检测急性博尔纳病病毒(BDV)感染的方法及其诊断试剂盒，特别是组合区分急性及慢性和潜伏性BDV感染的方法及其诊断试剂盒与流程

发明领域第一方面，本发明涉及一种用于检测急性博尔纳病病毒(bornadiseasevirus，bdv)感染的方法。根据本发明，这包括通过夹心elisa确定样品中由p24bdv磷蛋白和p40bdv核蛋白组成的异二聚体的存在。这种确定包括使用针对p24bdv磷蛋白和针对p40bdv核蛋白的特异性一抗。第二方面，本发明提供了用于检测急性bdv感染的夹心elisa的诊断试剂盒。所述诊断试剂盒包含第一一抗和第二一抗，其中这些一抗之一针对p24bdv磷蛋白，而另一个一抗针对p40bdv核蛋白，以及包含用报道分子标记的至少一个二抗，将一抗固定在表面上的手段以及实施本发明方法的说明书。第三方面，本发明涉及区分急性bdv感染与慢性和潜伏性感染，通过首先将本发明的方法和由此提供的诊断试剂盒与检测bdv感染的方法组合，其中由bdv抗原和与其附着的特异性抗体组成的游离循环免疫复合物(cic)通过免疫学测定进行检测，例如de19758017c2所述，其次另外使用检测bdv感染的方法，其中感染的宿主中游离循环bdv抗体通过免疫学测定进行检测。因此，根据本发明的诊断试剂盒包括用于检测bdvcic的手段和用于检测bdv抗体的合适的诊断试剂盒。最后，本发明提供了根据本发明的方法在诊断急性bdv感染和/或病程监测中的应用。特别是与检测bdvcic和bdv抗体的方法组合，根据本发明的方法可用于区分急性bdv感染与慢性和潜伏感染和/或病程监测以及排除bdv感染。其同样适用于人和动物。感染的状态和感染的过程直接影响对临床患病个体进行抗病毒治疗的可能性。
背景技术：
：博尔纳病病毒(bdv)在分类学上是“博纳病毒科”(bornaviridae)病毒中物种“哺乳动物1博尔纳病毒种”(mammalian1bornavirus)的引导病毒，属于“单股反链病毒目”(mononegavirales)。其病毒株从遗传学角度具有95％以上相同度，在人和许多哺乳动物中感染脑和血细胞并在世界范围内广泛传播。就马而言，其是博尔纳病的病原体。博尔纳病毒是包膜病毒(直径90nm)，含8910千碱基的负义非节段化单链(nss)rna，其编码6个基因。博尔纳病毒在宿主细胞的核中繁殖，是进化上最古老的病毒之一，其与灵长类祖先共存了至少4000万年，就其遗传物质而言甚至在人类身上也留下了永久痕迹。如今，bdv感染发生在许多农场和家畜(包括马，绵羊，牛，猫)和人类中。其终生保留在被感染的生物体中(持续感染而无细胞破坏)，优先影响就进化而言更老的大脑部分(边缘系统)并参与行为和情绪变化。据推测德国三分之一的成年人感染了未被注意的博尔纳病毒，即没有临床症状(bodeandludwig,2003)。对于每六分之一的感染个体(16-17％)，一生中遭受精神障碍的风险增加。基于总人口，每二十分之一的人(每100人中有5人；5％)患病的风险增加。猜测最重要的危险因素是长期压力，其会长期削弱免疫系统并有利于潜伏的博尔纳病毒的激活。博尔纳病毒优先影响大脑边缘系统的神经细胞。这些大脑中枢区域控制行为和情绪并参与学习过程和记忆形成。这种病毒主要在神经细胞中繁殖并可以通过其过程而扩散到整个神经系统。这涉及病毒蛋白n(p40核蛋白)和p(p24磷蛋白)(抗原)的过量形成。在有症状患者的大脑中(例如在抑郁症的情况下)，其会导致大脑信使物质平衡失调(经动物实验证实)。在动物中，bdv感染与情景行为障碍有关，包括冷漠、注意力丧失和运动协调障碍。在人类中，发现急性或慢性博尔纳病毒感染在急性抑郁发作、强迫症和慢性疲劳综合症中与例如健康人相比更频繁发生。因此，多年来一直猜测博尔纳病毒参与了非常复杂的疾病过程，但这仍然被认为是有争议的(bodeandludwig,2003)。金刚烷胺的抗病毒治疗已被证实与此有关。内因性复发性抑郁症(单相或双相)，在德国和世界范围内的主要精神疾病中，一生患病率至少为5％。因此，需要一种可靠的诊断系统以捕获bdv感染，既可以用于监测患病个体的感染阶段，也可以用于病程和治疗监测，以及基于流行病学原因在人群基础上捕获未被发现感染的无症状携带者，或在个人基础上确定个人患病风险。为了评估感染阶段(急性，慢性，潜伏期)，已发现血液中bdv抗原(n和p)的表达增加是关键的活动参数。其与(人和动物)临床疾病具有很好的相关性，可定量测量且对于估计临床过程很重要。抗原的确定不能代之以通过巢式rt-pcr或实时rt-pcr扩增检测pbmc中的病毒核酸，因为这只能确定病毒本身，而不能确定其活性。如今，在许多地方都通过检测病毒基因组来诊断博尔纳病毒感染，或者在血清学上限于通过各种血清学方法检测抗体。但是，单独阴性检测特异性抗体并不是排除bdv感染的合适方法，因为游离抗体在抗原释放繁殖阶段以被感染个体血清中循环免疫复合物(cic)的形式结合并可以暂时降至检测极限以下。近年来，已经进行了基于elisa技术的诊断方法，其中测量了bdv特异性免疫复合物(cic)以及病毒蛋白和可能的游离循环抗体(bodeetal.,2001)。在这种情况中使用特异性单克隆抗体。自1994年对两个bdv病毒株的前两个完整基因组进行测序以来，bdv核蛋白p40和磷蛋白p24的氨基酸序列已为人所知(brieseetal.,1994；cubittetal.,1994)。对于核蛋白，可以创建三维结构的带状模型(rudolphetal.,2003)。bdvelisa测定的关键试剂，单克隆抗体w1(抗n)和kfu2(抗p)，以其基本特性鉴定(ludwigetal.,1993)。bdvcic是可最常检测的感染标志物，迄今为止已被发现对于相应的诊断测定是最佳的。基于此，de19758017c2涉及检测bdv感染的相应方法，其中通过免疫测定法检测由bdv抗原和与其附着的特异性抗体组成的游离循环免疫复合物。如起始所述，这个产权还涉及相应的诊断试剂盒。在de19860255c2中找到其扩展，涉及检测bdv感染的方法，其中抗原检测是在血浆样品、脑脊髓液或尿液中进行。使用针对bdvcic的相应血液检测。免疫复合物(cic)仅在病毒繁殖阶段才可检测到，使用cic非常适合在阳性病例中指示慢性感染。其它早期抗原测定表明在阳性病例的发作。阴性cic测定需要额外的抗体elisa以检测潜伏感染或排除感染。当前诊断系统和方法基于cic检测，其中基于夹心elisa，使用来自第一物种的单克隆抗体结合cic中的抗原部分，然后使用另一物种的酶标记二级抗抗体和相应于样品中cic相对量的底物反应(颜色变化)检测结合的cic的抗体部分。已证实cicelisa是检测慢性bdv感染的有效基础测定。对于急性bdv感染检测(这在临床上对个体而言尤其重要)，单独进行这个测定是不合适的。迄今为止，抗原测定受制于高样品量和有限资源，因此从长远来看不能用作诊断试剂盒。本发明通过提供一种用于急性bdv感染的全新测定法来弥合这一差距。由于组合了cic测定和抗体测定，这种新方法能区分急性、慢性和潜伏感染，从而将bdv诊断提高至高质量标准的迄今未达到的信息价值水平。本发明提供了一种急性bdv感染的全新测定方法。现在已经可以鉴别在de19758017c2的方法中使用的单克隆抗体“w1”和“kfu2”的特异性结合谱，所述抗体分别识别bdvn蛋白和p蛋白上的有效构象表位(bode,2008)。本发明着重于对p蛋白、特别是异二聚体n/p的活性磷酸化形式的识别。因此，并未描述的单克隆抗体特别适合于所述新测定法和与之组合的测定法。发明描述本发明的一个目的是提供一种基于elisa技术、尤其是夹心elisa技术的检测急性bdv感染的方法和相应的诊断试剂盒。另一个目的是提供用于鉴别诊断的改进方法。第一方面，本发明涉及检测急性博尔纳病病毒(bdv)感染的方法，包括如下步骤：通过夹心elisa确定样品中由p24bdv磷蛋白(seq.idno.2)和p40bdv核蛋白(seq.idno.1)组成的异二聚体的存在，第一一抗以固定状态存在，第二一抗在将样品与固定的第一抗体温育后以非固定状态加入，特征在于第一一抗针对p24bdv磷蛋白且第二一抗针对p40bdv核蛋白，或反之。明显的是可以检测急性、当前活动性的感染，特别是在其中第一一抗仅识别磷酸化p蛋白的实施方案中(bode，2008)。磷酸化形式基本上仅在感染的活动性状态下可检测。第二方面，本发明涉及检测急性bdv感染的夹心elisa的诊断试剂盒。所述诊断试剂盒包含第一一抗和第二一抗，所述一抗之一针对p24bdv磷蛋白而另一一抗针对p40bdv核蛋白，所述一抗针对优选以固定状态存在的p24bdv磷蛋白。所述试剂盒进一步包含至少一种用报道分子标记的二抗，任选包含将一抗固定在表面上的手段，特别是固定针对p24bdv磷蛋白的一抗的手段，以及实施本发明方法的说明书。第三方面，本发明涉及区分急性bdv感染与慢性和潜伏感染。为了区分慢性感染，本发明进一步组合例如de19758017c2中所述检测bdv感染的方法，其中通过免疫学测定检测由bdv抗原和与其附着的特异性抗体组成的游离循环免疫复合物(cic)。为了区分潜伏感染，将本发明的方法与检测bdv感染的方法(其中通过免疫测定法检测感染的宿主中针对p24蛋白和/或p40蛋白的游离循环bdv抗体)组合。发明详述本发明涉及一种用于检测急性博尔纳病病毒(bdv)感染的方法，包括如下步骤：通过夹心elisa确定样品中由p24bdv磷蛋白和p40bdv核蛋白组成的异二聚体的存在，第一一抗以固定状态存在，第二一抗在将样品与固定的第一抗体温育后以非固定状态加入，特征在于第一一抗针对p24bdv磷蛋白且第二一抗针对p40bdv核蛋白，或反之。明显是通过使用两个指定的一抗，即首先针对p24bdv磷蛋白的抗体和其次针对p40bdv核蛋白的一抗，可以检测由所述两种蛋白形成的异二聚体。这种异二聚体、特别是其中p24以磷酸化形式存在的异二聚体特别存在于急性期。结果，可以明确地检测急性bdv感染。已经证实cicelisa是检测慢性bdv感染的有效基础方法。对于急性bdv感染检测(这在临床上对于个体而言尤其重要)，单独进行此测定是不合适的。迄今为止，抗原测定受制于高样品量和有限的资源，因此从长远来看不能用作诊断试剂盒。本发明通过提供一种用于急性bdv感染的全新测定法来弥合这一差距。由于组合了cic测定和抗体测定，这种新方法能区分急性、慢性和潜伏性感染，从而将bdv诊断提高至迄今未达到的具有高质量标准的有信息价值的水平。本发明提供了一种急性bdv感染的全新测定方法，因为尤其可以解码在de19758017c2方法中使用的单克隆抗体“w1”和“kfu2”的结合谱，所述单克隆抗体特别定义了新方法的高特异性。形成各个构象表位的结合位点的氨基酸序列在此首次命名(p40的序列为seq.id.no3-7，p24的序列为seq.id.no.8-10)。其是上述单克隆抗体性质的基本分子组成。一抗的特异性要求是其优选是单克隆的且识别与bdv核蛋白上的bdv磷蛋白结合结构域不重叠的构象表位，从而可以识别异二聚体。此外，针对磷蛋白的抗体的要求优选使得所述表位包括主要磷酸化位点(schwemmleetal.,1997)且仅包括被识别的蛋白的活性磷酸化形式。因此，在一个实施方案中，第一一抗针对磷酸化的p24bdv磷蛋白。在所述实施方案中，根据本发明检测的仅是由p24bdv磷蛋白和p40bdv核蛋白组成的p24磷酸化异二聚体。形成活性增加至一定程度的bdv抗原p24和p40并排入机体血浆中。然后，这些p24和p40蛋白优选在血液中形成由p24和p40组成的异二聚体，该异二聚体中的p24蛋白在活动性病毒增殖及分泌进入血浆中之后以磷酸化状态存在。在病毒p蛋白形成后，磷酸化是宿主细胞中的活动性进程。急性、当前活动性的bdv感染的检测是尤为可能的，因为异二聚体、在此特别是含有磷酸化的bdvp24磷蛋白的异二聚体使用根据本发明的方法检测。在一个实施方案中，所述针对磷酸化形式的抗体是单克隆抗体，例如小鼠来源的单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体是已经固定在表面上的第一一抗。急性、当前活动性的bdv感染的检测被确保，因为结合磷酸化形式的单克隆抗体例如最初使用的mab“kfu2”(见ludwigetal.,1993)识别由活动性磷酸化bdvp蛋白上三个结合位点(seq.idnos.8,9和10)形成的构象表位。第二初级单克隆抗体，例如原先使用的mab“w1”(见ludwigetal.,1993)识别由bdvn蛋白上五个结合位点(seq.idnos.3,4,5,6和7)形成的构象表位。这两种蛋白质上的这些结合位点与n蛋白上的p蛋白结合结构域(bergetal.,1998)不重叠。因此可以识别n/p异二聚体(bode，2008)。在一个实施方案中，直接将第一一抗固定在表面上，在另一个实施方案中，通过第一二抗实现固定，所述第一二抗例如以物种特异性方式、特别是亚类特异性方式结合一抗，而不损害所述一抗结合由p24bdv磷蛋白和p40bdv核蛋白、特别是p24磷酸化bdv磷蛋白组成的异二聚体的活性。根据常规方法将一抗或第一二抗固定在表面上。本领域技术人员已知适当的方法。通常通过二抗或一抗的fc区实现固定。目前描述的检测血清/血浆中感染的方法主要基于外周血单个核细胞(pbmc)的感染，以这种方式病毒开始繁殖导致n和p蛋白(抗原)从pbmc(以及机体内尚未知的来源)分泌进入血浆(急性感染)，随后在宿主体内形成抗体且所述抗体与抗原结合形成循环免疫复合物(cic)，这表明是慢性感染。本文中术语“检测”是指可以对异二聚体的首先定性检测及对浓度定量确定二者。在根据本发明方法的另一个实施方案中，未固定的第二一抗通过包含报道分子的第二二抗确定。本文中术语“报道分子”被理解为是指首先允许直接测量的分子，例如也称为标记或标签。其次，所述报道分子可以具有第一结合参数，其因此与进一步标记的分子(第二结合配偶体)作为结合对而被检测。最后，所述报道分子可以包含催化剂，例如酶。合适的报道分子的实例包括已知的报道分子，例如染料，包括荧光染料，放射性分子。或者，所述报道分子可以是已知的结合对，例如生物素-链霉抗生物素蛋白或者生物素-抗生物素蛋白对。最后，所述报道分子可以是催化剂，尤其是酶。已知的酶包括碱性磷酸酶、过氧化物酶，尤其是辣根过氧化物酶，以及其它常规酶类。本领域技术人员已知适当的报道分子，如特别在基于免疫的检测方法、特别是在elisa方法中使用的报道分子。在一个实施方案中，所述第二二抗是包含生物素作为报道分子的抗体。然后借助于合适的结合配偶体如与酶如碱性磷酸酶(ap)或辣根过氧化物酶(hrp)偶联的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白检测所述抗体。或者，可以用酶如ap或hrp直接标记所述第二二抗。在一个实施方案中，所述两个二抗来自相同物种，在另一实施方案中，所述两个二抗源自不同物种。在一个实施方案中，所述两个二抗是源自相同物种或不同物种的抗体，识别一抗物种的不同免疫球蛋白亚类。在本发明的一个实施方案中，一抗可以是这样的抗体，其中第一一抗和第二一抗源自不同物种和/或其中所述一抗是单克隆抗体。在其一个实施方案中，一抗源自相同物种，但源自不同的免疫球蛋白类别或不同的免疫球蛋白亚类。在一个实施方案中，一抗源自小鼠且是单克隆抗体，例如其中一抗之一是igg1亚类之一而第二一抗是小鼠igg2亚类的抗体。如果一抗源自不同的亚类，例如igg1和igg2，则二抗优选为特异性检测所述亚类即与所述亚类结合的抗体。因此，可以使交叉反应性最小化。一抗可任选被修饰，使其包含其它组分或为单链抗体。一抗的特征在于其特异性识别bdv的相应蛋白且在必要时包含二抗所需的结合位点。如果一抗直接与表面偶联，则不需要存在所述二抗的结合位点。在直接偶联的情况下，可以修饰一抗，从而有利于与表面的结合。本领域技术人员已知通过适当的分子生物学方法修饰一抗的合适措施。在这个过程中，维持了一抗和任选地维持了二抗的特异性，同时去除了可能引起交叉反应性的组分。这些修饰支持特异性的改善。除非另有说明，否则本文所用的术语“抗体”涵盖单克隆抗体、多克隆抗体和嵌合抗体。抗体可以从重组来源和/或杂交瘤细胞产生。或者，可以使用转基因动物等。如果抗体保留对p24bdv磷蛋白和p40bdv核蛋白的特异性，则其也可以抗体片段的形式存在。如本文所用，术语“抗体片段”涵盖合适的scfv、dsfv、ds-scfv、二聚体、微型抗体、双抗体，还包括fab、fab-或f(ab’)2片段。这种片段可以通过合适的重组技术产生。在本发明中，优选使用合适的常规技术即杂交瘤技术产生的单克隆抗体。使用这种技术组合小鼠的感染和免疫，可以选择分别识别蛋白n和p天然构象上的表位的抗体。以“w1”和“kfu2”表示的构象表位对于天然bdv蛋白具有较高的结合常数(bode,2008)，这是借助于重组蛋白产生的单克隆抗体对线性表位无法实现的。报道分子，也称为标记物或标记，允许直接或间接产生可检测信号。合适的标记或标记物是众所周知的放射性同位素，但尤其也是染料，例如荧光染料(荧光团)或化学发光化合物(发色团)；其实例是异硫氰酸荧光素(fitc)、若丹明或萤光素。在一个实施方案中，报道分子是酶，尤其是碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶，其以颜色变化作为信号来转化底物。同样涵盖成像手段，例如磁性或顺磁性标记分子或金属离子。在一个实施方案中，报道分子通过结合对的一个结合配偶体与二抗偶联，所述结合对例如链霉抗生物素蛋白-生物素结合对或者生物素-抗生物素蛋白结合对。本领域技术人员已知合适的结合对。在进一步的第三实施方案中，除了检测所述异二聚体外，进一步检测由bdv抗原和与其附着的特异性抗体组成的循环免疫复合物(cic)。例如从de19758017c2中获知适当的检测方法。将根据本发明的异二聚体、特别是磷酸化异二聚体的检测组合循环免疫复合物(cic)及个体中与之结合的特异性抗体的检测，增加了检测bdv感染的特异性，尤其是也能区分急性bdv感染和慢性bdv感染。在另一个实施方案中，除了检测所述异二聚体和cic以外，还进行了如de19758017c2所述的bdv抗体的检测方法。将根据本发明的异源二聚体的检测与cic检测和游离抗体的检测组合可以区分个体中急性、慢性和潜伏性感染；也见图1所示。根据本发明的方法特别是一种可以诊断和/或病程监测和/或用于排除bdv感染的方法，例如在精神和/或神经疾病的情况下。这意味着根据本发明的方法是诊断急性bdv感染的方法。另一方面，所述方法组合cic测定和抗体测定适于进行病程监测，特别是用于区分急性、慢性和潜伏性bdv感染。在上述组合中，同样适用于在精神疾病和/或神经疾病的情况下排除各种活动性状态的bdv感染。另一方面，本发明涉及用于检测急性bdv感染的夹心elisa的诊断试剂盒。所述诊断试剂盒包含第一一抗和第二一抗。这两个一抗之一针对p24bdv磷蛋白，另一个一抗针对p40bdv核蛋白。所述诊断试剂盒进一步包含合适的二抗，但至少一个二抗用报道分子标记。任选地，本发明还提供了将一抗固定在表面上的手段以及使用所述试剂盒进行本发明方法的说明书。在一个实施方案中，试剂盒中存在的一抗和二抗是本文阐述的那些。一抗尤其是这样的抗体，其中所述一抗之一识别p24磷酸化异二聚体的磷酸化蛋白，而另一个一抗识别异二聚体中的p40bdv核蛋白。二抗是如本申请中所定义的那些二抗，尤其是源自相同物种的那些抗体和/或识别一抗的不同亚类的那些抗体。在一个实施方案中，诊断试剂盒还包括检测个体的由bdv抗原和与其附着的特异性抗体形成的cic的手段。所述手段特别是合适的单克隆抗体。最后，本发明提供了根据本发明的方法和诊断试剂盒在精神疾病和/或神经疾病的情况下对于bdv感染的诊断和/或病程监测和/或排除的应用。本发明的方法以及本发明的诊断试剂盒以及所述方法和诊断试剂盒的应用使得可以为检验的个体制定针对bdv感染的治疗计划，作为主治医师的选择。因此，本发明提供了一种治疗急性bdv感染的方法，包括根据本发明检测急性bdv感染的方法，以及在诊断为急性bdv感染的情况中用抗病毒药物硫酸金刚烷胺(as)对其进行治疗。所述药物已被证实对天然博尔纳病毒具有很高的效力。as是一种已被授权用于病毒性流感(甲型流感)的抗病毒治疗超过40年的药物，可以开处方用于治疗博尔纳病毒感染(药品核准标示外使用)。as抑制天然博尔纳病毒的繁殖，从而抑制有害病毒蛋白(抗原)的形成(bodeandludwig,2003)。多数(70％)患有急性和/或慢性抑郁症的受感染患者通过改善症状持久受益(dietrichetal.,2000；fersztetal.,1999)，同时血液中的病毒标志物下降。也有可能表明as在抑郁已经缓解(不再有抑郁症状)的感染患者中的抗病毒作用。根据de19860255c2所述方法，在血浆中使用elisa测定法确定cic、抗原(pag，先前的测定)和抗体进行病程监测，示出这些测定参数在14周后显著降低(dietrichandbode,2008)。在人和马的天然博尔纳病毒的情况下证实as以剂量依赖性方式在体外有效。来自抑郁症双相患者的人病毒分离株hu-h1(bodeetal.,1996)在人少突胶质细胞中的滴度取决于1.2μg/ml至0.4μg/ml的硫酸金刚烷胺浓度在10-33天内不再可被检测到。0.4μg/mlas的浓度与在每天口服200mgas的情况下患者血浆中达到的浓度相关。此外，本发明提供了一种治疗精神和/或神经疾病的方法，包括根据本发明检测bdv感染、尤其是急性bdv感染，以及在检测bdv感染的情况下，尤其是检测急性bdv感染或检测慢性活动性感染的情况下组合cic检测。个体的治疗选择可以是每天每千克体重口服2-4mgas的治疗。对于体重为75kg的患者，每天150mg至不超过300mg的as。在开始时逐渐增加剂量，在前3-4天每千克体重1mg的as。剂量方案：早晨逐渐增加剂量期。此后的剂量方案：从每千克体重2mgas开始，早晨服用每日剂量的一半，另一半在中午服用(1-1-0)。如果在前一至两周内出现动荡或入睡困难，仅在早晨服用每日剂量(1-0-0)。此外，本发明提供了一种治疗bdv感染的方法，其中借助于根据本发明的方法，监测治疗情况作为病程监测的一部分。鉴于此，实施治疗，由此可以在阳性治疗疗程事件(其特征在于平均前4-6周后临床改善，以及特征在于血浆中异二聚体和/或cic降低的病毒活性降低)3个月后结束所述治疗。三个月后，必须对血液抗原(异二聚体)和cic值进行监测。在停止服用药物之前，应不再可检测到异二聚体，以及与治疗前的状态相比cic值降低。药物应在4-7天逐渐减少剂量而撤药。在治疗过程延迟的情况下，特征在于是前4-6周后临床略有改善，及这些异二聚体、尤其是磷酸化异二聚体、任选组合cic的检测仅略有变化或不变，所述治疗应继续持续三个月以及应可以改变治疗方法。作为预防措施，在临床略有改善的情况下，在6周后必须进行借助于本发明的方法组合cic的病程监测，并且在抗原和/或cic值很少或未变化的情况下建议调整治疗剂量。如果剂量先前为每千克体重2mgas，则在上述情况中建议增加至每千克体重3mgas至每千克体重最多4mgas。抑郁性精神疾病患者中bdv感染的常规疗法包括已确立的抗抑郁药处方，例如三环抗抑郁药或血清素再摄取抑制剂(ssris)。as在肾脏中原样排泄，在肝脏中没有降解产物，因此与这些药物的不良相互作用微不足道或者没有不良相互作用。因此，在不停止上述治疗的情况下，可以另外开处方as以控制bdv感染。对于需要透析的肾功能衰竭患者，可能发生as血液水平非所需的增加。因此，在这种患者的情况下，仅建议每第二天或第三天摄入上述剂量，及任选每周监测药物的血液水平。使用的样品可以是分离形式的体液和机体组织。特别合适的样品源于血液，例如血清或血浆的形式。对于神经疾病患者，其它合适的样品是脑脊液，但不能排除在阴性发现情况下的感染，因此血液样品如血清或血浆样品是必须的。在一个实施方案中，所述样品是来自血浆或血清的分离样品。附图描述图1示出急性、慢性和潜伏性bdv感染的诊断方案。在第一个测定中，根据本发明方法测定的是抗原的存在。如果其存在，则为急性感染，而如果检测结果为阴性，则进一步检查以确定是否存在cic。如果存在cic，则假定为慢性感染，对于cic阴性样品，则进行额外检查以确定是否存在抗体。如果也不存在抗体，则排除感染的存在，而在仅检测到抗体(抗p24蛋白和/或抗p40蛋白抗体)的情况下，则假定为潜伏性感染。图2示出根据本发明方法的bdv抗原酶免疫测定(eia)的示意图。在所述测定中，将针对磷酸化p24蛋白的单克隆小鼠抗体kfu2通过与具有抗小鼠igg1亚类特异性的二抗结合而固定在微滴定平板上，然后用于从血浆/血清样品中捕获异二聚体。然后使用针对p40蛋白的单克隆小鼠抗体w1检测这些结合的异二聚体。为使反应可视化，接下来是具有抗小鼠igg2a亚类特异性的二抗，通过其与生物素报道分子的标记以及随后链霉抗生物素蛋白介导的碱性磷酸酶的结合，可以在加入底物对硝基苯基磷酸酯之后产生相应的颜色反应。图3示出bdv免疫复合物eia的示意图，例如在de19758017c2中描述。在那里，将两个单克隆小鼠抗体w1和kfu2通过与具有抗小鼠igg特异性的二抗结合而固定在微滴定平板上，然后用于从血浆/血清样品中捕获抗原-抗体复合物。然后使用针对样品宿主物种igg的酶标二抗(碱性磷酸酶报道分子)和相应的颜色反应(如图2所示)检测所述抗原-抗体复合物(bdvcic)。图4示出根据本发明可使用的bdv抗体eia的示意图。在此，通过与具有抗小鼠igg特异性的二抗结合而将所述单克隆抗体w1和kfu2同样固定在微滴定平板上，然后用作捕获抗体首先结合天然bdv抗原，其预先已经以无病毒形式得自标准化感染的细胞培养物。这些结合的bdv抗原使得可以从血浆/血清样品中检测抗bdv抗体(抗p24或抗p40蛋白抗体)。这是在样品中存在的抗bdv抗体与天然抗原结合后，通过针对样品宿主物种的igg(碱性磷酸酶报道分子)的酶标记的二抗和相应的颜色反应(如图2所示)实现。图5示出来自测试人员的个体样品的抗原测定结果，其中首先使用本发明的方法检测bdv抗原(新pag)，其次使用de19860255c2中描述的之前的抗原检测方法检测bdv抗原(旧pag)。图6示出组合使用本发明的抗原测定法与cic测定和抗体测定法的结果，后两种测定如de19758017c2中所述。吸光度值累计示出。图7示出bdvn蛋白的完整氨基酸序列(seq.id.no.1)。通过表位作图识别的所述单克隆抗体w1的5个结合位点n1-n5(seq.idnos.3-7)，在天然bdvn蛋白上形成构象表位，其中n1、n3和n5在晶体结构比较后是相互作用结合位点(bode,2008)。结合位点以黑色方框示出。虚线方框示出的是定义n蛋白上p蛋白结合位点的两个结构域，氨基酸51-100和131-155(bergetal.,1998)。这些示出与w1结合位点没有重叠。结果，也可以识别n/p异二聚体。图8示出bdvp蛋白的完整氨基酸序列(seq.idno.2)。通过表位作图鉴定的所述单克隆抗体kfu2的三个结合位点p1-p3(seq.id.nos.8-10)，在天然p蛋白上形成构象表位。结合位点以黑色方框示出。p1是主要结合位点，包括bdvp蛋白上的主要磷酸化位点(s26/s28；schwemmleetal.,1997)(以虚线方框示出)。kfu2仅识别活动性磷酸化bdvp蛋白(bode,2008)。本发明借助于实施例得以进一步阐明，但本发明不限于此。实施例提供了示出bdv感染的个体的分离血样，感染状态为急性、慢性或潜伏性感染或不存在感染。重庆研究医务人员表测定结果评估(所有bdveia测定标准)截断值＝0.100；阴性<＝0.1；临界>0.1-0.12；(+)弱阳性>0.12-0.15；1+阳性>0.15-0.32+阳性>0.3-0.6；3+阳性>0.6-1.0；4+阳性>1.0样品来自在中国重庆的一家大学医院进行的一项大型研究，使用cic测定及另外使用抗体测定和实时rt-pcr进行(liuetal.2015)。使用在de19758017c2中使用的抗体w1和kfu2进行测定。在所述测定中，w1是针对p40bdv核蛋白的一抗，kfu2是针对bdv的磷酸化p蛋白p24磷蛋白的一抗。用于cic检测和抗体检测的测定设置遵循图3和图4所示相应方案。根据本发明的抗原检测(异二聚体)方法的测定设置遵循图2所示方案。本发明方法的材料affinipure山羊抗小鼠igg1、fc片段特异性抗体(浓度为1.3mg抗体/ml)，与人、牛和兔血清蛋白的交叉反应最小(编号115-005-205，jacksonimmunoresearch)。生物素-sp缀合的affinipure山羊抗小鼠igg2a、fc片段特异性抗体，与人、牛和兔血清蛋白的交叉反应最小(编号115-065-206，jacksonimmunoresearch)。碱性磷酸酶缀合的链霉抗生物素蛋白(编号016-050-084，jacksonimmunoresearch)。碱性磷酸酶底物试剂盒(编号172-1063，biorad)或者如下各个底物缓冲液和底物(bodeetal.,2001)：底物缓冲液，ph9.8的二乙醇胺缓冲液(二乙醇胺1.007m+mgcl2·6h2o0.5mm+nan30.003m)；底物对硝基苯磷酸酯六水合物(pnpp·6h2o)(0.003m)；5mg片剂(编号n9389sigmaaldrich)；在测定中始终新鲜制备，1mgpnpp/ml底物缓冲液。缀合缓冲液(碱性磷酸酶)tbs-tweenph8.0(tris0.02m+nacl0.14m+kcl0.003m+0.05％tween20)。洗涤缓冲液nacl-tween(0.9％nacl+0.05％tween20+nan30.003m)。样品稀释缓冲液(也用于图2中步骤2、4和5)，pbs-tweenph7.2(kh2po40.0015m+na2hpo4·12h2o0.008m+nacl0.14m+kcl0.003m+0.05％tween20+nan30.003m)。包被缓冲液，0.01m磷酸钠/0.25mnaclph7.6(nah2po4·2h2o0.02m[原液a]，na2hpo40.02m[原液b]；包被缓冲液含有于1000ml重蒸馏水中的65ml原液a+435ml原液b+0.25mnacl)。终止溶液，3mnaoh所有化学物质均具有美国化学学会(acs等级)、优选sigmaaldrich指定的纯度。用于elisa的nunc-immuno96孔微滴定平板，maxisorp，f(平底)(编号442404，nunc)。bdv-特异性关键试剂特异性针对bdv核蛋白(n蛋白)的w1(小鼠亚类igg2a)；特异性针对bdv磷蛋白(p蛋白)的kfu2(小鼠亚类igg1)；w1和kfu2是单克隆小鼠抗体，首先由ludwigetal.,1993描述。本发明人具有这两种抗体的杂交瘤上清液，其已经产生且适于工业规模的测定试剂盒生产。本发明人还具有杂交瘤细胞，其允许无限批次产生单克隆抗体w1和kfu2。w1和kfu2的进一步表征(bode,2008)简述kfu2物种小鼠亚克隆57-4-33igg亚类igg1特异性bdv的p蛋白p24(参考毒株v)解离常数(kd)3.33x10-9+-0.34x10-9m(天然p蛋白)表位类型构象表位(不连续)杂交瘤上清(＝即用型)在bdvelisa中1:500使用稀释度识别重组(r)p蛋白，非磷酸化的否(使用先前elisa抗原测定)识别rp，体外磷酸化的是(使用先前elisa抗原测定)w1和kfu2表位序列的首次描述bdv的n蛋白p40上的表位seqidno.w1表位类型构象表位(不连续)结合位点数目在每种情况中5mer肽上有5个(n1-n5)n13氨基酸序列32_kflqy_36n24氨基酸序列116_akfyg_120n35氨基酸序列168_tmmaa_172n46氨基酸序列294_laprs_298n57氨基酸序列307_fywsk_311也见图7所示。也见图8所示。本发明方法的方案用包被缓冲液稀释的山羊抗小鼠igg1二抗的1:1000稀释液各取100μl移液至maxisorpf微滴定平板中，在37℃温育1小时。此后，用洗涤缓冲液(共120ml)进行三个洗涤循环。然后，将在pbs-tween中以1:500稀释的单克隆抗体kfu2(杂交瘤上清液)以每孔100μl在37℃温育1小时，然后用洗涤缓冲液进行三个洗涤循环。将样品(用pbs-tween以1:10稀释)以100μl/孔移液到微滴定平板中，在37℃温育1小时，然后用洗涤缓冲液进行三个洗涤循环。此后，以100μl/孔加入在pbs-tween中1:500稀释的作为杂交瘤上清液的单克隆抗体w1，在37℃温育1小时，然后进行三个洗涤循环。此后，以100μl/孔的量加入在pbs-tween中1:1000稀释的生物素标记的山羊抗小鼠igg2a二抗，在37℃温育1小时，随后进行三个洗涤循环。然后，以100μl/孔的量加入在缀合缓冲液tbs-tweenph8.0中以1:1000稀释的碱性磷酸酶标记的链霉抗生物素蛋白，在37℃温育30分钟。随后再用洗涤缓冲液进行三个洗涤循环。此后，在底物缓冲液ph9.8中用对硝基苯基磷酸酯(1mg/ml)p-npp进行检测反应。加入100μl相应的p-npp溶液，然后在室温温育2-5分钟。注意：需要进行连续目测监控，阴性对照必须保持无色，而阳性对照颜色改变。通过每孔加入50μl终止溶液(3mnaoh)终止颜色反应。使用合适的多通道光度计在405nm立即确定吸光度。对未转换的底物进行“空白”测量。根据de19758017c2中描述的方法进行cic测定根据de19758017c2中所述的方法进行样品中的cic测定(参见图3中的方案)。为在实践中优化用于cic测定的诊断测定，除目测步骤之外将所有步骤的温育时间和温度简化为在37℃进行1小时，所述步骤即底物温育(c3)、加入终止溶液(c4)和测量(c5)。关于颜色反应显色的检测，程序与上文本发明所述相同。验证阳性和阴性对照的单一测定中待测样品的1:20初始稀释度，提供与进一步稀释相同的可靠性。在材料的描述中，加上如下编号：affinipure山羊抗小鼠igg，fc片段特异性抗体(编号115-005-071；jacksonimmunoresearch)。用于人样品的碱性磷酸酶缀合的affinipure山羊抗人igg，fc片段特异性抗体，与牛、马和鼠血清蛋白的交叉反应最小(编号109-055-098；jacksonimmunoresearch)。用于马样品的碱性磷酸酶缀合的affinipure山羊抗马igg，fc片段特异性抗体(编号108-055-008；jacksonimmunoresearch)。如上所述，关键试剂w1和kfu2、底物试剂盒或底物缓冲液和底物片剂、缓冲液和nuncmaxisorpfelisa平板用于新发明。根据de19758017c2中描述的方法在血浆/血清中进行抗体测定原则上，根据de19758017c2中描述的方法进行血浆/血清样品中针对p24蛋白和/或p40蛋白的抗体的测定(参见图4中方案)。与cic测定相似，除目测步骤外，将所有步骤的温育时间和温度简化为在37℃进行1小时，以优化诊断试剂盒在实践中确定抗体。此外，代替所述以1:50初始稀释样品，将稀释度调整为1:100。明显的是，验证阳性和阴性对照的单一测定中待测样品的1:100初始稀释度，提供与进一步稀释相同的可靠性。为了进行de19758017c2中描述的bdv抗体eia，需要检测来自bdv感染的细胞的抗原。根据批次，来自被感染细胞培养物的检测抗原的使用稀释度为1:100至1:300。持续用bdv毒株v(brieseetal.,1994)感染的人少突胶质细胞系(oligo/tl)可以无限产生检测抗原，其于1997年12月12日保藏在braunschweig的德国微生物和细胞培养物保藏中心(dsmz)，保藏号为dsmacc2334。关于其余材料的描述见cic测定。结果:图5示出根据本发明的方法与现有抗原测定法的比较。由于现有抗原测定使用1:2的样品稀释度，因此其结果包括该稀释度和适用于根据本发明测定法的1:10稀释度。图5示出样品e4265仅在根据本发明的测定中是阳性的，而在现有抗原测定中无论是在1:10还是在1:2的样品稀释度均未被识别。样品e3630在根据本发明的测定中为弱阳性。在进一步分析中确认了阳性信号(表和图6)。尽管仅在1:2稀释度，但现有抗原测定同样示出弱阳性至临界阳性信号。下一个稀释步骤1:4已经明显为阴性，吸光度值为0.034(未示出)，这导致了阴性评估。由于从1:2开始的系列稀释的高样品体积，即100μl，因此不再可能重复。在两种抗原测定中，样品e3727和e3731均为阴性，甚至在现有抗原测定中以1:2稀释度的情况中。两种样品均来自医院眼科的医师/护士团队。但是，与cic测定组合示出二者均被bdv慢性感染(见表)。团队成员e3731具有高cic值和另外具有抗体，表明最近发生了急性病毒发作。在样品e4265和e3630的情况中，其仅在1:10样品稀释度在新测定中呈阳性，应该强调的是现有测定即使在1:2样品稀释度(比标准低五倍)，不能或不能明确地检测bdv抗原。因此，根据本发明的测定法比现有测定法高至少五倍的灵敏度，且能证明医学同事(e4265，女性，研究人员；e3630，女性，已退休)在采样时经历了急性bdv感染。如果只有现有抗原测定可用，则必须在同时检测cic的基础上做出诊断“慢性感染”，而急性暴露将被忽视(见表)。图6示出了根据本发明的抗原测定与cic测定和根据de19758017c2的抗体(ab)测定的组合使用的结果。因此，表1的值由累积列清楚地描绘。图6示出了根据本发明的测定法在实施例组中可鉴别六个急性感染(e4123，e4278，e4113，e3630，e4265和e3838)。组合cic测定，在根据本发明测定中的阴性结果可鉴别六个慢性感染(e3727，e3693，e3731，e4272，e4173，e3977)。在组中有4例阴性cic和抗体测定可以排除bdv感染(e3667，e3728，e4064，e3875)。选择根据结构化访问在先前和当前均没有精神疾病的医务人员样品组，以表明根据本发明的测定单独及与cic测定和抗体测定组合使用，不依赖于临床症状而能够区分急性、慢性和潜伏性感染以及通过单个血样分析可排除bdv感染。慢性压力在医疗部门日常生活中很常见，因此增加的激活风险似乎并不罕见。另外，在患者日常护理中存在增加的感染风险。现有抗原测定的100μl体积，初始1:2稀释度和随后的稀释系列，体积与根据本发明的抗原测定相比明显更高，仅可用于对于在其它地方已经多次分析的研究样品的选择性平行测试，如图5所示。不用直接比较，本发明新方法的抗原检测优势是多种多样且实用的。首先，对于各种各样的不同样品材料，即对于任何类型的体液或组织液，都可能具有广泛适用性。不依赖于宿主物种测定bdv活动性。此外，由p24和p40组成的磷酸化异二聚体的确定可以验证急性bdv感染，因为一抗kfu2仅结合bdvp蛋白的活动性磷酸化形式。对于本文使用的单克隆抗体kfu2，这是全球独特的特征。与de19758017c2中描述的测定法相反，本发明确定的是异二聚体。相反，现有方法基于两种捕获抗体，即针对p24和p40二者的固定化一抗，也用于确定其单体形式。然而，不能与之区别本发明的磷酸化异二聚体。在一个实施方案中，根据本发明的方法另外使用可以高水平再现性的二抗。在结合对生物素-链霉抗生物素蛋白与酶如碱性磷酸酶偶联的实施方案中，与现有仅通过酶标记的抗抗体目测检测信号相比，实现了信号增强及因此改良的可检测性。此外，需要明显较少的患者样品(一次测定需要10μl，20μl以1:10系列稀释)，且该方法的灵敏度是1:10初始稀释样品的5倍高。通过与现有抗原测定相比，尤为明显的是有可能在更多个体中识别急性bdv感染。本发明提供了一种急性bdv感染的全新测定方法，其与现有抗原测定相比具有更高的灵敏度且不依赖于有限的资源，例如兔抗体为代表。通过与cic测定和抗体测定组合，所述新方法能可靠地区分急性、慢性和潜伏性感染(人和动物)及因此将bdv诊断提高到迄今未达到的高质量标准的信息价值水平。因此，根据本发明的方法特别适合于诊断，但也适合于bdv感染的病程监测，尤其还适合于确定治疗计划。此外，根据本发明的方法可以是治疗方法的一部分。在此首次命名了形成各个构象表位的结合位点的先前未公开的氨基酸序列。其是单克隆抗体w1和kfu2的特性必不可少的分子组成。本发明提供了一种急性bdv感染的全新测定方法，其不依赖于受限的资源且可以就物种而言以全局方式用于人和动物。通过将新的诊断试剂盒与已知方法或试剂盒用于检测血浆或血清中循环免疫复合物(cic)和抗体相组合，所述新方法能可靠地区分急性、慢性和潜伏性感染(人和动物)以及在bdv诊断中能达到前所未有的信息价值水平。引用的参考文献(以字母顺序)bergm,etal.,jgenvirol.1998；79(pt12):2957-2963.bodel.humanbornavirusinfection–towardsavaliddiagnosticsystem.apmissuppl124,2008；116:21-39.bodel,etal.thelancet1997；349:178-179.bodel,etal.molpsychiatry1996；1:200-212.bodel,ludwigh.bornadiseasevirusinfection,ahumanmental-healthrisk.clinmicrobiolrev.2003；16(3):534-545.review.bodel,etal.molpsychiatry2001；6:481–491.brieset,etal.procnatlacadsciusa.1994；91(10):4362-4366.cubittb,etal.jvirol.1994；68(3):1382-1396.dietrichde,bodel.humanbornadiseasevirusinfectionanditstherapyinaffectivedisorders.apmissuppl124,2008；116:61-65.dietrichde,etal.bipolardisorder2000；2:65-70.fersztr,etal.pharmacopsychiatry1999；32(4):142-147liux,etal.virolj.2015；12:39.ludwigh,etal.archvirol1993；suppl7:111–133.rudolphm,etal.structure2003；11:1219–1226.schwemmlem,etal.jbiolchem.1997；272(35):21818-21823序列表<110>h·路德维希l·博德<120>检测急性博尔纳病病毒(bdv)感染的方法及其诊断试剂盒，特别是组合区分急性及慢性和潜伏性bdv感染的方法及其诊断试剂盒<130>2048-005pct-1<150>de102017121046.6<151>2017-09-12<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>370<212>prt<213>bornadiseasevirus<400>1metproprolysargargleuvalaspaspalaaspalametgluasp151015glnaspleutyrgluproproalaserleuprolysleuproglylys202530pheleuglntyrthrvalglyglyseraspprohisproglyilegly354045hisglulysaspileargglnasnalavalalaleuleuaspglnser505560argargaspmetphehisthrvalthrproserleuvalpheleucys65707580leuleuileproglyleuhisalaalaphevalhisglyglyvalpro859095argglusertyrleuserthrprovalthrargglygluglnthrval100105110vallysthralalysphetyrglyglulysthrthrglnargaspleu115120125thrgluleugluileserserilepheserhiscyscysserleuleu130135140ileglyvalvalileglyserserserlysilelysalaglyalaglu145150155160glnilelyslysargphelysthrmetmetalaalaleuasnargpro165170175serhisglygluthralathrleuleuglnmetpheasnprohisglu180185190alaileasptrpileasnglyglnprotrpvalglyserphevalleu195200205serleuleuthrthraspphegluserproglylysgluphemetasp210215220glnilelysleuvalalasertyralaglnmetthrthrtyrthrthr225230235240ilelysglutyrleualaglucysmetaspalathrleuthrilepro245250255valvalalatyrgluileargasppheleugluvalseralalysleu260265270lysgluasphisalaaspleuphepropheleuglyalailearghis275280285proaspalailelysleualaproargserpheproasnleualaser290295300alaalaphetyrtrpserlyslysgluasnprothrmetalaglytyr305310315320argalaserthrileglnproglyalaservallysgluthrglnleu325330335alaargtyrargargarggluileserargglygluaspglyalaglu340345350leuserglygluileseralailemetargmetileglyvalthrgly355360365leuasn370<210>2<211>201<212>prt<213>bornadiseasevirus<400>2metalathrargproserserleuvalaspserleugluaspgluglu151015aspproglnthrleuargarggluargserglyserproargproarg202530lysvalproargasnalaleuthrglnprovalaspglnleuleulys354045aspleuarglysasnprosermetileseraspproaspglnargthr505560glyarggluglnleuserasnaspgluleuilelyslysleuvalthr65707580gluleualagluasnsermetileglualaglugluvalargglythr859095leuglyaspileseralaargileglualaglyphegluserleuser100105110alaleuglnvalgluthrileglnthralaglnargcysasphisser115120125aspserileargileleuglygluasnilelysileleuaspargser130135140metlysthrmetmetgluthrmetlysleumetmetglulysvalasp145150155160leuleutyralaserthralavalglythrseralaprometleupro165170175serhisproalaproproargiletyrproglnleuproseralapro180185190thrthraspglutrpaspileilepro195200<210>3<211>5<212>prt<213>bornadiseasevirus<400>3lyspheleuglntyr15<210>4<211>5<212>prt<213>bornavirusdisease<400>4alalysphetyrgly15<210>5<211>5<212>prt<213>bornadiseasevirus<400>5thrmetmetalaala15<210>6<211>5<212>prt<213>bornadiseasevirus<400>6leualaproargser15<210>7<211>5<212>prt<213>bornadiseasevirus<400>7phetyrtrpserlys15<210>8<211>15<212>prt<213>bornadiseasevirus<400>8argarggluargserglyserproargproarglysvalproarg151015<210>9<211>12<212>prt<213>bornadiseasevirus<400>9leuleulysaspleuarglysasnprosermetile1510<210>10<211>5<212>prt<213>bornadiseasevirus<400>10aspargsermetlys15当前第1页12