适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统的制作方法

本实用新型涉及医疗器械技术领域，尤其涉及一种适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统。

背景技术：

Exosome，中文名外泌体，是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约40-100nm。尽管外泌体最初在1983年就被发现，但人们一直认为它只是一种细胞的废弃物。然而最近几年，人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。这些发现点燃了人们对细胞分泌膜泡的兴趣。最近的研究发现外泌体在很多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。外泌体具有脂质双层膜结构，能很好的保护其包被的物质，且能靶向特定细胞或组织，因此是一种很好靶向给药系统。外泌体作为一个新型的研究热点，由于它在体内存在的广泛性和获取的便捷性，已经成为了疾病诊断、治疗的潜在有效方式，在精准医学发展上有着光明的前景。

尿液作为一种无创的检测标本的来源，越来越受到大家的关注。尿液中的外泌体携带有肾脏结构和功能损伤的分子标记物，有助于肾脏疾病的诊断；尿液外泌体蛋白组学的研究有助于相关疾病病理生理机制的研究，有助于寻找潜在的新的疾病治疗靶点。

目前国内外报道分离外泌体的主要方法是超速离心法。超高速离心分离提取尿液外泌体步骤:

1、17000xg centrifugation(离心力为17000xg进行离心分离):分离细胞，大的细胞碎片：

1.1、17000xg for 10min at 37℃(进行离心分离，离心力为17000xg，温度为37℃、分离时间为10分钟)；

1.2、保留上清液，这是上清液1；

1.3、用分离液沉淀重悬(根据沉淀的多少加入适量分离液),往沉淀悬液中加入DTT,使其终浓度为200mg/ml

1.4、37℃水浴沉淀悬液for 5-10min(时间为5～10分钟),每隔1-2min(1～2 分钟)涡旋一次,直至沉淀完全溶解

1.5、将沉淀悬液转移至离心管，17000xg for 10min at 37℃(进行离心分离，离心力为17000xg，温度为37℃、分离时间为10分钟)，收集上清液2。

2、200000xg centrifugation(离心力为200000xg进行离心分离):使细胞外囊泡沉淀：

2.1、将上清液1和上清液2收集到一起，在离心力为200000xg下温度为 37℃离心1h(1小时)

3、Resuspension of extracellular vesicles(重悬细胞外囊泡)

3.1、将上清丢弃

3.2、用PBS(phosphate buffer saline,磷酸缓冲盐溶液)重悬细胞外囊泡。

超速离心法需要的超速离心机只有著名大学、部分科研机构、部分发达地区的三甲医院拥有，使得这一方法使用受限；其次，该方法一次处理样本量有限。

综上所述，目前仍缺少一种可推广至基层医院的将尿液细胞外外泌体富集用于糖尿病肾病早期诊断的装置。

技术实现要素：

针对上述的缺陷，本实用新型的目的在于提供一种适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统，成本低廉，富集过程中，很好的保持了外泌体自身的物理和化学特性，为后续研究提供更为准确的信息。

为了实现上述目的，本实用新型提供一种适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统，包括：

低速离心机，将所述尿液进行低速离心处理产生上清液；

滤过膜滤过系统，用于过滤所述上清液中除外泌体外的杂质，与所述低速离心机分体设置，其对应于第一过滤阶段设置有第一过滤单元；对应于第二过滤阶段设置有第二过滤单元。

根据所述的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统，所述第一过滤阶段的第一被截留物质为除外泌体以外的细胞外囊泡以及杂质，所述第一过滤单元为孔径大小为0.22微米的第一滤过膜；

所述第二过滤阶段的第二被截留物质为外泌体，所述第二过滤单元为截留分子量为1000KDa的第二滤过膜。

根据所述的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统，所述第一滤过膜的长度为30～35厘米。

根据所述的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统，所述滤过膜滤过系统还包括：

漏斗，所述第一过滤阶段时，所述第一滤过膜附着于所述漏斗的内壁上；所述第二过滤阶段时，所述第二滤过膜附着于所述漏斗的内壁上；

第一样品瓶，第一过滤阶段时，其套接于所述漏斗的外侧，用于盛放从所述第一滤过膜渗出的液体；

废液收集容器，其具有盛放废液的废液收集腔，进行废液收集时，所述废液收集容器套接于所述漏斗的外侧。

根据所述的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统，所述废液收集容器的底部连接有底座。

根据所述的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统，所述漏斗的漏斗室的深度大于5厘米。

根据所述的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统，所述第一样品瓶以及所述废液收集容器的外形均呈圆柱体形；

所述第一样品瓶以及所述废液收集容器的外壁由透明材质制成。

根据所述的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统，所述适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统还包括用于盛放富集的外泌体的离心管，与所述滤过膜滤过系统分体设置，所述离心管的容量大于5毫升。

根据所述的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统，所述适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统还包括量筒，与所述滤过膜滤过系统分体设置，所述量筒由透明材质制成，并且所述量筒上设置由刻度线，所述量筒的容量为2000 毫升。

根据所述的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统，所述适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统还包括第二样品瓶，与所述滤过膜滤过系统分体设置，用于盛放所述低速离心机产生的所述上清液。

本实用新型的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统设置为包括低速离心机以及滤过膜滤过系统，低速离心机是一种普通的离心机，不需要额外的商业化仪器设备，节省成本，因此，大部分基层医院都能完成，将所述尿液进行低速离心处理产生上清液；滤过膜滤过系统用于过滤所述上清液中除外泌体外的杂质，与所述低速离心机分体设置，其对应于第一过滤阶段设置有第一过滤单元；对应于第二过滤阶段设置有第二过滤单元。根据外泌体的自身物理性质，通过第一过滤阶段的第一过滤单元过滤及第二过滤阶段的第二过滤单元过滤，进行两次不同孔径的滤过膜滤过，极大程度保证了富集的外泌体的纯度。

附图说明

图1是本实用新型实施例提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统的结构示意图；

图2是本实用新型实施例提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统的漏斗结构示意图；

图3是本实用新型实施例提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统的第一样品瓶结构示意图；

图4是本实用新型实施例提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统的废液收集容器结构示意图；

图5是本实用新型实施例提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统的离心管结构示意图；

图6是本实用新型实施例提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统的量筒结构示意图；

图7是本实用新型实施例提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统的第二样品瓶结构示意图；

图8是本实用新型实施例提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统的使用示意图之一；

图9是本实用新型实施例提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统的使用示意图之一；

图10是本实用新型实施例提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统的使用示意图之一；

图11是使用本实用新型提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统富集尿液外泌体的实施例1～3中尿外泌体的40000倍透射电镜图；

图12是使用本实用新型提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统富集尿液外泌体的实施例1～3中尿外泌体的500000倍透射电镜图；

图13是使用本实用新型提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统富集尿液外泌体的实施例1～3中NanoSight观察到的尿液外泌体的粒径浓度图，其中横坐标代表粒径0-900nm，纵坐标代表囊泡浓度，单位106个/ml；

图14是使用本实用新型提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统富集尿液外泌体的实施例1～3中NanoSight观察到的尿液外泌体的视频截图，图中白色球形亮点即为外泌体；

图15是使用本实用新型提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统富集尿液外泌体的实施例1～3中NanoSight观察到的尿液外泌体的粒径相对强度图，其中横坐标为粒径0-900nm，纵坐标为相对强度；

图16是使用本实用新型提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统富集尿液外泌体的实施例1～3中NanoSight观察到的尿液外泌体的粒径相对强度三维图。

具体实施方式

为了使本实用新型的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本实用新型进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本实用新型，并不用于限定本实用新型。

参见图1，在本实用新型的一个实施例中提供了一种适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统100，包括：

低速离心机10，将所述尿液进行低速离心处理产生上清液；

滤过膜滤过系统20，用于过滤所述上清液中除外泌体外的杂质，与低速离心机10分体设置，其对应于第一过滤阶段设置有第一过滤单元；对应于第二过滤阶段设置有第二过滤单元。

在该实施例中，适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统100用于富集外泌体，富集的外泌体可用于糖尿病肾病早期诊断，该适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统100包括低速离心机10和滤过膜滤过系统20，尿液外泌体的富集过程中，首先，使用低速离心机10进行低速离心处理以去除尿液标本中的细胞碎片细菌等杂志，低速离心机10是一种普通的离心机，低速离心机10将收集到的尿液标本在2000g的离心力，室温下，进行低速离心处理30分钟产生上清液，然后将产生的上清液进行收集；参见图7，优选的是，所述上清液盛放于第二样品瓶90，第二样品瓶90与滤过膜滤过系统20分体设置。其次，将上清液放入滤过膜滤过系统20中进行进一步的过滤，过滤所述上清液中除外泌体外的杂质，根据外泌体的自身物理性质，滤过膜滤过系统20进行了两次过滤，第一过滤阶段通过第一过滤单元对上清液进行过滤，然后进行第二过滤阶段，第二过滤阶段的第二过滤单元对从所述第一滤过膜渗出的液体进行过滤，两次过滤阶段采用不同孔径的滤过单元过滤，极大程度保证了富集的外泌体的纯度。由此，该适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统100不需要昂贵的实验仪器 (如超速离心机)，初步处理仅需普通的低速离心机10，大部分基层医院都能完成；处理样本量跨度大，从15ml～2000ml，可以满足不同样本量处理的需要；不需要额外的商业化仪器设备，节省成本；采用的是液压透析原理，在该适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统100富集尿液外泌体的整个过程中，很好的保持了外泌体自身的物理和化学特性。

在本实用新型的一个实施例中，所述第一过滤阶段的第一被截留物质为除外泌体以外的细胞外囊泡以及杂质，所述第一过滤单元为孔径大小为0.22微米的第一滤过膜；

所述第二过滤阶段的第二被截留物质为外泌体，所述第二过滤单元为截留分子量为1000KDa(千道尔顿)的第二滤过膜。

在该实施例中，根据外泌体的自身物理性质，第一过滤单元为孔径大小为 0.22微米的第一滤过膜，首先将上清液通过孔径大小为0.22微米的第一滤过膜过滤，其可以截留除外泌体以外的细胞外囊泡以及杂质，从所述第一滤过膜渗出的液体为进一步提纯的外泌体，于从所述第一滤过膜渗出的液体中加入200 毫升的PBS进行重悬，然后进行第二过滤阶段，将第一滤过膜更换为第二滤过膜，所述第二滤过膜为纳米膜，于从所述第一滤过膜渗出的液体加入PBS重悬后通过截留分子量为1000KDa的第二滤过膜过滤，外泌体能够被截留，当过滤至所剩液体为5毫升时，该所剩液体即为富集的外液体，将其收集即完成外液体的富集过程。参见图6，优选的是，所述适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统100还包括用于盛放富集的外泌体的离心管70，与所述滤过膜滤过系统20 分体设置，所述离心管70的容量大于5毫升。

具体的是，所述第一滤过膜的长度为30～35厘米，适配于过滤需求。

参见图2～4，在本实用新型的一个实施例中，所述滤过膜滤过系统20还包括：

漏斗30，所述第一过滤阶段时，所述第一滤过膜附着于所述漏斗30的内壁上；所述第二过滤阶段时，所述第二滤过膜附着于所述漏斗30的内壁上；

参见3和图9，第一样品瓶40，第一过滤阶段时，其套接于所述漏斗30的外侧，用于盛放从所述第一滤过膜渗出的液体；

废液收集容器50，其具有盛放废液的废液收集腔，进行废液收集时，所述废液收集容器50套接于所述漏斗30的外侧。

在该实施例中，具体提供了滤过膜滤过系统20中用于辅助第一滤过膜以及第二滤过膜完成过滤过程以将外泌体富集的组件，该滤过膜滤过系统20还包括漏斗301个、第一样品瓶40、废液收集容器50、通用型膜夹(Universal Closures) 一个、封口膜(2cmX6cm)两片。参见图9～10，各个组件根据使用情况搭配使用。第一过滤阶段时，将所述第一滤过膜附着于所述漏斗30的内壁上，第二过滤阶段时，则将第一滤过膜更换为第二滤过膜，废液收集容器50用于收集废液，例如第一过滤阶段第一滤过膜的第一截留物质，可以将其清理到废液收集容器 50中，从所述第一滤过膜渗出的液体则收集于第一样品瓶40中，也可以将第二过滤阶段从所述第二滤过膜滤过的物质收集于废液收集容器50中。

此外，废液收集容器50的底部连接有底座60，使得废液收集容器50能够稳定放置。

此外，漏斗30的漏斗室31的深度大于5厘米，以满足每次进行过滤的样本的容量要求。

在本实用新型的一个实施例中，第一样品瓶40以及废液收集容器50的外形均呈圆柱体形；

所述第一样品瓶40以及废液收集容器50的外壁由透明材质制成。

参见图6，在本实用新型的一个实施例中，所述适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统100还包括量筒80，用于量取外泌体富集过程中需要使用的预定量的液体，与滤过膜滤过系统20分体设置，量筒80由透明材质制成，并且量筒80上设置有刻度线81，量筒80的容量为2000毫升。

使用本实用新型提供的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统100富集尿液外泌体的具体方法如下：

实施例1：

(1)低速离心：取100ml健康志愿者的尿标本，进行研究，低速离心机10 (AllegraTMX-22Centrifuge,Beckman Coulter),相对离心力(RCF)2000g，室温， 30分钟，除去细胞碎片、细菌等杂物，收集上清液；

(2)孔径大小为0.22微米的第一滤过膜过滤：收集低速离心处理后的上清液，全部经过设置有孔径大小为0.22微米的第一滤过膜的滤过膜滤过系统20过滤以除去外泌体以外的细胞外囊泡及杂质，加入200ml的PBS重悬；

(3)截留分子量为1000KDa的第二滤过膜过滤：收集PBS重悬后的液体，全部经过具有截留分子量为1000KDa的第二滤过膜的滤过膜滤过系统20过滤，待液体滤过到纳米膜底部3～5cm处时，加入200mlPBS液洗脱，进一步除去尿液中的可溶性蛋白，纯化尿液外泌体，收集5ml液体，此即为富集的外泌体。

其中滤过膜透析时采用的滤过膜滤过系统20，使用时自己搭配各个组件，具体包括漏斗30一个，第一滤过膜长度为30～35cm，2000ml量筒80一个，通用型膜夹(Universal Closures)一个，封口膜(2cmX6cm)两片。

第一滤过膜以及第二滤过膜均购自仕必纯(上海)贸易有限公司Spectrum Labs Inc，孔径大小为0.22微米的第一滤过膜的截留直径为200nm以上的微囊泡，纳米膜截留分子量为1000KDa，截留直径约100nm以下的外泌体。

(4)透射电镜观察：取步骤(3)中制备的尿液外泌体20ul，点样于铜网， 5分钟后，予3％(W/V)磷钨酸负染2分钟，超纯水洗涤两遍，干燥5分钟后检测，调节透射电镜焦距，观察尿液外泌体的形态和粒径，具体结果见图11-12 中所示，从图11-12可以看出，尿液外泌体分布均匀，呈杯状或圆形，粒径在 20-100nm。

采用透射电镜观察之前，要求对所收集的尿液外泌体进行蛋白定量，取 10ug/ml的尿液外泌体进行形态学观察。蛋白定量采用Bradford考马斯亮蓝法对所收集尿液外泌体进行蛋白定量，取BSA作为标准品，等比稀释，绘制标准曲线，根据标准曲线检测待测样品的尿液外泌体浓度；重复三次测量，取平均值。

(5)使用NanoSight仪器检测：用PBS稀释尿液外泌体，等比稀释，稀释为200倍，针筒上样，每次2-3ml，

上样前后均用超纯水清洗检测槽：调整NanoSight仪器参数，至合适焦距，对外泌体进行分析记录。检测结果见图13-16张所示，从图13-16中可以看出，尿液外泌体的粒径主峰在102nm，没有杂峰，样品较纯，图14中显示，图中亮点即为尿液外泌体，图15中显示样品的粒径/相对强度图，其中横坐标为粒径0-900nm，纵坐标为相对强度，可见100nm粒径的囊泡占大多数。

(6)检测结果

透射电镜下尿液外泌体呈杯状或球形，分布均匀，具体可见图11-12中所示。

尿液外泌体的粒径平均值为102nm，具体可见图13中所示。

尿液外泌体分布均匀，布朗运动显著。

所观察到的尿液外泌体的数量为3.8x108/ml，由于样品稀释200倍，故原样品的尿液外泌体的量为7.6x1010/ml。

实施例2

(1)低速离心：取30ml健康志愿者的尿标本，进行研究，低速离心机10 (AllegraTMX-22Centrifuge,Beckman Coulter),相对离心力(RCF)2000g，室温， 30分钟，除去细胞碎片、细菌等杂物，收集上清；

(2)孔径大小为0.22微米的第一滤过膜过滤：收集低速离心处理后的上清液，全部经过设置有孔径大小为0.22微米的第一滤过膜的滤过膜滤过系统20过滤以除去外泌体以外的细胞外囊泡及杂质，加入200ml的PBS重悬；

(3)截留分子量为1000KDa的第二滤过膜过滤：收集PBS重悬后的液体，全部经过具有截留分子量为1000KDa的第二滤过膜的滤过膜滤过系统20过滤，待液体滤过到纳米膜底部3-5cm处时，加入200mlPBS液洗脱，进一步除去尿液中的可溶性蛋白，纯化尿液外泌体，收集5ml液体，此即为富集的外泌体。

第一滤过膜以及第二滤过膜均购自仕必纯(上海)贸易有限公司Spectrum Labs Inc，孔径大小为0.22微米的第一滤过膜的截留直径为200nm以上的微囊泡，纳米膜截留分子量为1000KDa。

(4)透射电镜观察：取步骤(3)中制备的尿液外泌体20ul，点样于铜网， 5分钟后，予3％(W/V)磷钨酸负染2分钟，超纯水洗涤两遍，干燥5分钟后检测，调节透射电镜焦距，观察尿液外泌体的形态和粒径，具体结果见图11-12 中所示，从图11-12可以看出，尿液外泌体分布均匀，呈杯状或圆形，粒径在 20-100nm。

(5)NanoSight检测：用PBS稀释尿液外泌体，等比稀释，稀释为200倍，针筒上样，每次2-3ml，上样前后均用超纯水清洗检测槽，调整NanoSight仪器参数，至合适焦距，对外泌体进行分析记录。检测结果见图13-16所示，从图 13-16中可以看出，尿液外泌体的粒径主峰在102nm，没有杂峰，样品较纯，图 14中显示，图中亮点即为尿液外泌体，图15中显示样品的粒径/相对强度图，其中横坐标为粒径0-900nm，纵坐标为相对强度，可见100nm粒径的囊泡占大多数；图16是样品的粒径/相对强度三维图，从图16中也可以看出100nm粒径的囊泡占大多数。

(6)检测结果

透射电镜下尿液外泌体呈杯状或球形，分布均匀，具体可见图11-12中所示。

尿液外泌体的粒径平均值为102nm，具体可见图13中所示。

尿液外泌体分布均匀，布朗运动显著。

实施例3

本实施例提供的采用二次膜滤过法分离尿液外泌体的方法，具体含有以下步骤：

(1)低速离心：取100ml确诊糖尿病肾病1-2期患者的尿标本，进行研究，低速离心机10(AllegraTMX-22Centrifuge,Beckman Coulter),相对离心力(RCF) 2000g，室温，30分钟，除去细胞碎片、细菌等杂物，收集上清液；

(2)孔径大小为0.22微米的第一滤过膜过滤：收集低速离心处理后的上清液，全部经过设置有孔径大小为0.22微米的第一滤过膜的滤过膜滤过系统20过滤以除去外泌体以外的细胞外囊泡及杂质，加入200ml PBS重悬；

(3)截留分子量为1000KDa的第二滤过膜过滤：收集PBS重悬后的液体，全部具有截留分子量为1000KDa的第二滤过膜的滤过膜滤过系统20过滤，待液体滤过到纳米膜底部3-5cm处时，加入200mlPBS液洗脱，进一步除去尿液中的可溶性蛋白，纯化尿液外泌体，收集5ml液体，此即为富集的外泌体。

第一滤过膜以及第二滤过膜均购自仕必纯(上海)贸易有限公司Spectrum Labs Inc，孔径大小为0.22微米的第一滤过膜的截留直径为200nm以上的微囊泡，纳米膜截留分子量为1000KDa。

(4)透射电镜观察：取步骤(3)中制备的尿液外泌体20ul，点样于铜网， 5分钟后，予3％(W/V)磷钨酸负染2分钟，超纯水洗涤两遍，干燥5分钟后检测，调节透射电镜焦距，观察尿液外泌体的形态和粒径，具体结果见图11-12 中所示，从图11-12可以看出，尿液外泌体分布均匀，呈杯状或圆形，粒径在 20-100nm。

(5)NanoSight检测：用PBS稀释尿液外泌体，等比稀释，稀释为200倍，针筒上样，每次2-3ml，上样前后均用超纯水清洗检测槽：调整NanoSight仪器参数，至合适焦距，对外泌体进行分析记录。检测结果见图13-16所示，从图 13-16中可以看出，尿液外泌体的粒径主峰在102nm，没有杂峰，样品较纯，图 14中显示，图中亮点即为尿液外泌体，图15中显示样品的粒径/相对强度图，其中横坐标为粒径0-900nm，纵坐标为相对强度，可见100nm粒径的囊泡占大多数；图16是样品的粒径/相对强度三维图，从图16中也可以看出100nm粒径的囊泡占大多数。

(6)检测结果

透射电镜下尿液外泌体呈杯状或球形，分布均匀，具体可见图11-12中所示。

尿液外泌体的粒径平均值为102nm，具体可见图13中所示。

尿液外泌体分布均匀，布朗运动显著。

将步骤(3)收集的外泌体采用2D-DIGE蛋白组学和MALDI-TOF-TOF质谱技术联合应用寻找糖尿病肾病(1-2期)早期诊断的尿液外泌体中的生物标记物。采用Western-blot验证尿液外泌体中的生物标记物在糖尿病肾病早期诊断中的符合率。

与经过肾脏彩色B超及肾脏MRI检测后临床确诊的糖尿病肾病1-2期比较，使用本发明方法分离的尿液外泌体寻找的特异性生物标记物诊断的糖尿病肾病 1-2期的符合率达到80％以上。

通过本实用新型分离的尿液外泌体特异性生物学标记物确诊的糖尿病肾病 1-2期患者临床干预后效果显著。

对糖尿病患者使用本实用新型分离收集尿液外泌体，通过检测外泌体中糖尿病肾病1-2期的特异性生物标记物，确诊为的糖尿病肾病1-2期的患者，经过强化饮食运动治疗、强化血糖控制、调节血脂、控制血压等综合干预，随访2 年，病情稳定，未发现明显进展至糖尿病肾病3期的患者，显著延缓了糖尿病肾病的进展。

与目前多数申请的分离外泌体的专利相比，本实用新型不需要昂贵的仪器 (如超速离心机)，不需要使用商业化的更多的器具(如超速浓缩离心管)，能够成为基层医院普及使用的方法。

综上所述，本实用新型的适合基层医院使用的尿液外泌体富集系统设置为包括低速离心机以及滤过膜滤过系统，低速离心机是一种普通的离心机，不需要额外的商业化仪器设备，节省成本，因此，大部分基层医院都能完成，将所述尿液进行低速离心处理产生上清液；滤过膜滤过系统用于过滤所述上清液中除外泌体外的杂质，与所述低速离心机分体设置，其对应于第一过滤阶段设置有第一过滤单元；对应于第二过滤阶段设置有第二过滤单元。根据外泌体的自身物理性质，通过第一过滤阶段的第一过滤单元过滤及第二过滤阶段的第二过滤单元过滤，进行两次不同孔径的滤过膜滤过，极大程度保证了富集的外泌体的纯度。

当然，本实用新型还可有其它多种实施例，在不背离本实用新型精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本实用新型作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本实用新型所附的权利要求的保护范围。