnine)。

图4为主成分分析得分图。

图5为opls-da散点图。

图6为差异标志物的vip。

图7为混合对照品(246nm)：注：7-木兰花碱((+)-magnoflorine)，14-氯化两面针碱(nitidinechloride)，16-白藓碱(dictamnine)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1单面针饮片的质量标准控制方法——指纹图谱和含量测定

一、材料

1.1仪器

watersacquityuplch-class超高效液相色谱系统，empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器(waters公司)。sqp型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，p20-y实验室超纯水机(湖南科尔顿水务有限公司)，kq-500de型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，sz-500a-3超高速多功能粉碎机(永康市善竹贸易有限公司)，scaa-104(13mm，0.22μm)有机相针式滤器(上海安谱实验科技股份有限公司)等。

1.2试剂

对照品木兰花碱(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号，m-026-170612，纯度≥98％)，氯化两面针碱(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号l-031-161216，纯度≥98％)，白藓碱(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号b-036-161216，纯度≥98％)。甲醇(德国merck公司，色谱纯)，甲酸(天津市化学试剂研究所，分析纯)，水为超纯水。

1.3药材

单面针饮片由株洲千金药业股份有限公司提供。两面针饮片购于全国各大连锁药店、医药公司及药材市场，经湖南中医药大学药学院药用植物教研室刘塔斯教授与中药鉴定教研室龚力民副教授共同鉴定为为芸香科花椒属科植物蚬壳花椒zanthoxylumdissitumhemsley及两面针zanthoxylumnitidum(roxb.)dc.的茎，采集信息见表1、2。

表1单面针样品来源

表2两面针样品来源

二、实验方法

2.1溶液的制备

2.1.1供试品溶液的制备

分别取25批单面针样品、15批两面针样品，置真空干燥箱中45℃干燥至恒重，粉碎，过40目筛，精密称取单面针及两面针粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇5ml，密塞，称定重量，浸泡12h，超声处理(功率200w，频率40khz)45min，放冷，称定重量，以70％甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.22μm)过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.2对照品溶液的制备

密称取干燥至恒重质量的木兰花碱、氯化两面针碱、白藓碱对照品适量，分别置于25ml容量瓶中，加甲醇充分溶解，定容，分别制得各浓度为2mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml的木兰花碱、氯化两面针碱、白藓碱对照品溶液，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得各对照品储备液，再将各储备液稀释得0.2mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml的木兰花碱、氯化两面针碱、白藓碱对照品溶液。

2.2色谱条件

色谱柱为acquityuplcbehc18(2.1mm×100mm，1.7μm)。以甲醇(a)-0.1％甲酸水(b)为流动相进行梯度洗脱，优化的梯度条件(表3)；流速0.3ml/min；柱温：30℃；检测波长273nm；进样量2μl。

表3梯度洗脱条件

2.3方法学考察

2.3.1精密度试验取同一批(s17)单面针样品，按“2.1.1”项下制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，连续进样6次，检测指纹图谱，木兰花碱、氯化两面针碱、白藓碱各相对峰面积的rsd值为0.84％～1.22％，相对保留时间rsd值为0.07％～0.47％，表明仪器精密度良好。

2.3.2重复性试验取同一批(s17)单面针样品6份，按“2.1.1”项下制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，木兰花碱、氯化两面针碱、白藓碱的峰面积rsd值分别为0.63％、0.81％、1.09％，表明处理方法的重复性良好。

2.3.3稳定性试验取同一批(s17)单面针样品，按“2.1.1”项下制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12h按“2.2”项下色谱条件测定，木兰花碱、氯化两面针碱、白藓碱的峰面积rsd值分别为1.03％、0.97％、1.16％，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.4指纹图谱的建立

将单面针样品25批与15批两面样品，分别按“2.1.1”项下制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行分析。分别将二者得到的参照指纹图谱进行共有峰和特征峰的标定及部分差异性成分峰的归属。

2.5标准曲线的绘制

分别精密移取木兰花碱储备液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8ml，加甲醇稀释定容制10、10、10、5、5、5ml，得到浓度分别为0.06、0.12、0.18、0.48、0.60、0.72mg/ml系列标准品溶液，分别按照2.2项下的色谱条件进行高效液相色谱仪分析，以峰面积(y)对标准品浓度(x)进行线性回归，得到回归方程y＝7.36×10⁶x+4.38×10⁴，r＝0.9997，在7.53～950/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。精密移取氯化两面针碱对照品溶液1、0.5、0.25ml置10ml容量瓶中，加甲醇稀释定容得标准液1、2、3，精密吸取2、3溶液各2.5ml，分别置10ml容量瓶中，加甲醇稀释定容得标准液4、5、精密吸取4溶液2.5ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释定容得标准液6、即得浓度分别为0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2mg/ml系列标准品溶液，分别按照2.2项下的色谱条件进行高效液相色谱仪分析，以峰面积(y)对标准品浓度(x)进行线性回归，得到回归方程y＝14.85×10⁶x+3.1×10⁴，r＝0.9994，在1.25～203/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。精密移取白藓碱对照品溶液1ml置100ml容量瓶中，加甲醇定容，得浓度为0.01mg/ml溶液，精密移取此浓度标准溶液1、2、4、6、8、10ml，置10ml容量瓶中，加甲醇定容，即得浓度分别为0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010mg/ml系列标准品溶液，分别按照2.2项下的色谱条件进行高效液相色谱仪分析，以峰面积(y)对标准品浓度(x)进行线性回归，得到回归方程y＝6.17×10⁶x+1.27×10⁴，r＝0.9993，在1.16～937/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.6加样回收率试验

精密称取已知含量的单面针样品(s17)0.5g粉末共6份，分别精密加入0.5ml浓度为0.48mg/ml的木兰花碱、0.2mg/ml氯化两面针碱、0.01mg/ml白藓碱对照品溶液，冻干样品，再按“2.1.1”项下制备供试品溶液，过滤膜，按“2.2”项下色谱条件测定分析，计算各组平均回收率及rsd，结果见表4。木兰花碱、氯化两面针碱、白藓碱的平均加样回收率分别为99.58％、97.11％、98.59％，rsd分别为0.19％、1.31％、1.10％(n＝3)，说明该方法回收率好。

表4回收率实验结果(n＝6)

2.7含量测定

精密取40批样品粉末，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液及对照品溶液各2μl进样，分别按照2.2项下的色谱条件进行高效液相色谱仪分析，测定样品中木兰花碱、氯化两面针碱、白藓碱三种生物碱的含量，每一份样品平行测定三次，记录各个生物碱峰面积分值，分别带入“2.3”项下绘制的相应标准曲线中，计算生物碱含量。

三、实验结果与分析

3.1指纹图谱的分析

将色谱结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004a版)分析，选定参照图谱，时间漂移值为0.5，采用多点校正法，平均数法将谱峰自动匹配分别得到了25批单面针样品(s1～s25为单面针)及15批两面针样品(s26～s40为两面针)的uplc叠加图谱见图1、2。同时生成单面针及两面针对照图谱，将二者对照图谱进行比较，标示出共有峰及各自的特征峰，经混合对照品图谱对照，指认其中7、14、16峰分别为木兰花碱、氯化两面针碱、白藓碱图谱见图3。通过所有药材的uplc指纹图谱、参照图谱可以看出，两者存在16个共有峰，且两者具各自的特征峰，单面针特有峰为a～c，两面针特有峰为d～j。

3.2主成分分析(pca)

经“3.1”项下指纹图谱的建立与分析，得到了40个样本及16个共有峰的峰面积数据，此原始数据不能体现出样品之间的差异，此时应考虑利用投影的方法对原始数据进行标准化后，无监督的pca分析。主成分分析是一种基于投影技术的数据分析方法。将原始数据导入simca13.0软件进行主成分分析，结果见图4，单面针药材与两面针药材明显区分趋势，两面针样品居中心线左侧，且较分散，单面针则居右侧，且明显的分布在横向中心线的上下两侧，其中单面针中样品号为s25(湖南湘西泸西县)样品与其他产地样品差异较大，两面针中样品号为s30(广西贺州市)与其他产地样品差异较大。为进一步验证该结果的可靠性，继续将数据采用有监督的情况下模式识别分析，即正交最小偏二乘-判别分析。

3.3正交最小偏二乘-判别分析(opls-da)

opls-da是一种新型的多元统计数据分析方法，它由johantrygg等人于2002年首次提出。opls-da可以提高模型的有效性和解析能力，采用有监督的情况下模式识别分析方法能倾向于提取有利于样本分类的变量信息，降低了系统噪音的干扰，提高了分类的效能。将原始数据导入simca13.0软件得到opls-da得分图(图5)中可以看出，各点以中心线为中心，明显分为两类，左侧为单面针(s1～s25)，右侧为两面针(s26～s40)，且单面针样本点较集中，而两面针样品间差异较大，则分布较离散，与相似度分析结果相符合。

3.4差异标记物的筛选以及鉴定

提取opls-da模型中16个变量的vip值，结果见图6，对16个共有峰峰面积vip值大小进行排列，分析以上各峰所代表的成分对单面针及两面针分类具有显著的影响，根据vip>1.0，p<0.05原理发现，符合要求的六个峰，分别为7、10、8、16、12、14号峰。说明这些峰所代表的成分是引起单面针与两面针差异的主要标志性成分。经过标准品对照，鉴定结果见图7，其中7号峰为木兰花碱、14号峰为氯化两面针碱、16号峰为白藓碱，其他化合物为未知物。因此，可以选择木兰花碱、氯化两面针碱、白藓碱作为研究对象，建立含量测定方法，规定其含量范围，并将其作为单面针有别于两面针的指标性成分。

3.5含量测定结果

含量测定结果见表5，可以看出，40批样品中木兰花碱含量最高，其次是氯化两面针碱，含量最低的是白藓碱。采用spss21.0软件，对3种生物碱成分量数据进行独立样本t检验，分析单面针与两面针的含量差异。含量最高的木兰花碱在二者之间具有显著性差异(p＜0.01)，氯化两面针碱与相对含量较低的白藓碱，在二者之间的含量也具有显著性差异(p＜0.01)。结合差异标记物的筛选以及鉴定结果得出，这三者均包含在差异性的标志物中，且木兰花碱表现出最大差异性。因此，可以将该成分可以作为区分单面针与两面针的重要指标性成分，含量测定的结果对规范单面针的质量标准发挥了极其重要的作用。

表5测定结果(n＝3，mg.g^-1)

根据含量测定结果，建议选择木兰花碱、氯化两面针碱和白藓碱作为单面针含量测定指标，且氯化两面针碱含量要求不低于0.001％，木兰花碱含量要求不低于0.1％，白藓碱的含量要求不低于0.0003％。

四、条件优化讨论

4.1检测波长的选择

采用pad二极管阵列检测器，对三种生物碱对照品进行三维图谱分析，结果表明木兰花碱、氯化两面针碱、白藓碱的最大吸收波长分别在284、273、246nm处，其中，木兰花碱、氯化两面针碱吸收值相差较近，二者吸收值与白藓碱相差较远，为提高含量测定的检测灵敏度，使用双波长同时测定的方法对其进行检测。综合各因素，最终选择在273nm处进行检测。

4.2提取工艺的考察

本实验探讨提取制备最优条件，考察了液料比例(6:1、8:1、10:1、12:1、20：1，30：1，50：1),提取溶剂(50％、70％、90％甲醇、乙醇)，超声提取(功率200w，频率40khz)时间(30min、45min、60min)一系列对药物成分的提取产生影响的因素。通过液相分析，结果表明，三种生物碱在70％甲醇中提取率较高，由于生物碱的极性较强，有机溶剂比例较少时，不利于其溶解，因此用50％甲醇提取较差。液料比10:1，超声提取45min条件下，色谱图的峰数目最多，峰面积较大，峰形较好，因此，得出该提取条件对药材中生物碱成分的提取效果最佳。

4.3流动相的选择

流动相比较了有机相甲醇、乙腈；水相比较了0.1％及0.5％的甲酸水、冰醋酸水、磷酸水溶液，结果显示，甲醇-0.1％磷酸水为流动相时，样品的分离达到要求。最终决定以甲醇-0.1％甲酸水为最佳流动相。经过多次摸索，最终确立了最佳色谱条件。