定量的液体活检诊断系统与方法与流程
本发明提供了基于简单的血液样品的定量的液体活检诊断系统和用于执行诊断分析的方法。所述系统提供了液体活检方法，该方法检测并识别源于患者血细胞中的血细胞亚群，包括稀有细胞，例如循环肿瘤细胞(ctc)，用于精确诊断癌症、疾病演变的早期检测和癌症患者管理。本发明利用选择性平面照明显微镜(spim)，为检测和分离个体ctc提供高灵敏度和特异性，取代现有的早期癌症检测方法的功效。分离的ctc可以分析它们的分子指纹，其可以导致基因异常与特定药物治疗相匹配。该系统允许离体观察活肿瘤细胞对治疗的响应。活细胞的这种观察为肿瘤学家提供了通过测试患者自身的细胞来优化治疗方案，然后给患者提供治疗，以期望提高疗效和减少对正常细胞的毒性的新的潜力。
发明背景
传统的实体组织活检是癌症诊断的金标准。然而，这些分析是静态的，并且需要固定和染色的样品，通过传统显微镜技术进行组织学分析。这限制了样品的尺寸和厚度，并且在动态条件下，没有提供更容易地取得样品和监测样品的机会。对于疾病进展和患者管理的持续监测，液体活检具有独特的优势，因为它们涉及无创性的、基于血液的无细胞dna(cfdna)或ctc的检测。cfdna(包括循环肿瘤dna、ctdna)的分子分析，对检测驱动突变、结构重排、拷贝数异常和dna甲基化中的变化，具有较高的敏感性和特异性，因此为疾病监测提供了有价值的信息。
然而，驱动基因不会使得病人致死。相反，侵袭性肿瘤细胞却会。ctc分析允许对整个细胞进行研究，并提供dna、rna和基于蛋白质的分子图谱，以及可以指导精确治疗的功能性研究的机会。
在癌症患者的血液中以1:108到1:106或更高的频率检测到ctc。在涉及上皮至间充质转化(emt)的一系列生物学事件后，ctc在原发性肿瘤的循环中被释放。单个肿瘤细胞或肿瘤细胞簇离开原发性肿瘤部位，侵入血管，并且在全身游走，直到离开血流。在一个相反的，间充质至上皮转化(met)后，细胞在不同的组织中定居，从而产生转移形成的萌芽。检测血液中的ctc是具有挑战的，这既是因为它们的稀缺性，又是因为它们可以表达不同的表型。这些表型包括上皮的、间充质的和干细胞特性样的(stemness-like)ctc，但其特征可以随着时间的推移而改变，从一种状态转换到另一种状态，反之亦然。参见joosseetal(2015).biology,detection,andclinicalimplicationsofcirculatingtumorcells.embomolmed7:1–11。
早期商业化的ctc分析系统之一，是在2000年中期发展的cell
自早期商业系统开发以来，多个具有不同终点的研究和试验分析了cellsearchctc计数的临床实用性。结果表明，ctc数量的增加(每7.5ml的全血有5个)与在转移性乳腺癌(mbc)的预后不良有关。在2003年至2012年之间，进行的一项涉及2000名mbc患者的综合研究，证实了ctc计数对无进展存活率(pfs)和总存活率(os)的独立预后影响。这也证实了当加入完整的临床病理预测模型时，ctc计数可提高mbc的预测，这是血清肿瘤标志物不能做到的。参见bidard,fc(2014).clinicalvalidityofcirculatingtumorcellsinpatientswithmetastaticbreastcancer:apooledanalysisofindividualpatientdata)，lancetoncol.15:406-14。
除了计数之外，一些研究还讨论了ctc的基因型和表型表征的问题。在转移性乳腺癌(mbc)中，由于有多种药物是以人表皮生长因子受体2(her2)为靶点，并且有利于患者的管理，因此在dna、m.rna和蛋白质水平检测her2被广泛应用。在转移性肾癌中，ctc亚群的存活与凋亡的动态变化是化疗响应的一个预测指标。参见pestrinetal.(2012)finalresultsofamulticenterphaseiiclinicaltrialevaluatingtheactivityofsingle-agentlapatinibinpatientswithher2-negativemetastaticbreastcancerandher2-positivecirculatingtumorcells.aproof-of-conceptstudy.breastcancerrestreat134:283–289。在早期乳腺癌中，包括2800多名患者在内的几项研究表明，ctc的检测与预后不良独立相关。参见frankenetal(2012).circulatingtumorcells,diseaserecurrenceandsurvivalinnewlydiagnosedbreastcancerbreastcancerres,14:r133。
现在使用的几乎每一种ctc诊断系统都需要富集，以将患者血液中的ctc丰度从小于或等于约1:106增加到约1:1000的有核细胞，这使得显微镜检查是可行的。如果没有富集步骤，很难以其它方式找到并定性或定量评估ctc。富集后，通过免疫染色或原位杂交对样本进行ctc-特异性生物标记物染色。富集方法是利用细胞表面标记物(例如epcam)，进行基于抗体的ctc捕获，或利用一些物理分离方法，例如过滤。任何一种方法都是做出选择性假设，导致对所有ctc的不完全检测。由于已知ctc有助于转移的形成，所以尽可能准确地识别和表征它们是非常重要的。
因此，可以看出，现有技术受到传统的固体组织活检方法或需要繁琐的富集步骤(这可能会增加方法的误差)的ctc分析系统的限制。本发明利用选择性平面照明显微镜(spim)的新应用，提供了快速分析系统用于在更真实的生物条件下表征和定量ctc而无需富集步骤，因此为传统的固体组织活检方法提供了有用的替代方法。
技术实现要素：
本发明涉及液体活检技术诊断系统，用于检测和分析ctc，并允许转移性疾病进展的表征。它还可以检测和表征其它亚群的血细胞，例如t细胞。高信息量的诊断信息有助于临床肿瘤学家优化患者治疗，具有提高患者的治疗效果的可能，并减少和最小化患者的副作用。这样的系统可以在有执照的遵守医疗保险和医疗补助服务中心(cms)规定的严格质量标准的临床实验室中运行。经美国食品药品监督管理局(fda)适当的批准后，也可作为体外诊断设备(ivd)提供给临床市场。
附图说明
本领域技术人员将理解，附图主要用于说明性目的，并不打算限制本文所述发明主题的范围。附图并不是必须缩放；在某些情况下，为了便于理解不同的特征，本文公开的发明主题的各个方面，可以在附图中被夸大或放大地示出。在附图中，相似的参考特点通常指相似的特征(例如，功能相似和/或结构相似的元素)。
图1示出了常规的(即现有技术的)用于肿瘤治疗中肿瘤诊断的活检范例的示意图。在图的左上角，六个轮廓代表在六个时间点的代表性女性患者。轮廓中的每个点代表一个单独的病变部位。图左下方的乳房x光片和活检注射器的特写照片，代表在时间点2从女性患者处取组织活检。然后将活检样本制备为组织块进行分析，如图右上角戴着手套的手拿着组织块的照片所示。然后用组织学方法(显微镜载玻片照片-三张右下图像的最左边的照片)、荧光原位杂交(fish)(图像照片-三张右下图像的中间照片)和聚合酶链式反应(pcr)分子检测(pcr凝胶照片-三张右下图像的最右边的照片)对样品等份进行分析。
图2示出了本发明的选择性平面照明显微镜(spim)成像方法的示意图。平面光片，例如激光光片，用于照亮和穿透细胞样品，例如图示的圆柱形凝胶鞘细胞悬浮液。通过在仪器的光片路径中移动样本，可以获得多个连续的成像平面。光发射，例如荧光发射，是垂直于入射平面光片从样品中观察到的。
图3示出了本发明实施例的仪器设置的照片。指出了下列组件：总体系统(设置)1、光学控制器2、激光光源3、照明路径组件4、滤光轮7、x、y、z旋转台8、腔室(用于容纳如水溶液等介质的观察腔室)10、样品(样本)支架11。
图4示出了本发明的系统的实施例的示意图。所示的一些组件包括：照明物镜5、观察物镜6、腔室10、样品(样本)管12、样品(样本)13。还示出了用于从腔室10提供和去除介质的装置。
图5示出了图3的仪器组的特写照片。指出了下列组件：照明物镜5、观察物镜6、x、y、z旋转台8、腔室10、样品(样本)支架11、样品(样本)管12。
图6是适用于本发明的系统的细胞抽吸系统的展示。所示为样品(样本)管12、样品(样本)13，其样品(样本)包含细胞14、目标细胞15、微量注射器20和注射器导管21。
图7示出了可以在临床实践中使用的本发明的液体活检诊断系统和方法的示意图。在图的顶部有五个轮廓，代表五个时间点的代表性女性患者。轮廓中的每个点代表一个单独的病变部位。从最左侧轮廓的右上角发出的特写图像簇，代表形成图1的右半部分的图像簇，示出了传统的组织活检和分析。活检样品制备为组织块进行分析，如图右上角戴着手套的手拿着组织块的照片所示。然后通过组织学(显微镜载玻片照片-下面三幅图像的最左边的照片)、荧光原位杂交(fish)(图像照片-下面三幅图像的中间照片)和聚合酶链式反应(pcr)分子检测(pcr凝胶照片-下面三张图片的最右边的图片)对样品进行分析。在每一个轮廓图的下面，是循环肿瘤细胞(ctc)的分析的说明，这些细胞可以使用本发明的系统和方法从患者的血液样本中定量和评估。如图所示，该系统和方法可用于监测患者跨时间的癌症治疗的功效。图底部的流程图代表了患者监控和治疗的各个方面。
具体实施方式
本发明涉及用于表征和定量血液样品中靶细胞的方法，包括以下步骤：
(a)从受试者获得血液样品，
(b)通过以下步骤(i)到(vi)中的一个或多个制备样品，包括
(i)离心以从血清层分离细胞层
(ii)去除细胞层中的一层，
(iii)在缓冲液中悬浮从步骤(b)(ii)中去除的层，
(iv)纯化(b)(iii)的悬浮层，
(v)固定(b)(iv)的纯化层，以及
(vi)将(b)(v)的固定层免疫染色和/或荧光原位杂交(fish)染色，
(c)将制备好的样品从(b)置于选择性平面图像显微镜下，通过光(例如激光)片源在多个横截面扫描样品，以获得连续的横截面图像，
(d)收集足够数量的连续的横截面图像，
(e)编译连续的横截面图像以生成合成图像，以及
(f)评估合成图像，以表征和定量任何靶细胞的血液样品。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中步骤(c)的扫描是在激光片光的一个或多个所选择的激发频率下进行的。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中步骤(d)的收集涉及与步骤(c)的激光片光源正交的样品的荧光发射的检测。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中步骤(f)的合成图像是三维图像。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中(b)(i)或(b)(ii)的层是血沉棕黄层。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中步骤(b)(iii)的缓冲液是磷酸盐缓冲液。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中步骤(b)(v)的固定是在维持细胞结构的凝胶中，例如琼脂糖凝胶，或胶原凝胶，或聚丙烯酰胺凝胶。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中所述受试者是哺乳动物或鸟类。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中所述受试者是人。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中所述靶细胞被表征。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中所述靶细胞被定量。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中所述靶细胞为循环肿瘤细胞(ctc)。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中所述靶细胞是白细胞(wbc)亚群。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中所述白细胞(wbc)亚群是t-细胞。
在另一方面，本发明涉及一种用于定量和表征生物样品中的靶细胞的系统，包括：
(a)选择性平面照明显微镜
(b)样品固定装置，该样品固定装置用于容纳生物样品，
(c)检测器，该检测器用于收集从显微镜垂直(90度)反射到光学平面的光图像，
(d)计算机界面，以及
(e)计算机，该计算机用于编译光图像以生成三维图像。
在另一方面，本发明涉及的系统进一步地包括用于分析3-d图像以检测靶细胞的软件。
在另一方面，本发明涉及的系统，其中所述选择性平面照明显微镜包括：
(i)激光光源，
(ii)装置，该装置用于从激光光源产生片光，以及
(iii)物镜。
在另一方面，本发明涉及的系统，其中用于产生光片的装置是圆柱形透镜。
在另一方面，本发明涉及的系统，其中所述激光光源是圆束激光光源，其中用于产生光片的装置是通过在单个方向上扫描激光光源。
在另一方面，本发明涉及的方法，用于诊断受试者的疾病状态，包括以下步骤：
(a)从受试者获得生物样品，
(b)将生物样品置于选择性平面图像显微镜下，通过激光片光源在多个横截面扫描样品，以获得连续的横截面图像，
(c)收集足够数量的连续的横截面图像，
(d)编译连续的横截面图像以生成合成图像，和
(e)评估合成图像中所选择的靶细胞的存在，以及
(f)基于步骤(e)中的评估进行诊断。
在另一方面，本发明涉及的方法，用于诊断和治疗受试者的疾病状态，包括以下步骤：
(a)从受试者获得生物样品，
(b)将生物样品置于选择性平面图像显微镜下，通过激光片光源在多个横截面扫描样品，以获得连续的横截面图像，
(c)收集足够数量的连续的横截面图像，
(d)编译连续的横截面图像以生成合成图像，和
(e)评估合成图像中所选择的靶细胞的存在，
(f)基于步骤(e)中的评估进行诊断，以及
(g)基于步骤(f)中的诊断治疗受试者。
在另一方面，本发明涉及的方法，用于诊断，或诊断和治疗疾病状态，其中所述受试者是人类受试者。
在另一方面，本发明涉及的方法，其中所述疾病状态为癌症。
在另一方面，本发明涉及的方法，用于诊断，或诊断和治疗疾病状态，其中所选择的靶细胞是循环肿瘤细胞(ctc)。
在另一方面，本发明涉及的方法，用于诊断，或诊断和治疗疾病状态，其中所述ctc被表征。
在另一方面，本发明涉及的方法，用于诊断，或诊断和治疗疾病状态，其中所述ctc被定量。
在另一方面，本发明涉及选择性平面照明显微镜在制备药物中的用途，所述药物用于表征和定量生物样品中所选择的靶细胞。
在另一方面，本发明涉及的用途，其中所述生物样品是人类血液样品。
在另一方面，本发明涉及的用途，其中所选择的靶细胞是循环肿瘤细胞(ctc)。
在另一方面，本发明涉及的方法，用于表征和定量在血液样品中的靶细胞，其中不需要对从步骤(b)获得的样品进行靶细胞的富集或浓缩。
在另一方面，本发明涉及的方法，用于表征和定量在血液样品中的靶细胞，其中样品中每约1×106个总细胞(总有核细胞)包括约1个或更少的靶细胞。
在另一方面，本发明涉及的方法，用于表征和定量在血液样品中的靶细胞，其中样品中每约1×105个总细胞(总有核细胞)包括约1个或更少的靶细胞。
在另一方面，本发明涉及的方法，用于表征和定量在血液样品中的靶细胞，其中样品中每约1×104个总细胞(总有核细胞)包括约1个或更少的靶细胞。
在另一方面，本发明涉及的方法，用于表征和定量在血液样品中的靶细胞，其中样品中每约1×103个总细胞(总有核细胞)包括约1个或更少的靶细胞。
本发明的这些和其他方面将从本文的公开内容中变得显而易见。
选择性平面照明显微镜(spim)
光片荧光显微镜(lsfm)是一种荧光显微镜技术，其中，样品被一个垂直于观察方向(即垂直于观察方向或与观察方向成90度角)的激光光片(即仅聚焦于一个方向的激光束)照亮。可以使用例如圆柱形透镜，或通过沿一个方向扫描的圆形光束，来创建光片。据报道，只有样品的实际观察部分被照亮。因此，报道了这种方法来减少对活体样品引起的光损伤和应力。此外，据报道，良好的光学切片能力降低了背景信号，从而产生了具有更高对比度的图像，可以与共焦显微镜相媲美。此外，选择性平面照明显微镜(spim)和其它用聚焦的光片来照亮样品的荧光显微镜技术，在发展研究中已越来越流行。荧光光片显微镜，填补了荧光立体显微镜与固定组织切片高分辨率成像之间的在图像质量上的差距。此外，高深度渗透、低漂白和高采集速度，使得光片显微镜非常适合于长时间延时实验。参见huiskenetal(2009).selectiveplaneilluminationmicroscopytechniquesindevelopmentalbiology.development136,1963-1975doi:10.1242/dev.022426。lsfm系统可以从蔡司(zeiss)、莱卡(leica)或奥林巴斯(olympus)等公司购买。也可以通过开放源组，如openspim或spim-fluid所提供的设计，建立这些系统用于研究目的。参见，http://openspim.org/welcome_to_the_openspim_wiki；和https://doi.org/10.1364/boe.6.004447。
本发明的系统和方法
本发明的系统和方法能够精确地检测上皮的、间充质的或具有干细胞特性样的ctc，包括中间表型，因为其设计为用于定量检测多个ctc生物标记物。它为临床诊断、学术研究和药物开发，提供了病人血液样品中的全自动ctc检测。本系统不需要富集，因为它的高分辨率和高速显微镜可以扫描和分析源于患者样品中的每个有核细胞，并对ctc或其它血细胞亚群，例如t-细胞，进行非常敏感的检测。
所述系统除了在不富集的情况下检测和表征ctc外，还具有观察活细胞制剂的独特能力。该系统能够(i)对疾病进展进行空间性和时间性的表征，以及(ii)通过离体成像实时观察ctc表型变化。
本发明的系统可以包括水溶液填充的细胞观察腔室。这可以实现观察固定细胞或活细胞制剂。该腔室可以配备介质再循环系统，该介质再循环系统使细胞能够灌注(perfusion)含有以下物质的溶液：(i)生物标记物，例如适当地标记用于计数和定量的抗体或荧光原位杂交(fish)探针，(ii)用于染色dna或其它分子的物质，(iii)包括可影响活的靶细胞生理的治疗物质、病毒悬浮液等，(iv)去染色溶液，(v)清洗和去污染溶液。
该系统的“无损的(lossless)”ctc检测适用于不同癌症类型。通过扫描源于血液样品中的每个有核细胞，利用与不同ctc表型相关的多个标记物。该系统能够检测上皮的、间充质的和干细胞特性样的ctc。生物标记物水平的定量成像也可以检测不同ctc表型之间的ctc转换。
与其它微观方法不同，所述系统的高分辨率显微镜具有非常低的光毒性(即光敏成分的光诱导降解，或一般不利的光诱导效应)，其允许在连续时间点上给定样本的多个成像会话。
本发明的系统可以包括细胞抽吸装置，所述细胞抽吸装置允许从样本中去除靶细胞(包括活细胞)，以进行进一步的分子的、单细胞的测试。通过系统分离的ctc可作为组织来源，用于通过利用随后的离体培养，进行药物敏感性试验，和检测在ctc衍生的细胞系中的特异性突变。在ctc衍生的细胞系中，可以研究细胞对特定化疗、或靶向治疗或上述组合的抗性。药物敏感性试验也可在小鼠异种移植模型中进行。ctc模型的临床实用性可以取决于(i)检测ctc的患者百分比和(ii)ctc模型是否能够可靠地捕捉不同药物的响应。本发明的系统和方法有助于将ctc基因组和转录组分析，与ctc衍生的细胞系和小鼠模型的药物敏感性测试结合起来；这可以为推动个性化癌症治疗，提供新的见解。
上述概念和下文更详细讨论的附加概念的所有组合(前提是这些概念不相互矛盾)是本文公开的发明主题的一部分。特别是，本发明结尾处出现的所有权利要求保护的主题的组合都是本文公开的发明主题的一部分。本文中使用的术语也可能出现在通过引用并入的任何公开中，应赋予其与本文中公开的特定概念最一致的含义。
图3、4和5显示了定量液体活检诊断系统，该系统包括一样本腔室(图3和5中所示的附图标记10)，形状为正交平行六面体，在四个相邻边上都有圆孔，其中连接相对边上孔的几何中心的两条线相互垂直，且平行于另两条边。腔室可以由具有最小热膨胀系数的材料制成，在35℃到45℃温度范围内，允许但可以忽略膨胀或收缩，例如石墨复合材料。在样本腔室的四个孔中最多可安装四个物镜，这些孔与图像数字化装置相连。这些透镜可以是具有适当放大倍数、数值孔径和工作距离的水浸式物镜。
样本腔室10可以包括传感器，以报告精度不低于0.001℃的温度。可以在样本腔室中安装热电冷却/加热元件，以控制精度不低于0.01℃的温度。样本腔室10还可以包括液体处理系统，所述液体处理系统包括入口和出口，以允许用各种液体溶液改变腔室的内容物。液体入口和出口可通过数字化管理的微注射系统进行操作，所注射的液体溶液适当充气，以能够维持活细胞的培养。
所述系统还进一步地包括电离辐射源3，所述电离辐射源3位于样本腔室10的紧邻处，并且是数字化操作的。所述系统还可以包括生物样本样品支架11，所述生物样本样品支架11能够支撑包裹在圆柱形凝胶鞘中的生物样本13。样本支架11提供一定程度的刚性，使其能够承受机械约束，并且同时不干扰活细胞的生长。样品样本支架11可以制造为不妨碍对生物样本的光学观察，并允许通过微量移液器接近该样本的任何部分。
制造了显微镜载物台8，用于安装生物样本样品支架，以便其能够沿着物镜的光路适当地定位生物样本支架。显微镜载物台8是电动旋转生物样本的，并使其在x、y和z方向移动。机械臂安装在载物台的顶部，使其可以在载物台的内部和外部装载和卸载生物样品支架。
用于去除生物样本的靶向部分的微抽吸子系统可以安装在腔室的侧面。该微抽吸系统允许一个或多个微量移液器穿过腔室壁，例如进入生物样本的特定位置。微抽吸系统可以装配xyz载物台，驱使抽吸移液管进入凝胶中。微抽吸系统可以装配数字化控制的微型注射器(微量注射器(microsyringe)20，所述微型注射器20去除生物样本的一部分，并将其沉积到适当的容器中，以供进一步处理和分析。
中央计算机系统(未示出)操作一个软件包，所述软件包(a)采集并处理生物样本特征的图像以进行识别和定量，(b)启动系统的电动组件、泵、传感器，(c)操作装载和卸载样品的机械臂，(d)启动电离辐射源，以及(e)处理在局域或广域网中管理的数字化信息。中央计算机系统可以使用本地或分布式处理协议。
该系统还包括或耦合到可调谐激光源或多个单波长激光源，以及光管理光路。调制激光片的光学系统可以结合双边照明，以产生用于spim的片状照明。
成像是通过利用单色和/或可调谐激光源提供的窄光谱激发光照射样本来完成的。通过高灵敏度的单色摄像机逐场获取所产生的发射图像。将这些图像组合成三维堆叠，然后对其进行分析，以定量测量单个细胞中的生物标记物水平。
在操作中，包括活细胞的生物样本，用各种针对蛋白质、核酸或其它细胞成分的标记物染色，并包裹在适当形状的圆柱形鞘中，以安装在生物样品支架上。制备方法是在溶液仍然是液体的温度下，将细胞悬浮液与琼脂糖或其它与保持所嵌入的细胞的亚细胞结构相容的凝胶混合。除了这些细胞外，还向溶液添加作为识别细胞的基准参考的荧光微球(bead)。液体细胞/微球/凝胶悬浮液抽吸到管道中，所选择的管道对所使用的荧光区域是透明的。待样品凝固后，可在光路中观察到样本。生物样本13安装在装载在显微镜载物台上的样本支架上，并降低到充满水溶液的观察腔室10中。
观察腔室10安装在光路中，其包括数码摄像机，该数码摄像机以适合于检测和定量通过使用特定染色剂显示的亚细胞结构的分辨率来收集样本图像。图像分析算法监测样本相对于光路的位置，并通过对电动的x、y、z旋转样品载物台直接命令，进行位置校正。
样本通过水浸光学成像。成像是连续进行的，使生物样品的延时三维图像被数字化。通过液体处理系统，通过灌注将介质注入(insertedin)腔室，对生物样本进行处理。这些溶液可能包括生物活性分子，其将与生物样本的细胞发生反应。适当定时和适当定量的辐射剂量可以瞄准并传递到生物样本。
在运行中，系统可以执行以下一些或全部操作：
(a)将嵌入基质/凝胶中的细胞悬浮液安装在适当的样品支架中，然后连接到xyz/旋转载物台并插入光路中。
(b)通过机械臂进行样品支架到载物台的插入和去除。
(c)利用载物台将样本的连续区域定位到合适的xyz位置上自动分析样品，以进行图像采集。
(d)图像是通过将样本连续暴露在适当的照明团(illuminationregiment)下获得的，所述照明团的波长和强度适合于采集与细胞染色探针相关的信号。通过操作连接到适当速度的计算机系统的高灵敏度和高速摄像机，可以自动完成图像采集。
(e)根据需要编译二维图像以形成三维或更高维图像，以反映多个照明团和与时间相关的采集。
(f)图像处理可以实时进行，以识别出目标细胞和亚细胞成分。
(g)定量分析信号在给定细胞中的形态和相对位置，提供评估特定蛋白质的表达水平、rna水平或dna异常的能力。
(h)成像算法处理可以智能地指导特定样本的连续成像/处理。
(i)通过计算机系统处理可以控制和修改腔室内的样本环境，提供与指导进一步样品分析相关的反馈，以达到预定分析处理的目的。
(j)目标细胞可以通过利用微抽吸子系统进行分离而获得。
qcds可以多次分析相同的样本/细胞悬浮液。其目的是观察不同环境因素对悬浮细胞的影响。这些因素包括：
(a)在初始细胞悬浮之前，将试剂嵌入基质/凝胶中。
(b)在放置在系统腔室中时，或在从腔室中取出后并重新插入之前，通过灌注介质为悬浮液中的细胞提供试剂。
(c)此类试剂可包括物质，该物质包括治疗药剂，用于治疗体液(血液、脑脊液或其它)来源的患者。例如，在癌症患者的案例中，药剂可能包括用于免疫治疗、化疗等的物质。
(d)针对细胞悬浮液的辐射。选择适当的辐射类型，包括电离辐射和剂量，可用于模拟全身病人治疗。
(e)重复的、定量的观察用于表征目标细胞(例如ctc)的标记物。在体外治疗的连续阶段后收集的信息，可以证明有助于推断全身、患者治疗的疗效，并可能导致微调治疗方案。
(f)对于ctc，评估悬浮液中的细胞的治疗效果可能会有额外的好处。鉴于癌症的克隆性，通过上述方法，有可能观察到所识别的癌细胞对体外“治疗”的不同响应。这可能被认为是通过抗体或rna染色，而观察到的蛋白质表达水平的变化。
(g)该系统的能力(1)允许在细胞悬浮液中重复观察所识别的癌细胞，以及(2)可以证明，定量地评估ctc标记物是调节癌症治疗方案的非常有效的工具。
处理细胞制剂的工艺和功能
对于给定类型的样本，在细胞悬浮在安装凝胶中之前，细胞可以被标记为所选择的生物标记物的结合。在仪器中可视化后，识别单个细胞并记录其相对于基准荧光微球系列的位置。
对于某些样本，在分析第一组生物标记物之后并且当样本悬浮在细胞腔室中时，可能需要使用一组后续的生物标记物。为了这一目的，液体处理系统可以为腔室提供一系列选定的介质，包括，例如：
(a)去染色溶液，以将第一系列生物标志物信号去激活，
(b)洗涤溶液，
(c)对所选择的靶细胞进行成像，以验证先前信号的去除
(d)一系列新的标记的生物标记物，或
(e)另一个清洗周期。
在应用新的一组生物标记物之后，执行另一个成像会话，其中对完整的样本重新成像，或在第一个成像周期中创建的三维图的基础上，识别所选择的细胞。所得到的三维图像再次被分析，以对所应用的生物标记物进行定量表征。
这种染色/去染色循环可以重复多次。
根据细胞制剂的类型，可以考虑以下几种因素，包括：
(a)对于活细胞分析，灌注工艺可包括利用细胞培养基。
(b)温度、ph、电导率、气体浓度和其它参数可以被监测，以确定所观察的细胞的适当环境。
(c)样本的物理形变可通过荧光微球基准标记物成像进行监测。
细胞腔室和介质循环控制
图3、4和5(图3和5中的附图标记10)。示出了一样品腔室，其内部空间的形状，可减少成像时可能干扰样品稳定性的不均匀流体运动和微电流。该腔室与介质存储和循环装置以流体连通，该介质存储和循环装置容纳介质、清洗溶液和治疗药剂的容器，其可在送入样本之前注入介质。气体控制装置允许用户设置适当的介质气体含量(o2、co2等)。同样，温度和消毒控制装置(基于uv或其它)允许用户对腔室内的介质进行加热、冷却和消毒。细胞腔室循环控制装置包括满足样本要求的温度控制装置、防止气体在腔室中释放的除泡器、和介质再循环系统。腔室的环境控制装置和传感器包括珀耳帖(peltier)温度控制装置、气体传感器、ph/电导率传感器和颗粒物负载传感器。
样品支架和载物台
样品制剂和安装程序将细胞悬浮液嵌入具有适当形状的光学透明基质/凝胶中，例如嵌入圆柱体中。安装的凝胶可以是低熔点的琼脂糖、胶原凝胶或其它合适的材料。在活细胞观察的情况下，选择的材料允许三维细胞培养。
凝胶封闭的细胞悬浮液将被安装在样本样品支架上，然后其可以自动定位在光片路径中的样本载物台上。样本支架提供一定程度的刚性，以便在延时采集过程中，能够适应机械约束而不干扰活细胞生长。
样本样品支架与微抽吸子系统是兼容的，该微抽吸子系统可以从外壳中物理性地去除靶细胞。
样本载物台8提供旋转的以及x、y、z移动的圆柱形细胞外壳，以允许多视图成像。
细胞微抽吸系统
本发明可与传统细胞抽吸系统结合使用。图6示出了微抽吸系统，该微抽吸系统可用于在样品腔室中操作样本中的细胞。通过插入以微操作器驱使而进入凝胶中的微量移液器(微量注射器)20，，可以从样本中去除目标细胞15。微操作器由电动载物台控制，该电动载物台包括用于去除靶细胞的微抽吸子系统15。微操作系统允许一个或多个微量移液器20被引导穿过腔室10的壁，并进入包含细胞14的生物样本/样品13的特定区域。计算机和成像系统通过基于三维图的引导驱动微操作器。微量移液器可以是丝状的，这有助于用介质填充腔室，并且允许微量移液器作为光导管，以针对性的方式照明特定的细胞。除了允许对靶细胞进行微抽吸外，所述系统还可以使用亚微米的微量移液器，该亚微米的微量移液器有助于将物质微量注射到靶细胞中。
虽然这里已经描述和说明了各种发明实施例，但是本领域的普通技术人员将容易地设想，多种其它的设备和/或结构，用于本处描述的执行功能和/或获得结果和/或一个或多个优点，并且这些变化和/或修改中的每一个被认为在本文描述的本发明实施例的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，这里描述的所有参数、尺寸、材料和配置都是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料，和/或配置将取决于使用本发明教导的一个或多个特定应用。本领域技术人员将认识到，或使用不超过常规的实验手段而能够确定与本文描述的具体的发明实施例的许多等效物。因此，应当理解，上述实施例仅以示例的方式呈现，并且，在所附权利要求及其等效物的范围内，可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施发明实施例。本发明的发明实施例针对在此描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法。此外，如果这样的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法不是相互不一致的，则将两个或多个这样的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法的任何组合包括在本发明的发明范围内。
此外，各种发明概念可以被体现为一种或多种方法，其中的实施例已经提供了。作为该方法一部分执行的行为，可以以任何适当的方式进行排序。因此，可以构造实施例，其中以不同于图示的顺序执行行为，其中可以包括同时执行一些行为，即使在示出的实施例中示为顺序行为。
此处定义和使用的所有定义，应理解为控制字典定义、通过引用合并到文件中的定义、和/或定义术语的一般含义。
在说明书和权利要求书中，使用的不定冠词“一个(a)”和“一个(an)”，除非明确表示相反，否则应理解为“至少一个”。
如在说明书和权利要求中所使用的短语“和/或”，应理解为“其中之一或两者均”的元素的结合，即在某些情况下联合出现，而在另些情况下择一出现。用“和/或”列出的多个元素应以相同的方式解释，即“一个或多个”这样连接的元素。除“和/或”条款特别标识的元素外，可以可选地存在其它元素，无论这些元素是否与特别地标识的元素相关。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包括”之类的开放式语言结合使用时，对“a和/或b”的引用，在一个实施例中，可以仅指a(可选地包括除b以外的元素)；在另一个实施例中，仅指b(可选地包括除a以外的元素)；在另一个实施例中，指a和b(可选地包括其它元素)；等。
如本文在说明书和权利要求中所使用，“或”应理解为与上述所定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当在列表中分隔项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即，包含至少一个，但也包括多个元素或元素列表中的多于一个元素，以及可选地，附加的未列出项目。只有明确表示相反的术语，例如“只有一个(onlyoneof)”或“正好一个(exactlyoneof)”，或者在权利要求中使用时，“由…组成(consistingof)”指的是在多个元素或元素列表中正好包含一个元素。一般地，本文中使用的术语“或”只能解释为表示排他性的选择(即“一个或另一个，而不是两者均”)，当用于权利要求中，在前面加上排他性的术语，如“其中之一(either)”“其中一个(oneof)”“只有一个”或“正好一个”“基本上由...组成”，应具有在专利法领域的一般含义。
如本文在说明书和权利要求中所使用的，提及一个或多个元素的列表的短语“至少一个”，应理解为从元素列表中的任何一个或多个元素中选择至少一个元素，但非必须地包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中的任何元素组合。该定义还允许元素可以可选地存在，而不是短语“至少一个”所指的元素列表中明确标识的元素，无论这些元素是否与明确标识的元素相关。因此，作为非限制性示例，“a和b中的至少一个”(或等效地，“a或b中的至少一个”，或等效地“a和/或b中的至少一个”)可以在一个实施例中指至少一个，可选地包括多于一个，a，而不存在b(和可选地包括除b以外的元素)；在另一个实施例中，指至少一个，可选地包括多于一个，b，而不存在a(和可选地包括除a以外的元素)；在又一实施例中，指至少一个，可选地包括多于一个，a，及至少一个，可选地包括多于一个，b(和可选地包括其它元素)；等。
在权利要求中，以及上述说明书中，所有过渡性的短语，例如“包括(comprising)”、“包括(including)”、“载有(carrying)”、“具有(having)”、“包含(containing)”、“涉及(involving)”、“持有(holding)”、“组成(composedof)”等等都应被理解为开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节的规定，只有过渡性的短语“由…组成”和“基本上由…组成”应分别为封闭或半封闭的过渡性的短语。
等价物
在说明书中，单数形式也包括复数形式，除非上下文另有明确规定。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语，与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。如有冲突，则以本说明书为准。
通过引用并入
每一专利文件的全部披露内容，包括补正证书、专利申请文件、科学文献、政府报告、网站和本文提及的其它参考文献，出于所有目的通过引用其整体并入本文。如果术语有冲突，则以本说明书为准。
示例
下面的示例进一步地描述并示出了本发明范围内的实施例。这些示例仅仅是出于说明的目的而给出，并且不应被解释为对本发明的限制，因为在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本发明的许多变体是可能的。
利用落射荧光显微镜和spim显微镜检测悬浮液中的癌细胞。
本发明的系统和方法的实用性已通过样品成像得以证明，该样品是将培养的肿瘤细胞掺入外周血单个核细胞的背景中而制备的。
方法：
肿瘤细胞系按照标准方案培养。乳腺癌细胞系htb-30在37℃、5％的co2下，在补充有10％的fbs的mccoy'ssa培养基中培养培养。血液是通过自愿采集而获得的。
为了进行免疫染色，血液样品中掺入(spikedwith)了已知数量的培养的肿瘤细胞，该血液样品首先用基于氯化铵的细胞裂解液处理，以去除红细胞。所得到的白细胞(wbc)组分中掺入了培养的癌细胞，用于双光子落射荧光显微镜检查。为了进行spim分析，使用了癌细胞的纯悬浮液。然后将有核细胞沉淀重悬于pbs中，并转移到微量离心管中。然后将细胞以200g沉淀30秒，并轻轻地重悬于封闭缓冲液中。然后在封闭缓冲液中加入所需的荧光标记抗体的组合，并将细胞在冰上孵育30分钟。
将细胞复染，用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗，并在4℃下保存直至需要。
(i)癌细胞的双光子成像
在免疫染色以及用荧光染料标记的着丝粒寡核苷酸探针混合物杂化后，对掺入有核血细胞制剂中培养的肿瘤细胞进行落射荧光、双光子显微镜检查。if和fish同时进行染色，可导致dna或rna的fish染色用于基因组或转录组分析。
基于阳性的抗细胞角蛋白ab信号和观察到的染色体非整倍性(两者均用作肿瘤生物标记物)，在wbc背景下对癌细胞进行识别。
这些结果表明，双光子激光照明可以定量测量来自免疫荧光标记物，或来自dna或rna荧光原位杂交的多种信号。
双光子显微镜的独特的优点是，由于非特异性荧光，它能显著降低背景。
(ii)癌细胞的spim成像
通过0.8％的低熔点琼脂糖包埋制备抗体标记样本，用于使用spim的分析。标记细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中，并且在pbs中与等量的1.6％的低熔点的琼脂糖混合。在与抗体染色细胞混合前，制备1.6％的琼脂糖溶液并将其置于37℃。所述琼脂糖细胞悬浮液被吸入1mm的氟化乙烯丙烯(fep)管中，其具有所需长度并连接在1ml的注射器上，并允许完全固化。成像前，样品在4℃下保存。对于成像，含有标记细胞的琼脂糖柱以原样或是从fep管中轻轻挤出琼脂糖柱后进行可视化。
将培养的肿瘤细胞悬浮液的多个场，沿超过130μm的制剂深度在三维堆叠中成像。使用10x水浸式物镜以1μm步长采集图像。
对每个单独的信号，使用单激光线进行图像采集。合并各个图像堆叠，以进行可视化和图像分析。
以1μm的z路径采集了横跨133个平面的图像堆叠。该样本体积仅包含30个单个细胞，而场中央的癌细胞簇包含22个细胞。每个细胞的直径约为25μm，成像样本的体积为133×463×463μm或约为28.5×106μm3。利用适当的包装，在这个体积中可以容纳估计多达1,500个细胞数量，以促进成功的图像分析。
在肿瘤细胞的spim检测实验中，琼脂糖柱的尺寸为2.35mm×12mm，总体积为52×109μm3。
据估计，1000万个或更多的有核细胞可以以适合成像的密度容纳在适当地优化的凝胶制剂中。
这可以导致通过本发明的系统，在一次扫描会话中处理的总血液量为15ml。
系统的仪器设计
选择性平面照明显微镜是由例如zeiss和leica等商业显微镜制造商提供的，并且也已经成为世界上多个实验室中流行的基于学术的设计对象。本发明的系统是作为对商业系统的改进而设计的。还利用基于openspim概念的定制的spim仪器，测试了本发明系统的操作特性。参见http://openspim.org/welcome_to_the_openspim_wiki。本发明的一个重要设计元素是需要将固定在凝胶中的细胞可视化，在凝胶中的细胞可以保持固定或存活以进行离体观察。将细胞固定在凝胶中的优点是，当用不同的基质灌注目标细胞时，它们可以被反复地观察到。
核心硬件组件可从市场上购买，并且可以从不同的供应商获得。下面是用于组装本发明系统的组件的列表。
组件列表
-照明组件，包括固态激光器、激光路径调制光学器件，包括反射镜、狭缝调制器、聚焦透镜和照明透镜。
-探测光学组件包括观察透镜、荧光发射滤光器、光路和摄像机光路组件。样本处理载物台，该样本处理载物台提供细胞制剂的x、y、z和旋转的运动。
-数码的ccd或cmos摄像机。
另一个开源的概念是spim流体，其允许在液体通过管道泵送时，在液体悬浮液中的细胞可视化。参见https://doi.org/10.1364/boe.6.004447。这种方法不允许在纵向会话中或重复地将靶细胞可视化。
用于扫描癌症循环肿瘤细胞制剂的实验过程。
步骤1：在fpe管内用琼脂糖等凝胶固定细胞，并安装在注射器上，如图3所示。
步骤2：将琼脂糖制剂与含有针对ctc特异性生物标记物的荧光标记抗体(例如靶向上皮细胞膜受体的抗epcam抗体)的溶液一起灌注。
步骤3：在4℃下孵育1小时，然后进行洗涤步骤。
步骤4.将琼脂糖制剂与用于活细胞的核复染剂一起灌注。
步骤5.孵育10min，然后进行洗涤步骤。
步骤6：在将注射器插入载物台支架之前，从fpe管中挤出琼脂糖柱。
步骤7：将注射器装载到载物台上后，利用腔室摄像机将样本对准光路。
步骤8：为样本收集所有荧光通道的图像堆叠。
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