脂质过氧化诱发性疾病的治疗药物及其筛选方法与流程

本发明提供一种用于寻找脂质过氧化抑制剂的检定方法、检定试剂盒、其筛选方法、以及脂质过氧化诱发性疾病的治疗药物。
背景技术：
：脂质过氧化(lipidperoxidation)反应中的脂质自由基所参与的疾病涉及心血管系统、中枢系统、呼吸系统、以及抗菌药物等广泛的疾病领域(非专利文献1)(参照图1)。然而，在起因于脂质过氧化反应的疾病中，对于每种疾病参与大量的脂质过氧化物及其代谢产物，因此，不容易找到对于每种疾病有用的治疗药物。迄今为止，虽然已知有许多抗氧化物质，但被批准为医药品的物质少。因此，需要提供一种示出脂质过氧化反应的抑制效果的药物。作为寻找活性药物的方法，已知有筛选(screening)方法。作为对脂质过氧化反应的抑制进行测定的方法，已知有几种方法(例如，tbars法)。然而，就这些方法而言，测定对象多种多样，另外，在利用荧光或吸光原理时存在不能测定吸收波长不同的样品的问题，或者，存在ph操作、加热等操作烦杂等问题。于是，需要构建一种专门用于脂质过氧化反应的检测且能够在接近生物体的温和条件下分析多种试料的系统的检定(assay)方法。迄今为止，本发明的发明人等一直在开发能够捕获脂质自由基的优良的荧光硝基氧(nitroxide)探针(probe)化合物(专利文献1)。已知年龄相关性黄斑变性(amd)是治疗满意度和药剂对于治疗的贡献度低且未得到满足的医疗需求(unmetmedicalneeds)高的疾病。就年龄相关性黄斑变性而言，从其发病机理来讲大致分为萎缩型(干型)和渗出型(湿型)两种。在美国，萎缩型(干型)的患者约有85～90％之多，另一方面，在日本，渗出型(湿型)的患者约有92％之多。然而，尚未知晓对萎缩型(干型)疾病有效的治疗药物。另外，尚未从抗氧化物质开发出对年龄相关性黄斑变性的治疗以及进展抑制有效的治疗药物。在先技术文献专利文献专利文献1：日本专利申请2017-090739非专利文献非专利文献1：frijhoffjetal.,antioxid.redoxsignal,2015,23(14),1144-70技术实现要素：发明所要解决的问题本发明提供一种使用荧光硝基氧探针(nitroxideprobe)化合物的检测脂质过氧化抑制所用的检定方法(assaymethod)、检定试剂盒(assaykit)、以及使用这些检定方法的筛选方法(screeningmethod)。另外，提供一种使用通过本发明的筛选方法来发现的活性药物的、用于治疗脂质过氧化反应诱发性疾病(diseasesinducedbylipidperoxidationreactions)例如年龄相关性黄斑变性等的医药组合物等。用于解决问题的方案本发明人等专心研究了用于检测、评价脂质过氧化抑制的检定方法以及筛选方法，其结果，发现使用荧光硝基氧探针化合物的检定方法以及使用该检定方法的筛选方法能够容易地寻找示出脂质过氧化抑制活性的候选化合物。另外，本发明人等还发现这些候选化合物对起因于脂质过氧化反应的疾病尤其对年龄相关性黄斑变性的治疗或预防有用。即、本发明提供以下的方式，但并不限定于此。(检定试剂盒及检定方法)项[1]：一种检定试剂盒，用于检测被测化合物的脂质过氧化抑制的活性，所述检定试剂盒在缓冲液中包含由式(i)所示的化合物、脂质体、以及选自由2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至少一种化合物，其中，式(i)如下：[化1]项[1-2]：在项[1]所述的检定试剂盒中，由该式(i)所示的化合物的浓度为1.0～20.0μm，脂质体由以蛋黄为来源的磷脂酰胆碱和双十六烷基磷酸酯配制，该以蛋黄为来源的磷脂酰胆碱的浓度为5.0～10.0mg/ml，该双十六烷基磷酸酯的浓度为0.01～1.0mg/ml，被测化合物的浓度为5～100μm，2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐的浓度为5～50mm，二价铁供给源的浓度为0.5～5mm。项[2]：在项[1]所述的检定试剂盒中，二价铁离子供给源物质是硫酸铁(ⅱ)。项[3]：在权利要求1或2所述的检定试剂盒中，包括示出化合物的活性值的附加说明书，其中，所述化合物示出脂质过氧化抑制的活性。项[4]：一种检定试剂盒，用于检测被测化合物的脂质过氧化抑制的活性，所述检定试剂盒在缓冲液中包含由式(i)所示的化合物、培养细胞、以及选自由花生四烯酸和过氧化氢叔丁基组成的组中的至少一种化合物，其中，式(i)如下：[化2]项[4-2]：在项[4]所述的检定试剂盒中，由该式(i)所示的化合物的浓度为1.0～20.0μm，培养细胞的浓度为1×104～1×105细胞数，被测化合物的浓度为5～500μm，花生四烯酸的浓度为100～400μm，过氧化氢叔丁基的浓度为100～400μm。项[5]：在项[4]所述的检定试剂盒中，培养细胞是以人肝脏为来源的hepg2细胞。项[6]：在项[4]或[5]所述的检定试剂盒中，包括示出化合物的活性值的附加说明书，其中，所述化合物示出脂质过氧化抑制的活性。项[7]：一种检定试剂盒，包含项[1]～[6]中所述的任意两种或其以上的检定试剂盒。项[7-2]：在项[7]所述的检定试剂盒中，包含反应引发剂为2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐的检定试剂盒和反应引发剂为硫酸铁(ⅱ)的检定试剂盒的组合。项[7-3]：在项[7]所述的检定试剂盒中，包含反应引发剂为花生四烯酸的检定试剂盒和反应引发剂为过氧化氢叔丁基的检定试剂盒的组合。项[8]：一种用于测定脂质过氧化抑制活性的检定方法，包括：ⅰ)配制包含由式(i)所示的化合物和脂质体的缓冲液；ⅱ)添加选自由2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至少一种化合物；ⅲ)添加被测化合物；ⅳ)测定荧光；以及，ⅴ)从荧光测定结果求出被测化合物的活性值。项[9]：一种用于测定脂质过氧化抑制活性的检定方法，包括：ⅰ)配制包含由式(i)所示的化合物和培养细胞的缓冲液；ⅱ)添加选自由花生四烯酸和过氧化氢叔丁基组成的组中的至少一种化合物；ⅲ)添加被测化合物；ⅳ)测定荧光；以及，ⅴ)从荧光测定结果求出被测化合物的活性值。项[10]：在项[8]或[9]所述的检定方法中，包括：ⅵ)与成为脂质过氧化抑制活性指标的化合物的活性值进行比较。项[11]：根据项[8]～[10]中任一项所述的检定方法，在微孔板使用所述检定方法。项[11-2]：在项[11]所述的检定方法中，包括：ⅰ)将被测化合物的溶液分配到微孔板中；ⅱ)将包含由式(i)所示的化合物、和脂质体或培养细胞的溶液分配到各孔中；ⅲ)在使用脂质体时，将包含选自由2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至少一种化合物的溶液分配到各孔中，在使用培养细胞时，将包含选自由花生四烯酸和过氧化氢叔丁基组成的组中的至少一种化合物的溶液分配到各孔中；以及，ⅳ)用酶标仪测定荧光。(筛选方法)项[12]：一种用于选择脂质过氧化抑制活性高的候选化合物的筛选方法，包括：ⅰ)从化合物库中选择被测化合物；ⅱ)进行借助于使用被测化合物的、使用项[8]中所述的2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐的检定方法的筛选，并选择示出高活性值的化合物；以及，ⅲ)接下来，进行借助于使用ⅱ)的示出了高活性值的化合物的、使用项[8]中所述的二价铁离子供给源物质的检定方法的筛选，并选择示出高活性值的化合物。项[13]：在项[12]所述的筛选方法中，在化合物库是包含未被批准为食品或医药品的化合物的化合物库的情况下，在项[12]所述的筛选方法的基础上进一步包括：ⅰ)进行借助于项[9]中所述的、使用花生四烯酸的检定方法的筛选，并选择示出高活性值的化合物；ⅱ)进行借助于项[9]所述的、使用过氧化氢叔丁基的检定方法的筛选，并选择示出高活性值的化合物；以及，ⅲ)选择在ⅰ)和ⅱ)的筛选中均示出高活性值的化合物。项[14]：在项[12]或[13]所述的筛选方法中，在化合物库是包含未被批准为食品或医药品的化合物的化合物库的情况下，在项[12]中所述的筛选方法的基础上进一步包括：ⅰ)按照mtt法，进行借助于使用包含培养细胞的培养基、被测化合物以及花生四烯酸的检定方法的筛选，并选择示出高细胞存活率的化合物；ⅱ)按照mtt法，进行借助于使用包含培养细胞的培养基、被测化合物以及过氧化氢叔丁基的检定方法的筛选，并选择示出高细胞存活率的化合物；以及，ⅲ)选择在ⅰ)和ⅱ)的筛选中均示出高细胞存活率的候选化合物。项[15]：在项[13]或[14]所述的筛选方法中，包括：ⅰ)从化合物库中选择通过项[13]或[14]所述的筛选方法来选择的化合物的结构类似物；ⅱ)对于在ⅰ)选择的化合物和通过项[13]或[14]所述的筛选方法来适当地选择的化合物，执行项[13]所述的筛选方法，并选择示出高活性值的化合物；ⅲ)对于在ⅰ)选择的化合物和通过项[13]或[14]所述的筛选方法来适当地选择的化合物，执行项[14]所述的筛选方法，并选择示出高细胞存活率的化合物；ⅳ)选择在ⅱ)和ⅲ)的两个筛选方法中示出高活性值和高细胞存活率的候选化合物；ⅴ)对于在ⅰ)选择的化合物和通过项[13]或[14]所述的筛选方法适当地选择的化合物，执行使用包含培养细胞的培养基的检定方法，并选择示出高细胞存活率的候选化合物；以及，ⅵ)从在ⅳ)选择的化合物和在ⅴ)选择的化合物选择候选化合物。项[16]：在项[12]～[15]中任一项所述的筛选方法中，化合物库是东京大学创药机构核心库(corelibrary)或普雷斯特威克化合物库(prestwickchemicallibrary)。项[16-2]：项[12]～[15]中任一项所述的筛选方法是高通量筛选方法。(医药用途)项[17]：一种医药组合物，其包含有效量的选自由下述组组成的组中的至少一种化合物，且用于预防或治疗实施对象中的脂质过氧化反应诱发性疾病或抑制疾病的进展，其中，所述组由如下化合物组成：阿朴吗啡((r)-(-)-盐酸阿朴吗啡)、毒扁豆酚碱((-)-毒扁豆酚碱延胡索酸盐)、乙氧基喹啉(6-乙氧基-2,2,4-三甲基-1,2-二氢喹啉)、甲基多巴(甲基多巴倍半水合物)、奥氮平(2-甲基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)-10h-噻吩并[2,3-b][1,5]苯并二氮卓、3-氨基-4-(苯基氨基)苯甲酸甲酯(化合物52)、3-氨基-4-((4-甲氧基苯基)氨基)苯甲酸甲酯(化合物52-1)、3-氨基-4-((3-甲氧基苯基)氨基)苯甲酸甲酯(化合物52-3)、3-氨基-4-(苄基氨基)苯甲酸甲酯(化合物52-4)、3-氨基-4-((1-苯乙基)氨基)苯甲酸甲酯(化合物52-5)、1-(4-(三氟甲氧基)苯基)二氢吲哚-5-胺(化合物78)、1-(3,5-二甲基苯基)-1h-吲哚-6-胺(化合物78-3)、1-(3,5-二甲基苯基)二氢吲哚-6-胺(化合物78-4)、1-(4-甲氧基苯基)-1h-吲哚-6-胺(化合物78-5)、1-(4-(甲硫基)苯基)-1h-吲哚-6-胺(化合物78-6)、1-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1h-吲哚-5-胺(化合物78-8)。项[18]：在项[17]所述的医药组合物中，疾病选自由阿尔茨海默型痴呆症、慢性肾脏病、糖尿病性神经病、肝损伤、年龄相关性黄斑变性、缺血性脑病、血管性痴呆症、动脉硬化症、帕金森病、多发性硬化症、癌症、哮喘、高血压、心血管疾病、以及年龄相关性眼病组成的组中。项[19]：在项[17]所述的医药组合物中，疾病是年龄相关性黄斑变性疾病。项[20]：一种方法，使用选自由上述项[17]中所述的组组成的组中的至少一种化合物，该方法用于预防或治疗脂质过氧化反应诱发性疾病或抑制疾病的进展。项[21]：在用于预防或治疗脂质过氧化反应诱发性疾病或抑制疾病的进展的医药的制备中使用选自由上述项[17]中所述的组组成的组中的至少一种化合物。项[22]：使用用于预防或治疗脂质过氧化反应诱发性疾病或抑制疾病的进展的、选自由上述项[17]中所述的组组成的组中的至少一种化合物。发明效果通过本发明的检定试剂盒、使用该检定试剂盒的筛选方法就能够容易地寻找示出脂质过氧化抑制效果的化合物。另外，通过本发明的筛选方法发现的化合物有用于脂质过氧化反应诱发性疾病(例如，年龄相关性黄斑变性)的治疗等。附图说明图1是示出脂质过氧化反应与疾病的关系的图。图2是示出用于评价荧光硝基氧探针的脂质过氧化反应响应性的试验的结果的图。混合脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg的dcp)、5.0μm的荧光硝基氧、20mm的aaph并测定了40分钟之后的荧光强度(nbd-tempo：λex/λem＝470/530nm、dansyl-tempo：λex/λem＝300/500nm)。(n＝3、平均(mean)+s.d.,**p＜0.01ⅴv.s.ctrl(-))。图3是示出用于评价荧光硝基氧探针与各种还原性物质的反应性的试验的结果的图。混合脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg的dcp)、5.0μm的荧光硝基氧、50μm的抗氧化物质并测定了40分钟之后的荧光强度(λex/λem＝470/530nm)。荧光强度的比率是与各种抗氧化物质反应后的探针的荧光强度除以ctrl(-)(阴性对照品)的荧光强度的值。(a)是本研究中使用的抗氧化物质的化学结构，(b)是通过探针与抗氧化物质的反应得到的荧光强度的比率(n＝3、平均(mean)+s.d.、*p＜0.05、**p＜0.01v.s.ctrl(-))。图4是示出用于评价荧光硝基氧探针与各种氧化性物质的反应性的试验的结果的图。混合5.0μm的荧光硝基氧和各种氧化性物质并测定了30分钟之后的荧光强度(λex/λem＝470/530nm)。荧光强度的比率是与各种氧化性物质反应后的探针的荧光强度除以ctrl(-)的荧光强度的值。氧化性物质使用了0.5mm过氧化氢、0.5mm次氯酸、0.5mm氧化钾、0.5mm过氧化氢和5.0μm的feso4、脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg的dcp)以及10mm的aaph。(n＝3、平均(mean)+s.d.、**p＜0.01v.s.ctrl(-))。图5是示出用于评价在aaph系统中的人工脂质膜中反应引发剂浓度依赖性脂质过氧化反应的试验的结果的图。混合脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg的dcp)、5.0μm的nbd-teepo、aaph并测定了40分钟之后的荧光强度(λex/λem＝470/530nm)。nbd-teepo荧光响应能力的(a)为刺激浓度依赖性(aaph为0-20mm)，(b)为抗氧化物质浓度依赖性(aaph为20mm，asa为0-20μm)。比较了(c)使用nbd-teepo的脂质过氧化反应评价法(aaph为20mm，抗氧化物质为10μm)和(d)tbars检定(aaph为20mm，抗氧化物质为10μm)。(n＝3、平均(mean)+s.d.、**p＜0.01v.s.ctrl(-)、*p＜0.05、**p＜0.01v.s.ctrl(+))。图6是示出用于评价fe2+系统中的人工脂质膜中反应引发剂浓度依赖性脂质过氧化反应的试验的结果的图。混合脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg的dcp)、5.0μm的nbd-teepo、feso4并测定了60分钟之后的荧光强度(λex/λem＝470/530nm)。nbd-teepo荧光响应能力的(a)为刺激浓度依赖性(feso4为0-2mm)、(b)为抗氧化物质浓度依赖性(feso4为1mm、eda为0-20μm)。比较了(c)使用nbd-teepo的脂质过氧化反应评价法(feso4为1mm，抗氧化物质为10μm)和(d)tbars检定(feso4为1mm，抗氧化物质为10μm)。(n＝3、平均(mean)+s.d.、**p＜0.01v.s.ctrl(-)、#p＜0.05、##p＜0.01v.s.ctrl(+))。图7是示出用于评价培养细胞系统中的细胞内脂质过氧化反应的试验的结果的图。在hepg2细胞1.0×104细胞数中添加5.0μm的nbd-teepo、各种氧化性物质以及抗氧化物质50μm并测定了荧光强度变化(λex/λem＝470/530nm)。(a)是添加aa(0-200μm)并经45分钟之后的nbd-teepo的荧光强度，(b)是添加200μm的aa、50μm的抗氧化物质并经45分钟之后的nbd-teepo的荧光强度，(c)是添加tbhp(0-300μm)并经45分钟之后的nbd-teepo的荧光强度，(d)是添加300μm的tbhp、50μm的抗氧化物质并经45分钟之后的nbd-teepo的荧光强度，(e)是s/b比、cv值、z'-因子(factor)(aa添加系统：添加200μm的aa并经45分钟之后、tbhp添加系统：添加300μm的tbhp并经45分钟之后)。(n＝3、平均(mean)+s.d.、**p＜0.01v.s.ctrl(-)、#p＜0.05、##p＜0.01v.s.ctrl(+))。图8是示出用于评价使用了mtt检定的培养细胞系统中的脂质过氧化诱发性细胞存活率变化的试验的结果的图。在hepg2细胞1.0×104细胞数中添加各种氧化性物质和抗氧化物质50μm并通过mtt检定(λmax＝570nm)而测定了24小时之后的细胞存活率。假定0μm氧化刺激物、0μm抗氧化物质为100％而算出了细胞存活率。(a)是添加aa(0-100μm)并经24小时之后的细胞存活率，(b)是添加100μm的aa、50μm的抗氧化物质并经24小时之后的细胞存活率，(c)是添加tbhp(0-100μm)并经24小时之后的细胞存活率，(d)是添加100μm的tbhp、50μm的抗氧化物质并经24小时之后的细胞存活率，(e)是s/b比、cv值、z'-因子(factor)(aa添加系统：添加100μm的aa并经24小时之后、tbhp添加系统：添加100μm的bhp并经24小时之后)。(n＝3、平均(mean)+s.d.、**p＜0.01v.s.ctrl(-)、#p＜0.05、##p＜0.01v.s.ctrl(+))。图9是示出筛选方法的模式图的图。图10是示出aaph系统中的东京大学创药机构1次筛选的结果的图。混合脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg的dcp)、5.0μm的nbd-teepo、20mm的aaph并测定了荧光强度(λex/λem＝470/530nm)。示出反应后经40分钟时的各化合物的活性值。图11是示出fe2+系统中的auc评价的结果的图。混合脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg的dcp)、5.0μm的nbd-teepo、1.0mm的feso4并对荧光强度(λex/λem＝470/530nm)进行了180分钟经时测定。根据所得到的曲线算出了曲线下方的面积(auc)。图12是示出fe2+系统中的使用东京大学创药机构核心库(corelibrary)的1次筛选的结果的图。混合脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg的dcp)、5.0μm的nbd-teepo、1.0mm的feso4并测定了荧光强度(λex/λem＝470/530nm)。示出反应后经180分钟之后的各化合物的活性值。图13是示出使用东京大学创药机构核心库(corelibrary)的2次筛选的结果的图。在hepg2细胞1.0×104细胞数中添加5.0μm的nbd-teepo、200μm的aa或300μm的tbhp以及化合物50μm并测定了荧光强度变化(λex/λem＝470/530nm)。(a)、(b)中的虚线表示依达拉奉的活性值。(a)是添加aa并经45分钟之后的各化合物的活性值，(b)是添加tbhp并经60分钟之后的各化合物的活性值，(c)是aa添加系统和tbhp添加系统中的活性值的图示，(d)是(c)的aa添加系统中的活性值为30％以上且tbhp添加系统中的活性值为50％以上的部分的放大图。图14是示出根据mtt检定方法的使用东京大学创药机构核心库(corelibrary)的2次筛选的结果的图。在hepg2细胞1.0×104细胞数中添加100μm的aa或tbhp以及化合物50μm并通过mtt检定而测定了24小时之后的细胞存活率。(a)、(b)中的虚线表示依达拉奉的活性值。(a)是添加aa并经24小时之后的各化合物的活性值，(b)是添加tbhp并经24小时之后的各化合物的活性值，(c)是aa添加系统和tbhp添加系统中的活性值的图示，(d)是(c)的aa添加系统中的活性值为50％以上且tbhp添加系统中的活性值为30％以上的部分的放大图。图15是示出使用东京大学创药机构核心库(corelibrary)的3次筛选的结果的图。在hepg2细胞1.0×104细胞数中添加5.0μm的nbd-teepo、200μm的aa或300μm的tbhp以及化合物50μm并测定了荧光强度变化(λex/λem＝470/530nm)(白色的条：原始结构，黑色的条：结构类似物，虚线：依达拉奉的活性值)。(a)是添加aa并经45分钟之后的各化合物的活性值，(b)是添加tbhp并经60分钟之后的各化合物的活性值，(c)是aa添加系统和tbhp添加系统中的活性值的图示，(d)是(c)的aa添加系统中的活性值和tbhp添加系统中的活性值均为50％以上的部分的放大图。图16是示出根据mtt检定方法的使用东京大学创药机构核心库(corelibrary)的3次筛选的结果的图。在hepg2细胞1.0×104细胞数中添加100μm的aa或tbhp以及化合物50μm并通过mtt检定而测定了24小时之后的细胞存活率(白色的条：原始结构，黑色的条：结构类似物，虚线：依达拉奉的活性值)。(a)是添加aa并经24小时之后的各化合物的活性值，(b)是添加tbhp并经24小时之后的各化合物的活性值，(c)是aa添加系统和tbhp添加系统中的活性值的图示，(d)是(c)的aa添加系统中的活性值为0％以上且tbhp添加系统中的活性值为40％以上的部分的放大图。图17是示出用于评价使用东京大学创药机构核心库(corelibrary)的3次筛选的细胞毒性的试验的结果的图。在hepg2细胞1.0×104细胞数中添加化合物50μm并通过mtt检定而测定了72小时之后的细胞存活率。虚线表示孵育依达拉奉72小时之后的细胞存活率。图18是示出使用普雷斯特威克化合物库(prestwickchemicallibrary)的1次筛选的结果的图。混合脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg的dcp)、5.0μm的nbd-teepo、反应引发剂并测定了荧光强度变化(λex/λem＝470/530nm)。(a)是aaph系统测定开始40分钟之后的各化合物的活性值，(b)是fe2+系统测定开始180分钟之后的各化合物的活性值。图19是示出使用普雷斯特威克化合物库(prestwickchemicallibrary)的1次筛选的结果以及候选化合物与对象疾病领域的关系的图。(a)是1次筛选中的aaph系统和fe2+添加系统的活性值的图示，(b)是前16种化合物的对象疾病领域，(c)是(a)的aaph系统中的活性值为0.7以上且fe2+添加系统中的活性值为0.8以上的部分的放大图。图20是示出年龄相关性黄斑变性(amd)模型小鼠的制备方法的图。(a)是amd模型小鼠制备时间表，(b)是onl测定方法：对于onl的厚度每180μm共测定了27个点(a-中心-z)(左：观察视野为4倍，右：观察视野为60倍)。图21是示出评价了外核层(outernuclearlayer：onl)的厚度的结果的图。(a)是onl明场图像(观察倍率：60倍)，(b)是onl的厚度(模型化合物：化合物w)。左边表示眼球的下半球，右边表示上半球。(c)是q～t点的onl的厚度的平均(n＝3-5、平均(mean)+s.d.、*p＜0.05、**p＜0.01v.s.ctrl(-)、#p＜0.05、##p＜0.01v.s.ctrl(+))。图22是示出汇总了对于活性指标化合物和候选化合物的主要作用/作用点、半数致死量(ld50)、动物给药例的表的图。对于依达拉奉以及本研究中使用的5种化合物，示出了主要作用/作用点、ld50、动物给药例。其中，口服(oral)表示口服给药(oraladministration)，s.c.表示皮下给药(subcutaneousinjection，皮下注射)，i.v.表示静脉内给药(intravenousinjection，静脉内注射)。具体实施方式(检定方法及检定试剂盒)本发明人出于寻找脂质过氧化抑制剂的目的提供一种检定方法及检定试剂盒，所述检定方法及检定试剂盒用于开发一次就能够试验并评价多种化合物的筛选方法(例如，高通量筛选方法)。本发明提供一种检定试剂盒，所述检定试剂盒用于检测被测化合物的脂质过氧化抑制的活性，所述检定试剂盒在缓冲液中包含由式(i)所示的化合物、脂质体(liposome)、以及选自由2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至少一种化合物，其中，式(i)如下：[化3]在本发明的检定试剂盒中使用的脂质体包含由来自蛋黄的磷脂酰胆碱(以蛋黄为来源的磷脂酰胆碱(eggpc))和双十六烷基磷酸酯(dcp)制备的脂质体作为脂质源。自由基反应引发剂包含选自由2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐(以下称为“apph”)或二价铁离子供给源物质(例如，feso4)中任一物质组成的组中的至少一种化合物。本发明的检定试剂盒包含缓冲液(例如，磷酸缓冲液)的溶液。荧光硝基氧化合物作为为了在本发明的检定方法和检定试剂盒中使用而所用的脂质自由基捕获剂，使用由式(i)所示的荧光硝基氧化合物。本发明人所提出的文献(例如，日本专利申请2017-090739)中记载有该荧光硝基氧化合物。这里，硝基氧(no·)是具有顺磁性的稳定的自由基，其具有通过伴随电荷分离状态的光致电子转移或电子-自旋交换所引起的系间窜越来衰减荧光的性质。荧光生色团与硝基氧共价键结合的荧光性硝基氧处于分子内猝灭(quenching)状态。但是，确认出硝基氧一旦与游离基反应而失去顺磁性则处于荧光发光状态。即、就荧光性硝基氧而言，通过荧光观测且通过测定荧光强度可评价为作为对脂质自由基的捕获进行检测的探针有用。作为检测对象的脂质分子的大部分存在于生物体膜内且形成疏水性环境。因此，环境响应性荧光生色团最适宜，其虽然在亲水性环境中荧光衰减，但在疏水性环境中选择性地发出高荧光。作为荧光生色团，可举出广泛地使用于生物体膜的相转移、膜融合或细胞内脂质代谢等脂质领域的荧光生色团(例如，硝基苯并呋咱(nitrobenzofurazan，以下称为“nbd”)和5-(二甲基氨基)萘-1-磺酰氯(以下称为“丹磺酰(dansyl)”)。另外，就作为荧光硝基氧化合物的α位取代基的探针分子而言，例如可举出2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(以下称为“tempo”)、2,2,6,6-四乙基哌啶-1-氧基(以下称为“teepo”)以及2,2,6-三甲基-6-戊基-哌啶-1-氧基(以下称为“pen”)。为了选择适合于本发明的检定方法和检定试剂盒的荧光硝基氧化合物，对上述荧光团分子和探针分子分别进行最优化。通过脂质过氧化反应响应性的试验来进行荧光团分子的最优化。另外，通过对于与还原性物质的反应性评价的试验和对于与氧化性物质的反应性评价的试验而进行荧光硝基氧化合物的α位取代基即探针分子的最优化。这里，在本发明的检定方法中，将借助于还原性物质(即抗氧化物质)的脂质过氧化反应的抑制作为抑制的评价，即、将借助于抗氧化物质(例如，被测化合物)能否降低已发生的脂质过氧化反应所引起的荧光强度的上升作为抑制的评价。因此，探针分子与抗氧化物质直接反应而荧光强度上升牵涉到假阴性的检测。于是，首先检查抗氧化物质与探针分子的反应性。接下来，就对于脂质过氧化反应的探针分子的响应性而言，通过对于荧光硝基氧化合物中的探针分子的与氧化性物质的反应性评价的试验来进行。这里，由过氧化氢和fe2+产生作为活性氧的·oh。另外，由脂质体和aaph进行脂质过氧化反应。从上述试验的结果中，选择示出最高的抗还原性且对脂质过氧化反应示出高响应性的nbd-teepo化合物而作为荧光硝基氧化合物。检定方法和检定试剂盒的的确立本发明提供一种能够应用于筛选方法的、使用由式(i)所示的nbd-teepo化合物的检定方法及检定试剂盒。无细胞系统检定方法本发明提供一种使用由式(i)所示的nbd-teepo化合物的、用于检测脂质过氧化抑制的活性的、无细胞系统中的检定方法。与用于最优化荧光硝基氧化合物的上述方法相同地、脂质体用作脂质，且aaph和feso4用作自由基反应引发剂。对于aaph和fe2+的任意系统，探针的荧光强度也均以浓度依赖方式上升。另外，在使用aaph的系统中使用水溶性抗氧化物质(例如，抗坏血酸(asa))时，在fe2+系统中使用脂质性抗氧化物质(例如，依达拉奉(edaravone，eda))时，以浓度依赖方式抑制荧光的上升。在两种检定方法中，通过使用多种公知的抗氧化物质来可知本发明的检定方法是能够评价脂质过氧化反应及抗氧化物质所带来的其抑制效果的检定方法。另外，对于已知测定脂质过氧化抑制效果的2-硫代巴比妥酸反应性物质(以下称为“tbars”)方法，使用相同的公知的抗氧化物进行试验，并与本发明的检定方法的结果进行比较，由此得到相同的结果。可知本发明的检定方法是能够评价脂质过氧化反应及抗氧化物质所带来的其抑制效果的检定方法。另外，本发明的检定方法不需要如tbars方法那样的复杂的操作。在1个实施方式中，具体的检定方法包括以下的工序。ⅰ)配制包含由式(i)所示的化合物和脂质体的缓冲液；ⅱ)添加选自由2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至少一种化合物；ⅲ)添加被测化合物；ⅳ)测定荧光；以及，ⅴ)从荧光测定结果求出被测化合物的活性值。在1个实施方式中，本发明的无细胞系统检定试剂盒包括反应引发剂为2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐的检定试剂盒和反应引发剂为硫酸铁(ⅱ)的检定试剂盒的组合。无细胞系统检定试剂盒的组成就本发明的无细胞系统检定试剂盒而言，由式(i)所示的化合物的浓度为1.0～20.0μm(例如为5.0μm～20.0μm，典型地为5.0μm)，由来自蛋黄的磷脂酰胆碱和双十六烷基磷酸酯配制脂质体，该来自蛋黄的磷脂酰胆碱的浓度为5.0～10.0mg/ml(例如为2.5mg/ml)，该双十六烷基磷酸酯的浓度为0.01～1.0mg/ml(例如为0.1mg/ml)，被测化合物的浓度为5～100μm(例如为10μm)，2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐的浓度为5～50mm(例如为20mm)，二价铁供给源(例如，feso4)的浓度为0.5～50mm(例如为1mm)。另外，就本发明的无细胞系统检定方法而言，由于表示筛选系统的特性的指标(例如，s/b比、cv值、z'-因子(factor))是充分的值，因而能够应用于筛选方法。细胞系统检定方法本发明除了提供上述无细胞系统的检定方法之外，还提供一种使用由式(i)所示的nbd-teepo化合物的、用于检测脂质过氧化抑制活性的细胞系统检定方法。使用培养细胞(例如，来自人肝癌的hepg2细胞)而代替无细胞系统中使用的脂质体，且作为自由基反应引发剂代替aaph和二价铁供给源而使用花生四烯酸(以下称为“aa”)和过氧化氢叔丁基(tert-butylhydroperoxide，以下称为“tbhp”)中的任一种物质，来执行细胞系统检定方法。在1个实施方式中，具体的检定方法包括以下的工序。ⅰ)配制包含由式(i)所示的化合物和培养细胞的缓冲液；ⅱ)添加选自由花生四烯酸和过氧化氢叔丁基组成的组中的至少一种化合物；ⅲ)添加被测化合物；ⅳ)测定荧光；以及，ⅴ)从荧光测定结果求出被测化合物的活性值。在1个实施方式中，本发明的细胞系统检定试剂盒包括反应引发剂为花生四烯酸的检定试剂盒和反应引发剂为过氧化氢叔丁基的检定试剂盒的组合。细胞系统检定试剂盒的组成就本发明的细胞系统检定试剂盒而言，由式(i)所示的化合物的浓度为1.0～20.0μm(例如5.0μm)，培养细胞的浓度为1×104～1×105细胞数(例如为1×104细胞数)，被测化合物的浓度为5～500μm(例如为50μm)，花生四烯酸的浓度为100～400μm(例如为200μm)，过氧化氢叔丁基的浓度为100～400μm(例如为300μm)。另外，就本发明的细胞系统检定方法而言，由于表示筛选系统的特性的指标(例如，s/b比、cv值、z'-因子(factor))是充分的值，因而能够应用于筛选方法。本发明的检定试剂盒可以包括示出化合物的活性值的附加的说明书，其中，所述化合物示出脂质过氧化抑制的活性。将使用本发明的检定试剂盒或检定方法而得到的被测化合物的脂质过氧化抑制的活性值与附加的说明书中所记载的指标化合物的活性值进行比较就能够评价被测化合物的脂质过氧化抑制活性。在1个实施方式中，本发明的检定方法包括选自由反应引发剂为2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐的无细胞系统的检定方法、反应引发剂为硫酸铁(ⅱ)的无细胞系统的检定方法、反应引发剂为花生四烯酸的细胞系统的检定方法以及反应引发剂为过氧化氢叔丁基的细胞系统的检定方法组成的组中的至少两种以上检定方法的组合。另外，在1个实施方式中，本发明的检定试剂盒包括选自由反应引发剂为2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐的无细胞系统的检定试剂盒、反应引发剂为硫酸铁(ⅱ)的无细胞系统的检定试剂盒、反应引发剂为花生四烯酸的细胞系统的检定试剂盒以及反应引发剂为过氧化氢叔丁基的细胞系统的检定试剂盒组成的组中的至少两种以上检定试剂盒的组合。在脂质过氧化反应促进疾病的发作和进展的过程中发生脂质过氧化诱发性的细胞死亡(文献：uchidak.,prog.lipidres.,2003,42(4),318-43.)。使用3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝(以下称为“mtt”)的方法用于评价细胞存活率。还已知mtt法能够进行平板检定(plateassay)。在1个实施方式中，本发明的检定法包括遵照mtt法而包括以下工序的检定方法。ⅰ)按照mtt法，执行使用包含培养细胞的培养基、被测化合物以及花生四烯酸的检定方法，并选择示出高细胞存活率的化合物；和/或ⅱ)按照mtt法，执行使用包含培养细胞的培养基、被测化合物以及过氧化氢叔丁基的检定方法，并选择示出高细胞存活率的化合物。本发明的检定方法及检定试剂盒可以组合上述本发明的无细胞系统和/或细胞系统的检定方法以及检定试剂盒而包括遵照该mtt法的检定方法以及试剂盒。就该mtt法而言，由于表示筛选系统的特性的指标(例如，s/b比、cv值、z'-因子(factor))是充分的值，因而能够应用于筛选方法。还能够使用微孔板而执行本发明的任何一种检定方法。这里，微孔板可举出多孔板(例如，96孔板和384孔板)，但不限定于这些孔板。微孔板能够使用例如市场销售的微孔板。在1个实施方式中，使用微孔板的、本发明的检定方法的测定包括以下工序。即包括：ⅰ)将被测化合物的溶液分配到微孔板中；ⅱ)将包含由式(i)所示的化合物和脂质体或培养细胞的溶液分配到各孔中；ⅲ)在使用脂质体时，将包含选自由2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至少一种化合物的溶液分配到各孔中，在使用培养细胞时，将包含选自由花生四烯酸和过氧化氢叔丁基组成的组中的至少一种化合物的溶液分配到各孔中；以及，ⅳ)用酶标仪(microplatereader)测定荧光。(筛选方法)本发明为了寻找示出脂质过氧化抑制活性的化合物而提供一种筛选方法，该筛选方法包括对于某些化合物库使用本发明的检定方法的筛选工序。这里，化合物库可以是公知的化合物库，也可以不是公知的化合物库。作为公知的化合物库可举出汇集了已经获得食品(例如，美国食品药品监督管理局(fda))或医药品(例如，欧洲药品管理局(emea))的批准的化合物的化合物库(例如，普雷斯特威克化合物库(prestwickchemicallibrary))(该化合物库汇集的是专利权期限已届满的化合物)以及汇集了尚未获得那些食品或医药品的批准的化合物的化合物库(例如，东京大学创药机构的综合库(generallibrary)中的核心库(corelibrary))。图9示出了本发明的筛选方法的模式图。1次筛选在利用脂质体-aaph系统检定方法的筛选中，能够检测出：自抑制以水溶性aaph为来源的自由基物种的水溶性高的抗氧化物质至抑制脂质过氧化链式反应的脂溶性高的抗氧化物质的、具有自由基捕获能力的化合物。另外，在利用脂质体-fe2+系统检定方法的筛选中，在具有自由基捕获能力的化合物中脂溶性更高的化合物容易被检测，但另一方面存在不具有自由基捕获能力的铁螯合剂被检测的可能性。因此，在该1次筛选中，首先，从被测化合物中广泛地分选在aaph系统筛选中具有自由基捕获能力的候选化合物，接下来，对于在脂质体-aaph系统筛选中缩小了范围的化合物，在脂质体-fe2+系统筛选中进一步缩小候选脂溶性化合物的范围。使用本发明的检定方法的筛选方法作为1次筛选包括借助于使用脂质体的无细胞系统检定方法的筛选。本发明的1次筛选方法包括以下方法。即、用于选择脂质过氧化抑制活性高的候选化合物的筛选方法包括：ⅰ)从化合物库中选择被测化合物；ⅱ)进行借助于使用被测化合物的、使用2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐(以下称为“aaph”)的无细胞检定方法(以下称为“脂质体-aaph系统”)的筛选，并选择示出高活性值的化合物；以及，ⅲ)接下来，进行借助于使用在ⅱ)的工序中示出了高活性值的化合物的、使用二价铁离子供给源物质的无细胞检定方法(以下称为“脂质体-fe2+系统”)的筛选，并选择示出高活性值的化合物。根据在上述ⅱ)的筛选中测定的荧光强度并基于下式算出各被测化合物的活性值。活性值＝1-(flusample-flubackground)/(flucontrol-flubackground)其中，flusample：有aaph且有各化合物(n＝1)时的荧光强度，flubackground：无aaph时的荧光强度，flucontrol：有aaph而无各化合物时的荧光强度。根据在上述ⅲ)的筛选中测定的荧光强度并基于下式算出各被测化合物的活性值。活性值＝1-(aucsample/auccontrol)其中，aucsample：根据有fe2+且有各化合物(n＝1)时的荧光强度算出的曲线下方的面积，auccontrol：根据有fe2+而无各化合物时的荧光强度算出的曲线下方的面积。与已知具有高的脂质过氧化抑制活性的公知的化合物(以下称为“活性指标化合物”)的活性值进行比较而缩小候选化合物的范围。作为该活性指标化合物的例子，可举出依达拉奉、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(tempol)以及(-)-表儿茶素等。2次筛选在将汇集了未被批准为食品或医药品的化合物的化合物库(例如，东京大学创药机构的综合库(generallibrary)中的核心库(corelibrary))用作化合物库的情况下，就使用本发明的检定方法的筛选而言，出于检查细胞系统中的脂质过氧化抑制活性和细胞死亡抑制活性的目的，进行借助于使用培养细胞(例如，以人肝癌为来源的hepg2细胞)的本发明的细胞系统检定方法的筛选而作为更高层次的筛选(例如，2次筛选)。另一方面，在使用汇集了已经获得食品或医药品的批准的化合物的化合物库的情况下，无需检查细胞系统中的脂质过氧化抑制活性和细胞死亡抑制活性，因此可以适当地省略2次筛选。作为用于检查细胞系统中的脂质过氧化抑制活性的筛选，进行利用本发明细胞系统检定方法的筛选，并基于荧光强度的测定结果而求出活性值。而且，与活性指标化合物的活性值进行比较而缩小候选化合物的范围。本发明的2次筛选方法包括以下方法。即包括：ⅰ)进行借助于使用花生四烯酸的细胞系统检定方法的筛选，并选择示出高活性值的化合物；ⅱ)执行使用过氧化氢叔丁基的细胞系统检定方法，并选择示出高活性值的化合物；以及，ⅲ)选择在ⅰ)和ⅱ)的检定方法中均示出高活性值的化合物。在利用上述细胞系统检定方法的筛选中，根据在作为反应引发剂分别使用aa或tbhp而进行了测定时所测定的荧光强度的值并基于下式而求出了活性值。活性值＝100(aucsample-aucbackground)/(auccontrol-aucbackground)其中，aucsample：根据有反应引发剂且有各化合物(n＝1)时的荧光强度算出的曲线下方的面积，auccontrol：根据有反应引发剂而无各化合物时的荧光强度算出的曲线下方的面积，aucbackground：根据无反应引发剂且无各化合物时的荧光强度算出的曲线下方的面积。接下来，与活性指标化合物的值进行比较而缩小候选化合物的范围。图示在使用所得到的aa或tbhp的各筛选中所得到的上述活性值。在两个筛选中，分选示出脂质过氧化抑制的高活性值的候选化合物。另外，寻找示出脂质过氧化所诱发的细胞死亡抑制相关高活性的化合物。作为用于检查细胞系统中的细胞死亡抑制活性的筛选，使用以人肝癌为来源的hepg2细胞并进行将aa和tbhp用作自由基引发剂的检定而测定细胞存活率。根据该细胞存活率的值并基于下式而求出活性值。活性值＝100(存活率sample-存活率control(+))/(存活率control(-)-存活率control(+))其中，存活率sample：有反应引发剂且有各化合物(n＝1)时的细胞存活率，存活率control(+)：有反应引发剂且有各化合物时的细胞存活率，存活率control(-)：无反应引发剂且无各化合物时的细胞存活率。而且，与活性指标化合物的值进行比较而缩小候选化合物的范围。图示在使用所得到的aa或tbhp的各检定系统中所得到的上述活性值。在两个检定系统中，分选示出细胞死亡抑制(细胞死亡阻止)高活性值的候选化合物。在1个实施方式中，本发明的2次筛选方法进一步包括以下方法。即包括：ⅰ)按照mtt法，进行借助于使用包含培养细胞的培养基、被测化合物以及花生四烯酸的检定方法的筛选，并选择示出高细胞存活率的化合物；ⅱ)按照mtt法，进行借助于使用包含培养细胞的培养基、被测化合物以及过氧化氢叔丁基的检定方法的筛选，并选择示出高细胞存活率的化合物；以及，ⅲ)选择在ⅰ)和ⅱ)的检定方法中均示出高细胞存活率的候选化合物。3次筛选在使用的化合物库(例如，东京大学创药机构的核心库(corelibrary))中，有包含例如与在前面所述的低层次的筛选检定(例如，2次筛选)中示出高活性值的候选化合物相关的结构类似物的情况。因此，对于这种结构类似物也与候选化合物一起对于脂质过氧化抑制活性适当地进行更高层次的筛选(例如，3次筛选)而分选候选化合物。另外，对于这些候选化合物进一步进行利用检查细胞死亡抑制活性的检定方法的筛选。最后，综合考虑最终的高层次筛选(例如，3次筛选)结果和对于细胞死亡抑制活性的筛选结果而选定候选化合物。在1个实施方式中，本发明的筛选方法包括：ⅰ)从化合物库中选择通过基于本发明细胞系统检定的筛选方法来选择的化合物的结构类似物；ⅱ)对于在ⅰ)选择的化合物和原先适当地选择的化合物执行利用本发明细胞系统检定的筛选方法，并选择示出高活性值的化合物；ⅲ)对于在ⅰ)选择的化合物和原先适当地选择的化合物执行利用按照本发明mtt法的细胞检定的筛选方法，并选择示出高细胞存活率的化合物；ⅳ)在ⅱ)和ⅲ)的两个筛选方法中选择示出高活性值和高细胞存活率的候选化合物；ⅴ)对于在ⅰ)选择的化合物和通过基于细胞系统检定的筛选或基于按照mtt法的细胞检定的筛选来适当地选择的化合物，进行借助于使用包含培养细胞的培养基的检定方法的筛选，并选择示出高细胞存活率的候选化合物；以及，ⅵ)从在ⅳ)选择的化合物和在ⅴ)选择的化合物选择候选化合物。本发明的筛选方法能够用作高通量筛选方法。(筛选结果的应用)脂质过氧化反应中的脂质自由基所参与的疾病涉及到广泛的疾病领域。因此，对于每一种目标疾病，还能够基于对其作用机理的见识并考虑其它要素而缩小候选化合物的范围。例如，在以需要对血脑屏障的通透性的疾病为目标的情况下，可以考虑脂溶性而进一步缩小候选化合物的范围。具体地、在将脑梗塞和视网膜疾病(例如，年龄相关性黄斑变性)作为目标疾病的情况下，对血脑屏障具有通透性的化合物有利，另一方面，在将肝癌和动脉硬化症作为目标疾病的情况下，不需要对血脑屏障的通透性。(医药用途)在本说明书中使用的起因于脂质过氧化反应的疾病的“(进行)治疗”或“(进行)预防”是指包括(1)消除该疾病；(2)减轻或最小化该疾病的严重程度；(3)延缓该疾病的进展或发作(发病)；以及(4)减少、最小化或排除该疾病的发生或频率中的一项以上。例如，如图1所示，在本说明书中使用的“起因于脂质过氧化反应的疾病”或“脂质过氧化反应诱发性疾病”包括脂质过氧化反应与疾病的关系已知的疾病。例如，包括选自由阿尔茨海默型痴呆症、慢性肾脏病、糖尿病性神经病、肝损伤、年龄相关性黄斑变性、缺血性脑病、血管性痴呆症、动脉硬化症、帕金森病、多发性硬化症、癌症、哮喘、高血压、心血管疾病、以及年龄相关性眼病组成的组中的一种以上疾病。在本说明书中使用的“实施对象”包括人类或非人类动物。本发明的活性药物包括其药学上可接受的盐的形式。另外，本发明的活性药物或其药学上可接受的盐包括其水合物或与溶剂等的溶剂化物。另外，本发明包括本发明的活性药物的所有形式的晶体。作为药学上可接受的盐，例如包括与有机碱的盐(例如，二乙醇胺盐、乙二胺盐)和与无机碱(例如，碱金属(例如，钠、钾)的盐以及与碱土金属(例如，钙或镁)的盐。本发明的活性药物在使用于治疗或预防的情况下，作为医药组合物能够口服给药或非口服给药(例如，静脉内、皮下、或肌肉内注射、局部、经直肠、经皮、脊髄内或鼻腔给药)。作为用于口服给药的组合物，可举出例如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、溶液剂、混悬剂等，作为用于非口服给药的组合物，可举出例如注射用水性制剂或油性制剂、软膏剂、霜剂、润肤剂(lotion)、气雾剂、栓剂、贴剂等。这些制剂能够使用现有公知的技术而配制，并且含有在医药领域中通常使用的无毒性且惰性的载体或添加剂(以下称为“药学上可接受的载体”)。作为在本说明书中使用的“药学上可接受的载体”，只要不妨碍药理效应等，则除了含有有效活性成分之外，还可以根据各种用途而含有各种活性成分或药效成分(包括药理活性成分和生理活性成分)和添加剂(例如，缓冲剂、等渗剂、ph调节剂、防腐剂/保存剂、稳定剂、增稠剂、螯合剂、表面活性剂、香料等)的组合。就这样的成分而言，能够在不存在刺激等问题的浓度范围内适当地调配，且对成分的种类并无特别限制，可举出例如缓冲剂(例如，磷酸钠)、等渗剂(例如，氯化钠)、ph调节剂(例如，硼酸)、防腐剂/保存剂(例如，苯扎氯铵)、稳定剂(例如，甘露醇)、增稠剂(例如，海藻酸钠)、螯合剂(例如，乙二胺四乙酸钠)、表面活性剂(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、香料(例如，薄荷醇)等。在本说明书中使用的用语“(进行)给药”包括：向被测者个体提供和/或开处方活性药物或含有其的医药组合物；或者，该个体接受本发明的活性药物或医药组合物，等。就本发明的活性药物或医药组合物的给药途径而言，可以是任何给药途径，可以根据例如所指的疾病、症状、或被测者的年龄、体重、性别等而变化。在本说明书中使用的“有效量”是指足以提供所指效果即本说明书中所记载的脂质过氧化反应诱发性疾病的治疗或预防的活性药物的量。另外，对于所指的疾病，本发明的活性药物或医药组合物可以与公知的活性药物或医药组合物组合而使用。就本发明的活性药物的使用量而言，虽然根据各活性药物或医药组合物以及被测者的疾病、年龄、体重、性别、症状、给药途径等而变化，但在非口服给药的情况下，通常为每天0.001～100mg/kg，优选为0.01～100mg/kg。在口服给药的情况下，通常为每天0.01～1000mg/kg，优选为0.1～100mg/kg。本发明的活性药物每天一次或分多次(或者，2至3次)给药。另外，还可以每隔几天至几周给药一次。实施例将本发明的实施例作为实施例记载如下，但不限定于这些实施例。试剂、细胞培养相关试剂、荧光硝基氧化合物是使用了市场销售的制品或者按照公知的方法制备的物质。核心库(corelibrary)化合物、普雷斯特威克化合物库(prestwickchemicallibrary)化合物分别使用了东京大学创药机构、九州大学化合物库创药高级研究和教育基础中心所提供的化合物。另外，各种测定仪器使用了通常使用的仪器。(参考例1)nbd-tempo化合物的制备按照下述的顺序制备了2,2,6,6-四甲基-4-(4-硝基苯并[1,2,5]噁二唑-7-基氨基)哌啶-1-氧基(nbd-tempo)。具体地、在10ml的acoet(乙酸乙酯)中溶解366mg(2.0mmol)的4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑并加入了342mg(2.0mmol)的、4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基。在室温下搅拌3小时之后，加入饱和盐水，用acoet萃取，用na2so4干燥有机层，并将溶剂完全蒸馏掉。其后，通过硅胶柱色谱法(chcl3)进行分离提纯，得到了574mg橙黄色结晶(收率：86％)。hrms(esi+)计算值(caldfor)c15h20n5nao4[m+na]+：357.1413,测得值(found)：357.1415。(参考例2)dansyl-tempo化合物的制备按照文献(例如，lozinsky等人，lozinsky,e.,et.al.,j.biolchem.biophys.,methods,1999,38,29-42)中记载的方法制备了2,2,6,6-四甲基-4-(5-(二甲基氨基)萘-1-磺酰基氨基)哌啶-1-氧基(dansyl-tempo)。具体地、在5ml的丙酮中溶解1.03g(6.0mmol)的4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基并在冰浴中加入了1.35g(5.0mmol)的5-(二甲基氨基)萘-1-磺酰氯氯化物和0.483ml的吡啶。在室温下搅拌一夜之后，加入饱和盐水，用二乙醚萃取，用na2so4干燥有机层，并将溶剂完全蒸馏掉。其后，通过硅胶柱色谱法(chcl3：meoh＝99：1)进行分离提纯，得到了396mg(收率：20％)。hrms(esi+)计算值(caldfor)c21h30n3nao3s[m+na]+：427.1906,测得值(found)：427.1900。(参考例3)nbd-teepo化合物的制备按照文献(例如，bognar等人，bognar,b.,etal.,j.heterocycl.chem.,2006,43,81-86)中记载的方法制备了2,2,6,6-四乙基-4-(4-硝基苯并[1,2,5]噁二唑-7-基氨基)哌啶-1-氧基(nbd-teepo)。具体地、在10ml的acoet(乙酸乙酯)中溶解87.6mg(0.44mmol)的4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑和61μl的et3n(三乙胺)并加入了100mg(0.44mmol)的4-氨基-2,2,6,6-四乙基哌啶-1-氧基。在室温下搅拌6小时之后，加入饱和盐水，用acoet萃取，用na2so4干燥有机层，并将溶剂完全蒸馏掉。其后，通过硅胶柱色谱法(己烷(hexane)：acoet＝100：0～70：30)进行分离提纯，得到了83mg橙黄色结晶(收率：6％)。hrms(esi+)计算值(caldfor)c19h28n5nao4[m+na]+：413.2034,测得值(found)：413.2024(参考例4)nbd-pen化合物的制备与2,2,6,6-四乙基-4-(4-硝基苯并[1,2,5]噁二唑-7-基氨基)哌啶-1-氧基(nbd-teepo)的合成法相同地、用100mg(0.44mmol)的4-氨基-2,2,6-三甲基-6-戊基哌啶-1-氧基(8)来替代100mg(0.44mmol)的4-氨基-2,2,6,6-四乙基哌啶-1-氧基(4)而进行了反应。通过硅胶柱色谱法(己烷(hexane)：acoet＝100：0～70：30)分离提纯生成物，得到了83mg橙黄色结晶(收率：48％)。hrms(esi+)计算值(caldfor)c19h28n5nao4[m+na]+：413.2034,测得值(found)：413.2056(实施例1)荧光硝基氧探针的脂质过氧化反应响应性评价在37℃下，在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，0.5％dmso，0.5％乙腈)中混合了荧光硝基氧(nbd-tempo化合物或dansyl-tempo化合物)(5.0μm)和脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg/ml的dcp)。混合aaph(20mm)而开始了脂质过氧化反应。40分钟之后，对于nbd-tempo测定了激发波长为470nm、荧光波长为530nm时的荧光强度，对于dansyl-tempo测定了激发波长为300nm、荧光波长为500nm时的荧光强度。结果示于图2。用aaph刺激了已调节的脂质体，与未添加aaph时相比，在nbd-tempo中荧光强度上升了8.2倍。另一方面，在dansyl-tempo中荧光强度的上升停留于1.4倍。于是，决定将nbd基团用作荧光团。(实施例2)荧光硝基氧探针与各种还原性物质的反应性评价在37℃下，在包含脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg/ml的dcp)的磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，0.5％dmso，0.5％乙腈)中混合了荧光硝基氧(5.0μm)(nbd-tempo化合物、nbd-pen化合物、或nbd-teepo化合物)和50μm的各种还原性物质(asa、ua、tpl、eda、catechin、trolox)。混合aa(0.5mm)和lox(25μg/ml)而进行了脂质过氧化反应。40分钟之后，测定了激发波长为470nm、荧光波长为530nm时的荧光强度。这里，asa是指抗坏血酸，ua是指尿酸，tpl是指2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基，eda是指依达拉奉，catechin是指(-)-表儿茶素，trolox是指6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸。结果示于图3。选择了以下6种物质作为模型抗氧化物质(图(3a))。该6种模型抗氧化物质为在人体内起水溶性抗氧化物质作用且在诸多食品等中也含有的asa、作为人体血液中含量最高的抗氧化物质的尿酸、以及硝基氧化合物中因其毒性低而在使用了实验动物模型的研究中也广泛使用的4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶基-1-氧基(tempol)、被批准为游离基清除剂的依达拉奉(edaravone：eda)、包含在茶/葡萄酒等中而通常被摄取的catechin((-)-表儿茶素)、vite(维生素e)的类似化合物trolox。已知这些6种模型抗氧化物质的水-辛醇分配系数(logpo/w)以asa<ua<tpl<eda<catechin<trolox的顺序增大。在nbd-tempo化合物中荧光强度通过与asa的反应上升了大致7.7倍，在nbd-pen化合物中荧光强度通过与eda的反应上升了大致2.9倍。但是，在nbd-teepo化合物中荧光强度几乎未上升(图(3b))。(实施例3)荧光硝基氧探针与各种氧化性物质的反应性评价在37℃下，在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，0.5％dmso，0.5％乙腈)中混合了荧光硝基氧(nbd-tempo化合物、nbd-pen化合物、或nbd-teepo化合物)(5.0μm)和各种氧化性物质。作为氧化性物质使用了过氧化氢、次氯酸、氧化钾(各0.5mm)。由过氧化氢(0.5mm)和feso4(5.0μm)产生了·oh。由脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg/ml的dcp)和aaph(10mm)产生了脂质自由基。30分钟之后，测定了激发波长为470nm、荧光波长为530nm时的荧光强度。结果示于图4。无论在哪一个探针分子，荧光强度在与ros的反应中均几乎未上升。可知nbd-tempo化合物对于脂质过氧化反应的响应性最低，nbd-teepo化合物和nbd-pen化合物具有优良的脂质过氧化反应响应性。基于以上结果，决定使用示出最高的抗还原性且对脂质过氧化反应示出高响应性的nbd-teepo化合物。(实施例4)在人工脂质膜中的反应引发剂浓度依赖性脂质过氧化反应评价(nbd-teepo检定)在37℃下，在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，0.5％dmso，0.5％乙腈)中混合了探针(nbd-teepo化合物)(5.0μm)和脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg/ml的dcp)。混合aaph(0-20mm)或feso4(0-2.0mm)而开始了脂质过氧化反应。在aaph系统中经过40分钟之后、在fe2+系统中经过60分钟之后，测定了激发波长为470nm、荧光波长为530nm时的荧光强度。结果示于图5(aaph)和图6(feso4)。无论在aaph系统中还是在fe2+系统中探针的荧光强度均以浓度依赖方式上升(图(5a)和图(6a))。另外，在aaph系统中添加了水溶性asa而在fe2+系统中添加了脂溶性抗氧化物质eda，则以浓度依赖方式抑制了荧光上升(图(5b)和图(6b))。于是，测定了具有代表性的6种抗氧化物质的脂质过氧化抑制效果。与实施例5所示的现有方法即tbars法的结果(图(5d)和图(6d))进行了比较，其结果均示出了相同的倾向(图(5c)和图(6c))。对于使用nbd-teepo化合物的aaph或使用fe2+的无细胞系统的检定系统，检查了表示检定系统的特性的s/b比、cv值、z'-因子(factor)。结果示于下表。无论对于哪一个指标均超过了目标值(表1)。[表1]表1(实施例5)利用人工脂质膜中的抗氧化物质的脂质过氧化抑制评价(tbars检定)在37℃下，在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，0.5％dmso，0.5％乙腈)中混合了各种还原性物质(10μm)、脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg/ml的dcp)。混合aaph(20mm)或feso4(1.0mm)而开始了脂质过氧化反应。60分钟之后，用bht(10mm)停止了脂质过氧化反应。将醋酸(5.7％)、tba(0.56％)、sds(1.07％)加入并搅拌之后在60℃下60分钟进行了反应。进行离心分离(2000rpm，4℃，15分钟)后测定了激发波长为512nm、荧光波长为553nm时的荧光强度。与实施例4相同地测定了具有代表性的6种抗氧化物质的脂质过氧化抑制效果。结果示于图5(aaph)和图6(feso4)。示出了与实施例4的结果相同的倾向的脂质过氧化抑制效果。(实施例6)细胞培养使用dmem培养基(包含10％的fbs、1％的青霉素-链霉素以及1×mem非必需氨基酸)而在co2培养箱(37℃，5％的co2)中培养了人肝癌细胞(hepg2细胞)。在成为60-70％亚融合(subconfluent)状态时进行了传代。另外，在进行各种测定时使用了dmem培养基(不含酚红，含有1％的青霉素-链霉素)。(实施例7)反应引发剂浓度依赖性细胞内脂质过氧化反应评价(nbd-teepo检定)将hepg2细胞以10000细胞/孔接种在96孔板中。孵育并粘附了24小时。在dmem培养基(dmso为0.5％，乙腈为0.5％)中添加aa(0-200μm)或tbhp(0-300μm)以及探针(5.0μm)，并经45分钟之后，测定了激发波长为470nm、荧光波长为530nm时的荧光强度。(实施例8)利用抗氧化物质的细胞内脂质过氧化抑制评价(nbd-teepo检定)将hepg2细胞以10000细胞/孔接种在96孔板中。孵育并粘附了24小时。在dmem培养基(dmso为0.5％，乙腈为0.5％)中添加aa(200μm)或tbhp(0-300μm)、抗氧化物质(50μm)以及探针(5.0μm)，并经45分钟之后，测定了激发波长为470nm、荧光波长为530nm时的荧光强度。结果示于图7。观测到aa和tbhp浓度依赖性荧光上升(图(7a)和图(7c))。另外，通过添加抗氧化物质得到了抑制(图(7b)和图(7d))。示出了最强的抑制效果的是catechin，与反应引发剂无关地观察到相同的倾向。(实施例9)反应引发剂浓度依赖性细胞存活率变化评价(mtt检定)将hepg2细胞以10000细胞/孔接种在96孔板中。孵育并粘附了24小时。在dmem培养基(dmso为0.5％，乙腈为0.5％)中添加aa(0-100μm)或tbhp(0-100μm)，并经24小时之后更换了培养基。添加mtt溶液(0.5mg/ml，0.5％dmso)之后孵育4小时并消除了溶液。加入100μl的dmso并测定了630nm的吸光度。以未添加aa或tbhp为100％，计算了细胞存活率。(实施例10)利用抗氧化物质的细胞存活率变化评价(mtt检定)将hepg2细胞以10000细胞/孔接种在96孔板中。孵育并粘附了24小时。在dmem培养基(dmso为0.5％，乙腈为0.5％)中添加aa(200μm)或tbhp(0-300μm)、抗氧化物质(50μm)，并经24小时之后更换了培养基。添加mtt溶液(0.5mg/ml，0.5％dmso)之后孵育4小时并消除了溶液。加入100μl的dmso并测定了630nm的吸光度。以未添加aa或tbhp为100％，计算了细胞存活率。结果示于图8。细胞存活率因添加aa和tbhp而以浓度依赖方式降低(图(8a)和图(8c))。另外，其效果由抗氧化物质所抑制(图(8b)和图(8d))。另外，根据所使用的反应引发剂，显示了示出高抑制效果的抗氧化物质不同的倾向。对于使用nbd-teepo化合物或mtt的、使用aa或tbhp的细胞系统的检定系统，检查了表示检定系统的特性的s/b比、cv值、z'-因子(factor)。结果示于下表2和表3。无论对于哪一个指标均超过了目标值。[表2]表2：nbd-teepo化合物指标aa系统tbhp系统目标值s/b比4.12.22以上background的cv值(％)6.53.810％以下control的cv值(％)2.85.010％以下z'-因子(factor)0.830.620.5以上[表3]表3：mtt法指标aa系统tbhp系统目标值s/b比25.06.32以上background的cv值(％)4.76.910％以下control的cv值(％)4.86.910％以下z'-因子(factor)0.850.710.5以上(实施例11)东京大学创药机构1次筛选(aaph系统)从东京大学创药机构获得了化合物的2mm100％dmso溶液(分配为0.125μl/孔)。制备了在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，1.0％乙腈)中包含脂质体(5.0mg/ml的eggpc、0.2mg/ml的dcp)和探针(10μm)的溶液a、在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4)中包含aaph(40mm)的溶液b。将溶液a、溶液b通过自动分液器(multidropcombi)分别分配了12.5μl。最终浓度为在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，0.5％乙腈，0.5％dmso)中含有脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg/ml的dcp)和nbd-teepo化合物5.0μm、被测化合物50μm、20mm的aaph。在37℃下混合反应混合物并经40分钟之后，测定了激发波长为470nm、荧光波长为530nm时的荧光强度。另外，根据说明书中所记载的式子求出了各被测化合物的活性值。结果示于图10。在9600个化合物中，1858个化合物的活性值低于0，即、并未抑制脂质过氧化反应。另一方面，7711个化合物抑制了脂质过氧化反应，其中，836个化合物示出了比已知的化合物依达拉奉更高的活性值。决定将该836个化合物作为一次筛选中的苗头(hit)化合物(候选化合物)并进入对其在fe2+系统中的评价。(实施例12)东京大学创药机构1次筛选(feso4系统)接着，对于在aaph系统中示出了比依达拉奉更高的脂质过氧化抑制效果的836个化合物在fe2+系统中进行了评价。从东京大学创药机构获得了化合物2mm100％dmso溶液(分配为0.2μl/孔)。制备了在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，0.56％乙腈)中包含脂质体(2.78mg/ml的eggpc、0.11mg/ml的dcp)和探针5.6μm的溶液a、在蒸馏水中包含10mm的feso4的溶液b。将溶液a通过自动分液器(multidropcombi)分配了36μl。将溶液b通过自动化移液工作站(biomeknxp)分配了4μl。最终浓度为在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，0.5％乙腈，0.5％dmso)中含有脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg/ml的dcp)和探针5.0μm、被测化合物50μm、1.0mm的feso4。在37℃下混合反应混合物并每3分钟经时测定了激发波长为470nm、荧光波长为530nm时的荧光强度。根据180分钟的荧光强度算出了auc，并根据说明书中所记载的式子算出了各被测化合物的活性值(图11)。结果示于图12。在836个化合物中，268个化合物的活性值低于0，即、并未抑制脂质过氧化反应。另一方面，568个化合物抑制了脂质过氧化反应，其中，197个化合物示出了高于依达拉奉的活性。决定将抑制效果好的前80个化合物作为苗头化合物(候选化合物)并进入2次筛选。(实施例13)东京大学创药机构2次筛选(nbd-teepo检定)对于在1次筛选中分选的80个化合物进行了2次筛选。从东京大学创药机构获得了化合物10mm100％dmso溶液(分配为5.0μl/孔)。对其添加495μl测定用dmem培养基而调节为化合物100μm1.0％dmso溶液。将其通过自动化移液工作站(biomeknxp)以80μl等分试样分配到预先已接种了细胞的测定用板中。在被测化合物(100μm1.0％dmso)中手动分配了包含12.5μm的nbd-teepo化合物的dmem培养基(1.25％乙腈)64μl、溶解于pbs中的aa(2000μm，5.0％乙醇)或tbhp(3000μm)16μl。最终浓度为在dmem培养基(0.5％dmso、0.5％乙腈)中含有被测化合物50μm、200μm的aa或300μm的tbhp。在37℃下混合反应混合物并每3分钟经时测定了激发波长为470nm、荧光波长为530nm时的荧光强度。在aa添加系统中根据45分钟的荧光强度算出了auc，在tbhp添加系统中根据60分钟的荧光强度算出了auc，并根据说明书中所记载的式子算出了各被测化合物的活性值。结果示于图13。在aa添加系统中，80个化合物中40个化合物的活性值低于0％，即、在培养细胞系统中并未抑制脂质过氧化反应。另一方面，40个化合物抑制了脂质过氧化反应。其中，32个化合物示出了高于依达拉奉的活性(图(13a))。另外，在tbhp添加系统中，80个化合物中17个化合物的活性值低于0％，另一方面，63个化合物抑制了脂质过氧化反应。其中，31个化合物示出了高于依达拉奉的活性(图(13b))。决定图示2个系统中的活性值(图(13c))，将无论在哪一个系统中均示出高活性值的4种化合物：化合物no.7、48、64、80作为苗头化合物(图(13d))并进入3次筛选。化合物7：2-((4-(苯基氨基)苯基)氨基)-n-(4-氨磺酰基苯基)丙酰胺化合物48：2,6-二甲氧基-4-(2-(8-硝基喹啉-2-基)乙烯基)苯酚化合物64：n2,n2-二甲基-9h-芴-2,3-二胺化合物80：n-(3-甲氧基-4-((3-甲基-1-10h-吲哚并[3,2-b]喹啉-11-基)氨基)苯基)甲磺酰胺[化4](实施例14)东京大学创药机构2次筛选(mtt检定)对于在1次筛选中分选的80个化合物进行了2次筛选。从东京大学创药机构获得了化合物10mm100％dmso溶液(分配为5.0μl/孔)。对其添加495μl测定用dmem培养基而调节为化合物100μm1.0％dmso溶液。将其通过自动化移液工作站(biomeknxp)以80μl等分试样分配到预先已接种了细胞的测定用板中。在被测化合物(100μm1.0％dmso)中手动分配了dmem培养基64μl、溶解于pbs中的aa(1000μm，5.0％乙醇)或tbhp(1000μm)16μl。最终浓度为在dmem培养基(0.5％dmso、0.5％乙腈)中含有nbd-teepo化合物5.0μm、被测化合物50μm、100μm的aa或tbhp。24小时之后更换了培养基，添加mtt溶液(0.5mg/ml，0.5％dmso)之后孵育24小时而消除了溶液。加入100μl的dmso并测定了630nm的吸光度。以未添加aa或tbhp为100％，并根据说明书中所记载的式子计算了细胞存活率。结果示于图14。在aa添加系统中，80个化合物中6个化合物的活性值低于0％，即、并未抑制利用aa刺激的细胞死亡。另一方面，74个化合物抑制了利用aa刺激时的细胞死亡。其中，64个化合物示出了高于依达拉奉的活性(图(14a))。另外，在tbhp添加系统中，80个化合物中8个化合物的活性值低于0％，另一方面，73个化合物抑制了利用tbhp刺激的细胞死亡。其中，14个化合物示出了高于依达拉奉的活性(图(14b))。决定图示2个系统中的抑制率(图(14c))，且将无论在哪一个系统中均示出高抑制率的5种化合物：化合物no.19、39、52、73、78作为苗头化合物(图(14d))并进入3次筛选。化合物19：n-(2-氯苯基)-5-(2-(1-吡啶-2-基)亚乙基)肼基)-1,3,4-噻二唑-2-胺化合物39：1-(7,7-二甲基-2-氧代双环[2.2.1]庚烷-1-基)-n-(1-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)-n-甲基甲磺酰胺化合物52：3-氨基-4-(苯基氨基)苯甲酸甲酯化合物73：3-(2-(3-(2-羟基乙氧基)苯基)-3-((2-吗啉代乙基)氨基)咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基)苯甲酰胺化合物78：1-(4-(三氟甲氧基)苯基)二氢吲哚-5-胺[化5](实施例15)东京大学创药机构3次筛选(nbd-teepo检定)在东京大学创药机构核心库(corelibrary)中，针对于各化合物包含结构类似物。因此，对于上述候选化合物各自的结构类似化合物也与实施例13相同地进行了2次筛选并对活性值进行了评价。具体地、对于上述2次筛选中的9个苗头化合物no.7、19、39、48、52、64、73、78、80，分别获得了5个、2个、4个、6个、6个、5个、5个、10个、2个结构类似物，即总共获得了45个结构类似物。而且，对于加上原始9个化合物后的共54个化合物进行了3次筛选并同样地算出了活性值。结果示于图15、图16以及图17。1)首先，在使用了nbd-teepo的检定中，在aa添加系统中54个化合物中15个化合物的活性值低于0％，即、并未抑制脂质过氧化反应。另一方面，39个化合物抑制了脂质过氧化反应。其中，33个化合物示出了高于依达拉奉的活性(图(15a))。在tbhp添加系统中，54个化合物中9个化合物的活性值低于0％，另一方面，45个化合物抑制了脂质过氧化反应。其中，41个化合物示出了高于依达拉奉的活性(图(15b))。2)接下来，在mtt检定中，在aa添加系统中54个化合物中7个化合物的活性值低于0％，即、并未抑制借助于aa刺激的细胞死亡。另一方面，47个化合物抑制了借助于aa刺激时的细胞死亡。其中，31个化合物示出了高于依达拉奉的活性(图(16a))。在tbhp添加系统中，54个化合物中17个化合物的活性值低于0％，另一方面，37个化合物抑制了借助于tbhp刺激的细胞死亡。其中，37个化合物示出了高于依达拉奉的活性(图(16b))。3)进而，仅将被测化合物孵育72小时并进行了细胞毒性评价。就细胞毒性而言，在dmem培养基(dmso0.5％)中对hepg2细胞添加50μm抗氧化物质并在37℃下孵育72小时之后测定了细胞存活率。4)对于使用了上述nbd-teepo的检定和mtt检定的各检定，图示了在两个添加系统中的活性值(图(15c)和图(16c))，则化合物no.52的类似物(化合物no.52、52-1、52-3、52-4、52-5)和化合物no.78的类似物(化合物no.78、78-3、78-4、78-5、78-6、78-8)示出了高的脂质过氧化抑制效果和细胞死亡抑制效果(图(15d)和图(16d))。另外，化合物no.80的类似物(化合物no.80、80-2)虽然示出了最高的脂质过氧化抑制效果，但细胞毒性极高(图(17))。这里，这些化合物no.52及其类似物(化合物no.52-1～52-6)中，发挥了脂质过氧化抑制效果的化合物具有由下述结构表示的骨架(骨骼)a而作为共同结构。据报道，骨架a具有抗氧化活性(huml.,etal.,nutr.biochem.,1995,6,504-508)。另外，化合物no.78及其类似物(化合物no.78-1～78-10)中，发挥了脂质过氧化抑制效果的化合物具有由下述结构表示的骨架(骨骼)b而作为共同结构。[化6]以上的结果启示：通过本发明的筛选而被发现为候选化合物的化合物具有骨架a、骨架b而作为共同结构，具有骨架a、骨架b的化合物作为脂质过氧化抑制剂极为有用的可能性高。化合物52-1：3-氨基-4-((4-甲氧基苯基)氨基)苯甲酸甲酯化合物52-2：3-氨基-4-((2-甲氧基苯基)氨基)苯甲酸甲酯化合物52-3：3-氨基-4-((3-甲氧基苯基)氨基)苯甲酸甲酯化合物52-4：3-氨基-4-(苄基氨基)苯甲酸甲酯化合物52-5：3-氨基-4-((1-苯乙基)氨基)苯甲酸甲酯化合物52-6：n-(2-(苯基氨基)苯基)乙酰胺[化7]化合物78-1：1-(3,5-二甲基苯基)二氢吲哚-2,3-二酮化合物78-2：1-(3,5-二甲基苯基)-3,3-二氟二氢吲哚-2-酮化合物78-3：1-(3,5-二甲基苯基)-1h-吲哚-6-胺化合物78-4：1-(3,5-二甲基苯基)二氢吲哚-6-胺化合物78-5：1-(4-甲氧基苯基)-1h-吲哚-5-胺化合物78-6：1-(4-(甲硫基)苯基)-1h-吲哚-5-胺化合物78-7：1-(4-(三氟甲基)苯基)-1h-吲哚-5-胺化合物78-8：1-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1h-吲哚-5-胺化合物78-9：1-(4-(甲硫基)苯基)二氢吲哚-5-胺化合物78-10：1-(4-(三氟甲基)苯基)二氢吲哚-5-胺[化8](实施例16)普雷斯特威克化合物库(prestwickchemicallibrary)1次筛选(aaph系统)在本1次筛选中，在aaph系统和fe2+系统中作为被测化合物分别测定了1280个化合物。采用的实验方法和活性值的计算方法与上述方法相同，且作为化合物库采用了与东京大学创药机构核心库(corelibrary)的场合相同的化合物库。被测化合物是由九州大学化合物库创药高级研究和教育基础中心供给的磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，2％dmso)、20μm稀释液(分配为20μl/孔)。首先，在使用aaph系统检定的情况下，制备了在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，2.0％乙腈)中包含脂质体(10mg/ml的eggpc、0.4mg/ml的dcp)和nbd-teepo化合物(20μm)的溶液a、在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4)中包含80mm的aaph的溶液b。将溶液a、溶液b通过自动分液器(multidropcombi)分别分配了10μl。最终浓度为在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，0.5％乙腈，1％dmso)中含有脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg/ml的dcp)和nbd-teepo化合物5.0μm、被测化合物10μm、20mm的aaph。在37℃下经40分钟之后，测定了激发波长为470nm、荧光波长为530nm时的荧光强度。(实施例17)普雷斯特威克化合物库(prestwickchemicallibrary)1次筛选(feso4系统)接下来，在使用fe2+系统检定的情况下，制备了在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，2.0％乙腈)中包含脂质体(10mg/ml的eggpc、0.4mg/ml的dcp)和nbd-teepo化合物20μm的溶液a、在蒸馏水中包含4.0mm的feso4的溶液b。将溶液a、溶液b通过自动分液器(multidropcombi)分别分配了10μl。最终浓度为在磷酸缓冲液(10mm，ph7.4，0.5％乙腈，1％dmso)中含有脂质体(2.5mg/ml的eggpc、0.1mg/ml的dcp)和nbd-teepo化合物5.0μm、被测化合物10μm、1.0mm的feso4。在37℃下经180分钟之后，测定了激发波长为470nm、荧光波长为530nm时的荧光强度。结果示于图18和图19。1)其结果，在aaph系统中，1280个化合物中330个化合物的活性值低于0，即、并未抑制脂质过氧化反应。另一方面，950个化合物抑制了脂质过氧化反应，其中，190个化合物示出了比已知的化合物依达拉奉更高的活性值(图(18a))。在fe2+系统中，1280个化合物中434个化合物的活性值低于0，另一方面，846个化合物抑制了脂质过氧化反应。其中，19个化合物示出了比已知的化合物依达拉奉更高的活性值(图(18b))。将aaph系统和fe2+系统的结果相加得到了16个苗头化合物(图(19a)和图(19c))。2)普雷斯特威克化合物库(prestwickchemicallibrary)是汇集了已知具有药理活性的化合物的化合物库，因此，能够从该库提供的数据库和文献信息中获取与作用点、药代动力学、安全性等相关的信息。因此，基于这些信息对于该16个苗头化合物缩小了范围。这些苗头化合物中包含心血管系统、中枢系统、呼吸系统、抗菌药物等宽泛的疾病领域的治疗药物(图(19b))。(药理试验)检查了对于年龄相关性黄斑变性(amd)的药理活性。将作为萎缩型amd模型小鼠广泛地使用的光照射模型用作试验模型而进行了试验。就被测化合物而言，对于通过与上述普雷斯特威克化合物库(prestwickchemicallibrary)相关的筛选来分选的16个候选化合物，进一步缩小到据报道血视网膜屏障(brb)的通透性高的下述5种化合物(化合物v、化合物w、化合物x、化合物y、化合物z)而检查了药理活性。化合物v：阿朴吗啡((r)-(-)-盐酸阿朴吗啡)其已知为作用于多巴胺d1d2受体的抗帕金森病药。化合物w：毒扁豆酚碱((-)-毒扁豆酚碱延胡索酸盐)已知其具有作用于阿片样物质受体的镇痛作用。化合物x：乙氧基喹啉(6-乙氧基-2,2,4-三甲基-1,2-二氢喹啉)已知其具有抗氧化作用。化合物y：甲基多巴(甲基多巴倍半水合物)其已知为作用于肾上腺素α2受体的降压药。化合物z：奥氮平(2-甲基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)-10h-噻吩并[2,3-b][1,5]苯并二氮卓(benzodiazepine))其已知为作用于多种受体的抗精神病药[化9](操作)首先，按照下述时间表制备了amd模型小鼠。实验动物从日本slc株式会社购买了雄性balb/c小鼠(4周龄)，使其适应环境一周之后用来进行了实验。作为食物使其摄取了实验动物固体饲料(clearodentdietce-2、creajapan,inc.)，作为饮用水使其自由摄取了自来水，并在每12小时的明暗循环下进行了饲育。另外，在九州大学动物实验委员会的批准下执行了所有动物实验。光诱发性amd模型小鼠制备向balb/c小鼠腹腔内投入了5ml/kg的溶解于含有10％的聚乙二醇(polyethyleneglycol：peg)300的pbs的10mm的化合物。30分钟之后，在两只眼中各滴加了一滴作为散瞳剂的米得林(mydrin)p(托品酰胺5mg/ml、去氧肾上腺素盐酸盐5mg/ml、参天制药株式会社制造)。用8000lux的白色光照射10小时，并返回到通常的明暗循环饲育了6天。第7天通过颈椎脱臼法使其安乐死，并摘取了眼球(图(20a))。眼球冷冻切片的制备将被测化合物10mm溶解于含有10％peg300的pbs中并向雄性balb/c小鼠腹腔内投入了5ml/kg一次。给药30分钟之后，用8000lux的白色光照射了10小时。其后，在通常的明暗循环下饲育了6天，第7天安乐死之后，摘取了眼球。制备8μm厚的冷冻切片，并进行苏木精-伊红(hematoxylineosin：he)染色，对于外核层(outernuclearlayer，onl)的厚度每180μm共测定了27个点(图(20b))。he染色将制备物风干1小时，并在室温下用丙酮固定15分钟之后，按99.5％etoh、80％etoh、70％etoh、纯净水的顺序各浸渍3分钟，并用苏木精染色10分钟。其后，进行流水洗涤10分钟，在温水中浸泡1分钟，并用伊红进行了1.5分钟的染色。用纯净水洗涤后，按70％etoh、80％etoh、99.5％etoh的顺序各浸渍了3分钟，之后，用二甲苯洗涤3次，干燥之后用vectamount(商标)封固剂(mountingmedium)进行了密封。用基恩士荧光显微镜(bz-9000)进行了观察和摄像。统计分析以平均值+标准偏差表示了结果。作为多组间检验方法使用了邓奈特检验(dunnett'stest)。(结果)摄像结果示于图21。图中，上方存在内核层(inl)，中间存在外核层(onl)，下方存在视网膜色素上皮(rpe)。一旦由于脂质过氧化而引起细胞死亡，则中间的外核层的厚度变薄。首先，onl的厚度因光照射而有了明显減少(参照图21(a)阴性对照品)。onl损伤的程度在眼球的上半部(superior)侧尤其严重(图21(b))，这些结果与在文献(例如，tanitom.,etal.,invest.ophthalmol.vis.sci.,2007,48(4),1900-5.)中所知的结果一致。另一方面，在本试验中所使用的5种被测化合物的情况下，与阳性对照品的情况相比，onl的厚度无论在何种情况下均几乎没有差异，即使在50μmol/kg的相同的使用量的情况下，与作为对照化合物的依达拉奉或ot-551的情况相比，也观察到明显的厚度(图21(c))。这里，据报道，已知具有高的视网膜保护效果的ot-551在光照射模型小鼠中需要大致100mg/kg(360μmol/kg)左右。因此，本试验中的50μmol/kg是大致七分之一的量，是相当低的剂量。另外，50μmol/kg为各个5个被测化合物的半数致死量(medianlethaldose：ld50)的十分之一以下，其已被证实是安全的(参照图22)。以上的结果启示：通过本发明的筛选而分选的化合物是有用于年龄相关性黄斑变性的化合物。工业上的可利用性根据使用本发明的荧光性化合物的检定方法、检定试剂盒、以及筛选反应，容易寻找示出脂质过氧化抑制活性的化合物。另外，利用本发明筛选方法的候选化合物有用于治疗脂质过氧化反应诱发性疾病例如年龄相关性眼病。当前第1页12