人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素与甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法与流程

文档序号:17598030发布日期:2019-05-07 19:47阅读:1589来源:国知局
人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素与甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法与流程

本发明涉及分析检测技术领域,特别涉及一种高准确度、高重现性、高灵敏度、高专属性、高效率、高通量、低成本、操作简便快速的人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素与甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法。



背景技术:

儿茶酚胺类物质即有邻苯二酚(即儿茶酚)结构的胺类化合物,包括多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素及它们的衍生物。去甲肾上腺素和肾上腺素既是肾上腺髓质所分泌的激素,又是交感神经和中枢神经系统中去甲肾上腺素能纤维的神经介质。去甲肾上腺素在中枢神经系统内分布广泛,含量较多,而肾上腺素含量则较少。多巴胺主要集中在锥体外系部位,也是一种神经介质。以上儿茶酚胺类物质都是重要的典型肾上腺素受体激动剂。儿茶酚胺类物质在体内调节基本生理功能,传递生理信号,是正常生理过程中重要的信号介质,同时在病理过程中其含量也会出现明显的变化。因此它们可以用于临床辅助诊断高血压、甲亢、嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤等内分泌相关疾病,其代谢产物甲氧基肾上腺素(mn)以及甲氧基去甲肾上腺素(nmn)对诊断嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤有极高的敏感度与准确度,是内分泌科指南推荐的首选检测指标。

目前常用的测定人血浆中的儿茶酚胺代谢产物的方法主要有放射酶学法、毛细管电泳法、荧光法以及高效液相色谱法等等;主要存在以下几点问题和缺点:

1、放射酶学法试剂昂贵,不能满足临床大批量检测的需求;

2、毛细管电泳法前处理包括渗析和离心等操作,且需进行毛细管修饰,以防止儿茶酚胺类物质与毛细管壁发生作用,因此该方法繁琐耗时,检测难度和成本较高;

3、儿茶酚胺类化合物的荧光较弱,且生物样本中含量极低,因此荧光法需额外的衍生化处理来加强荧光信号,较繁琐耗时;

4、液相色谱法需要相对复杂的前处理过程,以分离生物样本中杂质成分、费时费力,且灵敏度较低、分析时间长,检测通量低,基质干扰严重,特异性差,自动化程度低。

与传统检测方法相比,高效液相串联质谱法具有高特异性和高灵敏度等优势,但是现有两个公开的儿茶酚胺类化合物的液相色谱串联质谱检测方法,其存在以下的缺陷不足:

1.国家知识产权局网站上公开的“用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺及代谢产物的方法”,其包括固相萃取处理和质谱正离子模式扫描可同时检测6种儿茶酚胺类物质,该方法具有以下缺陷:(1)未规定使用结构一致的稳定同位素标记物内标。参考液相质谱方法检测临床指导原则,内标应选择待测物结构一致的稳定同位素标记物,以校正质谱分析过程中基质效应以及样本提取、色谱分离和离子化过程产生的偏差,其他类型的化合物内标可能影响检测结果的准确性;(2)采用正离子扫描模式进行定量,而未使用指导原则规定的母离子和子离子筛选的多反应监测模式(mrm)。与mrm模式相比较,正离子扫描模式易受到生物样本的复杂基质的干扰,方法的特异性和专属性相对较差。

2.国家知识产权局网站上公开的“高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及检测4种儿茶酚胺代谢物的方法”,方法包括s1样品制备、s2衍生化反应、s3样品前处理、s4液相色谱分离以及s5串联质谱检测等步骤,该方法具有以下缺陷:(1)前处理过程复杂,包括蛋白沉淀、真空冷冻干燥处理和衍生化反应等流程,繁琐耗时,仪器和试剂成本较高,不适合临床大批量样本分析;(2)对于nmn的检测,未使用结构一致的同位素标记物内标,可能影响实际临床样本检测的准确度和精密度;(3)样本的仪器分析时间较长,单个样本的分析需15min,效率较低,不适合临床大批量样本的检测。



技术实现要素:

本发明的目的是解决现有技术存在的部分问题,提供一种人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法,该方法具有高效率、高通量、高灵敏度、操作简便、特异性强、准确度高、灵敏度高、检测成本低的优点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的:人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素与甲氧基肾上腺素的高效液相色谱串联质谱检测方法,包括如下步骤:

(1)样本预处理:取100~500μl人血浆,依次加入10~50μl内标工作液和0.1~1ml50mmph=8醋酸铵溶液,涡旋振荡30秒,4000rpm离心5分钟;

(2)取弱阳离子交换固相萃取96孔板,依次加入200μl甲醇与水淋洗,待其自然流干;

(3)固相萃取过程:将步骤(1)处理后的样品转移到步骤(2)处理后的spe96孔板上,用氮气正压装置压干,依次加入50~500μl50mm醋酸铵溶液(ph=8)和50~500μl乙腈进行淋洗;再加入200μl5%甲酸乙腈溶液洗脱,用96孔接收板收集洗脱液,通25~60℃氮气直至干燥;

(4)将步骤(3)得到的残渣,进一步用50~200μl复溶溶液复溶,涡旋使充分溶解,上高效液相色谱串联质谱系统进样5~50μl分析检测。

优选地,所述步骤(1)中内标工作液的配置方法如下:用0.5%焦亚硫酸钠溶液配置浓度为1mg/ml的氘代甲氧基去甲肾上腺素(nmn-d3)和氘代甲氧基肾上腺素(mn-d3)的内标储备液,然后用0.1%甲酸溶液进一步稀释混合得到含有nmn-d3浓度为10ng/ml和mn-d3的浓度为1ng/ml的内标工作液。

优选地,所述步骤(4)中的复溶溶液为甲酸和乙腈的混合物,其体积比为1:1000。

优选地,所述步骤(4)所述的高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪。

优选地,所述步骤(4)通过高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液,采用梯度洗脱正相色谱法建立待测物的分离条件如下:以水-乙腈-甲酸铵-甲酸为流动相体系,色谱柱为silica柱,流速为0.4~1ml/min,柱温为30~45℃,采用多反应监测扫描模式(mrm)分析定量。

优选地,所述高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液使用的流动相由以下流动相a和流动相b组成;其中流动相a为体积分数0.1%甲酸-30mm甲酸铵溶液,流动相b为体积分数0.1%甲酸乙腈溶液,流动相a和流动相b的体积比为5~22:95~78%。

优选地,所述色谱柱的填料为silica柱,填料粒径为1.7~5μm,内径为2.1~4.6mm,柱长为25~150mm。

优选地,所述步骤(4)中,质谱检测采用电喷雾电离源(esi)和mrm模式,用于检测甲氧基去甲肾上腺素(nmn)与甲氧基肾上腺素(mn)的母离子/子离子检测离子对如下所示:nmn,m/z166.1>m/z134.1和m/z166.1>m/z121.1;mn,m/z180.0>m/z149.1和m/z180.0>m/z120.9;内标nmn-d3的检测离子对为m/z169.1>m/z137.1;内标mn-d3的检测离子对为m/z183.1>m/z151.1。

基于上述的实验条件,经过多次试验验证,本发明的精密度rsd%<15%。

与现有技术相比,本发明的有益效果如下所示:

与传统检测相比,高效液相串联质谱法具有以下优点:(1)高特异性:在检测时可有效降低生物基质中复杂组分的干扰与影响,从而简化样本前处理过程;(2)高灵敏度,定量下限可以达到pg/ml级别;(3)自动化和高通量:液质联用仪配有自动进样系统,样品测定可以24小时不间断进行,可实现自动化、高通量,从而满足医院检验科及第三方医学检验单位的实际检测需求;(4)前处理过程相对简单:检测过程中不需要与干扰组分完全分离即可完成准确定量分析,可简化复杂的前处理提取和衍生化操作过程。

与现有的质谱检测方法比较,本发明所述的一种人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素(nmn)与甲氧基肾上腺素(mn)的高效液相色谱串联质谱检测方法,具有以下几个显著的优点(1)使用稳定同位素标记物作为内标,检测结果更准确重现性更好:本方法采用mn和nmn结构一致的同位素标记物内标,可有效校正实际临床样本的基质效应的影响(如高脂质,肝肾功能受损患者的基质和溶血),确保检测结果的准确性;(2)本方法参考液相质谱临床检测指导原则采用母离子和子离子筛选的多反应监测模式(mrm)进行检测,通过对特征母离子和子离子的筛选,从而有效降低生物样本中复杂组分的干扰,提高方法的专属性和灵敏度。此外,通过吹干浓缩处理,使nmn灵敏度从20pg/ml提高到10pg/ml;(3)本方法检测单个样本的仪器分析时间仅为5分钟,较传统高效液相色谱法大大缩短。前处理采用96孔板,大大提高操作效率;此外结合使用液质联用仪的自动进样系统,可实现自动化和高通量检测;(4)样本前处理过程简单,采用弱阳离子交换固相萃取方法来处理样本,对儿茶酚胺类物质具有较高的回收率,同时有效降低样本中复杂基质的干扰,获得更好的灵敏度;此外,使用的试剂耗材常规易于获得且成本低,不需要复杂的衍生化操作。

总之,本方法可快速及时的检测人血浆中甲氧基去甲肾上腺素(nmn)与甲氧基肾上腺素(mn)的浓度,为临床疾病的诊断提供了准确的检验结果。与现有方法相比较,本方法具有高准确度、高重现性、高灵敏度、高效率、操作简便等优点,适合于临床推广,具有广泛的临床应用价值。

附图说明:

图1a和图1b分别是检测20pg/mlnmn和10pg/mlmn的定量下限的色谱图;

图2a和图2b分别是nmn和mn的标准曲线。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明用于人血浆中甲氧基肾上腺素(mn)与甲氧基去甲肾上腺素(nmn)检测的具体实现过程。应理解,实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围,下列实施例中未提及的具体实验方法,通常按照常规实验方法进行。

实施例:一种人血浆中游离甲氧基去甲肾上腺素(nmn)与甲氧基肾上腺素(mn)的高效液相色谱串联质谱检测方法。

一、溶液配置

标准工作液配置:精密称取nmn和mn标准品,加入0.5%焦亚硫酸钠溶液溶解得到浓度为10mg/ml的一级储备液,然后用0.1%甲酸溶液进一步稀释为浓度为10μg/ml的mn和nmn的二级储备液;取适量的0.1%甲酸溶液置于2ml的离心管中,再依次加入适量的nmn和mn的二级储备液到该离心管中,涡旋混合10s,得到nmn浓度为50ng/ml,mn浓度为25ng/ml的混合三级储备液,将三级储备液用4%bsa溶液稀释配置得到系列标准工作液,具体浓度如下表1。

表1标准曲线浓度

内标工作液配置:精密称取2种内标标准品,加入0.5%焦亚硫酸钠溶液溶解稀释成1mg/ml的氘代甲氧基去甲肾上腺素(nmn-d3)和氘代甲氧基肾上腺素(mn-d3)的内标储备液,然后用0.1%甲酸溶液进一步稀释混合得到nmn-d3浓度为10ng/ml和mn-d3浓度为1ng/ml的内标工作液。

二、具体操作步骤:

(1)取血浆500μl,依次加入15μl内标工作液与500μl50mm醋酸铵溶液(ph=8),涡旋混匀,4000rpm离心5min;

(2)弱阳离子交换固相萃取96孔板(spe96孔板),孔中依次加入200μl甲醇与水,待其自然流干;

(3)将步骤(1)处理所得的样品加入到步骤(2)活化好的spe96孔板中,用氮气正压装置缓慢压干,依次加入200μl50mm醋酸铵溶液(ph=8)和乙腈进行淋洗,氮气正压装置压干,然后加入200μl5%甲酸乙腈溶液进行洗脱,用96孔接收板收集洗脱液,置于氮吹仪下通40℃氮气直至干燥;

(4)步骤(3)得到的残渣,加入80μl复溶溶液复溶,涡旋使充分溶解,上高效液相色谱串联质谱联用系统进样35μl分析;

步骤(4)中的复溶溶液为甲酸和乙腈的混合物,其体积比为1:1000;

步骤(4)所述的质谱为三重四级杆质谱仪;

步骤(4)通过高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液,采用梯度洗脱正相色谱法建立待测物的分离条件如下:色谱柱为venusilxbpsilica(a)(3μm,2.1×100mm,150a),流速为0.6ml/min,柱温为30℃;

流动相a为含体积分数0.1%甲酸-30mm醋酸铵溶液,流动相b为体积分数0.1%甲酸乙腈溶液;a相∶b相体积比为5~22%:95~78%,流速为0.6ml/min,按表2梯度程序洗脱;

表2:梯度洗脱程序

nmn和mn的保留时间均为2.75min。

质谱条件如表3所示;

表3质谱条件

按以上液相条件分离后,采用电喷雾电离源(esi)和mrm模式进行质谱检测,其中甲氧基肾上腺素(mn)和甲氧基去甲肾上腺素(nmn)的母离子/子离子检测离子对如下所示:mn,m/z180.0>m/z149.1和m/z180.0>m/z120.9;nmn,m/z166.1>m/z134.1和m/z166.1>m/z121.1;内标nmn-d3与mn-d3的检测离子对为:nmn-d3,m/z169.1>m/z137.1;mn-d3,m/z183.1>m/z151.1。以上检测离子对的mrm质谱参数如表4所示;

表4检测离子对质谱mrm参数

图1a和图1b分别是检测20pg/mlnmn和10pg/mlmn的定量下限的色谱图;

采用内标法建立标准曲线。如图2a、图2b、和表5可知,nmn在20~1000pg/ml的线性范围内,mn在10~500pg/ml线性相关性良好,相关系数r分别为0.9992和0.9995,准确度范围分别为91.1%-111%和93.7%-111%。

表5:标准曲线结果

本发明已用于临床批量样本的检验测定,结果表明该方法线性范围能够满足临床检验的需要。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非对本发明保护范围的限制,在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

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