一种定量测定茶碱和可可碱的方法与流程

本发明属于纳米材料制备及含量测定技术领域，具体涉及一种新型可逆纳米卟啉荧光传感器可控制备及其高灵敏检测茶碱和可可碱的方法。

背景技术：

可可碱和茶碱等嘌呤类生物碱广泛存在于全世界至少63种植物的叶，种子和果实之中^[1]，而且茶碱和可可碱又具有兴奋神经，利尿等作用，适度使用可以缓解疲劳，是常用的药物成分，而且被广泛使用在食品中。可可碱是咖啡因的前体物质，广泛存在于可可种子和山茶科植物的叶子中。由于可可碱具有苦味，常被用作食品加工中的苦味剂。另外可可碱具有利尿，心肌兴奋，血管舒张，平滑肌松弛等作用，也被用于运动饮料和咖啡等具有提神醒脑作用的饮料中。现有的可可碱检测方法多为薄层色谱和液相色谱。茶碱是甲基嘌呤类药物。具有强心、利尿、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌和兴奋中枢神经、抗炎系统等作用。主要用于治疗支气管哮喘、肺气肿、支气管炎、心脏性呼吸困难。常用的茶碱类药物给药途径主要有口服和静脉注射两种，茶碱类药物已经临床使用多年，具有悠久的历史，但由于剂量控制不精确易产生成瘾性等不良反应，在哮喘的临床治疗中相对可吸入糖皮质和β2受体激动剂有所减少，但是由于历史悠久及价格便宜，使用方便等优势，随着茶碱类药物的药理学研究的深入，茶碱类药物一定会对人类健康做出更多的贡献。茶碱及其代谢物的分析方法已有较多文献报道，包括液相色谱法、紫外光谱法、荧光光谱法、气相色谱法、毛细管电泳法和液相色谱-串联质谱等。这些传统方法具有灵敏度高或分离能力强等特点，但同时也存在一些不足，如难以避免衍生试剂对茶碱和可可碱识别的影响、复杂的制样准备工作、检测时间长等。因此研究一种快速的、高灵敏度和选择性的茶碱和可可碱定量分析的方法对茶碱和可可碱在食品安全和环境检测中的作用具有非常重要的意义。

本发明为克服现有方法的缺陷，提供了一种新的检测茶碱和可可碱的分析方法。

技术实现要素：

本发明的目的之一提供一种制备简单、反应条件温和的新型可逆纳米卟啉荧光传感器可控制备方法；目的之二是提供一种灵敏度高、选择性好，基于荧光开-关-开模式法快速定量测定茶碱和可可碱的可逆纳米卟啉荧光传感器。

本发明使用的特异性茶碱和可可碱的可逆纳米卟啉荧光传感器，采用zncdse量子点作为荧光探针，四-(4-吡啶基)锌卟啉n,n-二甲基甲酰胺溶液与十二烷基三甲基溴化铵(dtab)制备得到的自组装纳米卟啉为荧光猝灭剂，两者的特异性结合得到开关纳米卟啉荧光传感器。开关纳米卟啉荧光传感器与茶碱和可可碱作用得到可逆(开-关-开)纳米卟啉荧光传感器。

本发明解决问题采取的技术方案为，定量识别可可碱和茶碱的纳米卟啉荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将二氯化锌和n-乙酰-l-半胱氨酸溶于超纯水中，在冰浴、常压下搅拌20分钟后用氢氧化钠溶液将溶液ph调为9.7，然后加入二氯化镉充氮气冰浴搅拌5分钟。加入nahse，搅拌5分钟。最后将此溶液放入反应釜中，在200℃的烘箱中反应65分钟，得到荧光zncdse量子点；

(2)将四-(4-吡啶基)锌卟啉溶于n,n-二甲基甲酰胺溶液中，在十二烷基三甲基溴化铵(dtab)水溶液中加入四-(4-吡啶基)锌卟啉n,n-二甲基甲酰胺溶液，常温、常压超声5min，70℃热水浴10min溶液由浑浊变澄清，反应停止(四-(4-吡啶基)锌卟啉n,n-二甲基甲酰胺溶液，得到棒状四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装体即纳米卟啉溶液；

(3)将四-(4-吡啶基)锌卟啉纳米棒自组装溶液加入到zncdse量子点荧光探针中，再加入ph＝6.02的tris-hcl缓冲溶液，四-(4-吡啶基)锌卟啉纳米棒自组装溶液通过电子转移和荧光共振能量转移作用，部分或完全猝灭量子点荧光，通过特异性结合得到的复合物，提供量子点一个“turn-off”的状态；

(4)将不同标准浓度的可可碱或茶碱分别加入步骤(3)得到的相同的量子点荧光部分或完全猝灭的复合物中，量子点荧光恢复，不同标准浓度的可可碱或茶碱致使量子点荧光恢复的现象产生明显的差异，记录不同标准浓度的可可碱和或茶碱对应的量子点荧光恢复情况；

或直接将步骤(3)和(4)合并：将不同浓度的可可碱或茶碱、步骤(2)中合成的四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液、ph＝6.02的tris-hcl缓冲溶液混合，静置5分钟；再加入步骤(1)合成的zncdse量子点，在400-550nm处进行荧光光谱测定，测得其5分钟后的光谱；记录不同标准浓度的可可碱和或茶碱对应的量子点荧光恢复情况。

(5)将待测浓度的可可碱和或茶碱加入到与步骤(4)相同的量子点荧光部分或完全猝灭的复合物中，结合步骤(4)浓度和量子点荧光恢复情况，从而得到待测物的浓度；实现了在可逆纳米卟啉荧光传感模式下可可碱和茶碱的识别与定量；

进一步优选：

本发明中二氯化锌、n-乙酰-l-半胱氨酸、二氯化镉、nahse的物质的量的比例优选为：1.0:3.0:0.03:0.1，一般步骤(1)zncdse量子点荧光探针发射波长为460～480nm；

本发明步骤(2)中四-(4-吡啶基)锌卟啉与十二烷基三甲基溴化铵的物质的量比为1:128～133；

本发明中步骤(3)四-(4-吡啶基)锌卟啉纳米棒与zncdse量子点溶液的物质的量比为465～475:1；

进一步优选本发明中步骤(3)最后的混合溶液中四-(4-吡啶基)锌卟啉纳米棒的浓度、zncdse量子点浓度分别为2.78×10^-6～1.392×10^-5mol/l、2.37×10^-8mol/l。

进一步优选：本发明的可逆纳米卟啉荧光传感器是通过量子点与纳米卟啉特异性结合得到的复合物。荧光强度由810左右降至320左右。

本发明的方法，可以用于生物基质中茶碱和可可碱的微量检测。

本发明的可逆纳米卟啉荧光传感器灵敏度高。zncdse量子点荧光探针的荧光强度随着四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液的增加逐渐减弱，甚至可以猝灭到底，本发明只要进行了部分淬灭或完全猝灭(优选在直线关系部分范围内)，均能实现步骤(4)的定性定量检测；四-(4-吡啶基)锌卟啉纳米棒浓度(2.78×10^-6～1.392×10^-5mol/l)与zncdse量子点(2.37×10^-8mol/l)的荧光强度成很好的线性关系；在一定的范围内检测可可碱和茶碱的荧光强度具有线性关系。

本发明的可逆纳米卟啉荧光传感器定量检测可可碱和茶碱的能力强。可可碱(1.0×10^-10-1.0×10^-8mol/l)和茶碱(1.0×10^-11-1.0×10^-9mol/l)与可逆纳米卟啉荧光传感器结合后的荧光强度随着浓度增加而增强，并成很好的线性关系。线性相关系数分别可为0.996、0.9987。由于其结合能力强于纳米卟啉与量子点之间的弱的静电作用，再加入zncdse量子点反应一段时间，纳米卟啉与zncdse量子点的结合变弱，荧光恢复。可可碱和茶碱致使量子点荧光恢复的现象产生明显的差异，实现了在可逆纳米卟啉荧光传感模式下可可碱和茶碱的识别与定量。从而得到可逆“开-关-开”纳米卟啉荧光传感器；所以步骤(3)和(4)合并和分开能得到相同的效果。

本发明的可逆纳米卟啉传感器稳定性好。该可逆纳米卟啉荧光传感器在1.0×10^-5mol/l离子(mg2so4、cacl2、zncl2)、0.1μg/ml生物基质(小牛血浆、新生牛血清)和1.0×10^-5mol/l混合干扰的情况下，与茶碱和可可碱作用荧光恢复的强度几乎不变。

本发明的可逆纳米卟啉荧光传感器对茶碱和可可碱响应速度快。可逆纳米卟荧光传感器中加入茶碱和可可碱后，荧光快速恢复，5分钟达到最稳定值。

本发明所述的方法，相比传统以色谱发法测定茶碱和可可碱的方法有诸多优势，包括制备简单、反应条件温和，对茶碱和可可碱检测的灵敏度高、抗干扰能力强、响应良好，该纳米卟啉荧光传感器在生物化学、医药等领域具有实际的应用价值。

附图说明

图1为本发明新型可逆(开-关-开)纳米卟啉荧光传感器的可控制备方法及其高灵敏检测可可碱、茶碱的方法示意图。

图2为本发明可逆纳米卟啉传感器中的四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液的紫外可见光光谱，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

图3为本发明可逆纳米卟啉传感器中的四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液的透射式电子显微镜图片，其为纳米棒。

图4为本发明可逆纳米卟啉传感器中zncdse量子点与四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液特异性结合后的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明可逆纳米卟啉传感器的灵敏度。四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液(2.78×10^-6～1.392×10^-5mol/l)与zncdse量子点在tris-hcl缓冲溶液(ph＝6.02)作用后的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明可逆纳米卟啉传感器与不同浓度可可碱(1.0×10^-10-1.0×10^-8mol/l)作用后的荧光恢复光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。a为纳米卟啉猝灭的荧光光谱，h为原始荧光光谱，b-g指可可碱浓度(1.00×10^-10、1.00×10^-9、3.00×10^-9、5.00×10^-9、7.50×10^-9、1.00×10^-8mol/l)依次增大，荧光强度依次增强。

图7为本发明可逆纳米卟啉传感器与梯度浓度茶碱(1.0×10^-11-1.0×10^-9mol/l)作用后的荧光恢复光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。a为纳米卟啉猝灭的荧光光谱，g为原始荧光光谱，b-f指茶碱浓度(1.00×10^-11、1.00×10^-10、5.00×10^-10、7.50×10^-10、1.00×10^-9mol/l)依次增大，荧光强度依次增强。

图8为本发明可逆纳米卟啉传感器与不同浓度可可碱作用后线性相关图，横坐标为可可碱的浓度，纵坐标为荧光恢复强度(f2)与zncdse量子点原始荧光强度(f0)的比值。

图9为本发明可逆纳米卟啉传感器与不同浓度茶碱作用后线性相关图，横坐标为茶碱的浓度，纵坐标为荧光恢复强度与zncdse量子点原始荧光强度的比值。

图10为本发明可逆纳米卟啉传感器的稳定性。可逆纳米卟啉传感器与可可碱在ca²⁺、zn²⁺、mg²⁺、小牛血浆、新生牛血清和混合干扰(mixture)的情况下作用后的稳定性。横坐标为所加入的干扰物质，纵坐标为纵坐标为荧光恢复强度(f2)与zncdse量子点原始荧光强度(f0)的比值。

图11为本发明可逆纳米卟啉传感器的稳定性。可逆纳米卟啉传感器与茶碱在ca²⁺、zn²⁺、mg²⁺、小牛血浆、新生牛血清和混合干扰(mixture)的情况下作用后的稳定性。横坐标为所加入的干扰物质，纵坐标为纵坐标为荧光恢复强度(f2)与zncdse量子点原始荧光强度(f0)的比值。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。但以下内容不应理解为是对本发明的权利要求书请求保护范围的限制。

实施例中所使用的化学试剂和溶剂均为分析纯。所述实验操作为超声、水浴加热方式。所述的荧光光谱测定条件均为发射波长400-550nm，激发波长为360nm，狭缝宽度为10-15nm。

将合成出的纳米卟啉用于荧光检测实验，纳米卟啉是很好的猝灭剂，可以用于一些本身没有荧光，又不能使量子点猝灭的样品的检测。

实施例1：可逆纳米卟啉荧光传感器对茶碱的识别和定量分析，所述方法示意图如1，步骤如下：

(1)zncdse量子点荧光探针的合成

将二氯化锌(0.035g,6.4mm)和n-乙酰-l-半胱氨酸(0.1253g,19.2mm)溶于40ml超纯水中，在冰浴、常压下搅拌20分钟后用氢氧化钠溶液将溶液ph调为9.7，调好ph加入300μl二氯化镉(0.00058g,0.237mm)，然后充氮气冰浴搅拌5～10分钟。加入nahse(由0.001g/ml硒粉和0.0029g/ml硼氢化钠制备得到)，搅拌5分钟。最后将此溶液放入反应釜中，在200℃的烘箱中反应65分钟。冷却至室温，得到2.37×10^-8mol/lzncdse量子点荧光探针。

(2)纳米卟啉溶液的合成

将适量四-(4-吡啶基)锌卟啉溶于n,n-二甲基甲酰胺溶液中，得到浓度为1.392×10^-3mol/l四-(4-吡啶基)锌卟啉n,n-二甲基甲酰胺溶液，其紫外光谱图如图2。将十二烷基三甲基溴化铵(0.0183g)溶于45ml水溶液中，加入5ml四-(4-吡啶基)锌卟啉n,n-二甲基甲酰胺溶液，常温常压超声5分钟，70℃热水浴10min溶液由浑浊变澄清，反应停止。得到1.392×10^-4mol/l四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液，其紫外光谱图如图2。其透射式电子显微镜表征显示为粒径114nm左右的纳米棒，如图3。

(3)开关纳米卟啉荧光传感器的制备

在1.5ml比色皿中加入110μl2.37×10^-8mol/l步骤(1)合成的zncdse量子点和890μlph＝6.02的tris-hcl缓冲溶液，在400-550nm处进行荧光光谱测定，474nm处得到荧光强度为839的峰，如图4。在1.5ml比色皿中加入110μl2.37×10^-8mol/l步骤(1)合成的zncdse量子点和80μl1.392×10^-4mol/l步骤(2)中合成的四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液，再加入810μlph＝6.02的tris-hcl缓冲溶液，混匀5分钟后，在400-550nm处进行荧光光谱测定,474nm处得到荧光强度为350的峰，如图4。

(4)可逆纳米卟啉荧光传感器对茶碱的定量分析

在1.5ml比色皿中加入100μl茶碱水溶液，80μl1.392×10^-4mol/l步骤(2)中合成的四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液和710μlph＝6.02的tris-hcl缓冲溶液，静置5分钟。再加入110μl2.37×10^-8mol/l步骤(1)合成的zncdse量子点，在400-550nm处进行荧光光谱测定，测得其5分钟后的光谱。茶碱(1.00×10^-11、5.00×10^-11、1.00×10^-10、3.00×10^-10、5.00×10^-10、7.50×10^-10、1.00×10^-9mol/l)与纳米卟啉荧光传感器结合后的荧光强度随着茶碱的浓度增加而增强，如图7，线性相关系数为0.9987，如图9在1.5ml比色皿中加入100μl茶碱(1.00×10^-9mol/l)、100μl干扰物质(1.00×10^-5mol/l)、80μl1.392×10^-5mol/l步骤(2)中合成的四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液和610μlph＝6.02的tris-hcl缓冲溶液，静置5分钟。再加入110μl2.37×10^-8mol/l步骤(1)合成的zncdse量子点，在400-550nm处用荧光光谱测定，测得其5分钟后的光谱，荧光恢复几乎不受干扰因素的影响，表现出很强的抗干扰能力，如图11。

实施例2：可逆纳米卟啉荧光传感器对可可碱定量分析，所述方法示意图如1，步骤如下：

(1)zncdse量子点荧光探针的合成

采用实施例1中步骤(1)的方法合成zncdse量子点荧光探针。

(2)四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液的合成

采用实施例1中步骤(2)的方法合成四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液。

(3)开关纳米卟啉荧光传感器的制备

采用实施例1中步骤(3)的方法制备纳米卟啉荧光传感器。

(4)可逆纳米卟啉荧光传感器对可可碱的定量分析

在1.5ml比色皿中加入100μl可可碱水溶液，80μl1.392×10^-4mol/l步骤(2)中合成的四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液和710μlph＝6.02的tris-hcl缓冲溶液，静置5分钟。再加入110μl2.37×10^-8mol/l步骤(1)合成的zncdse量子点，在400-550nm处进行荧光光谱测定，测得其5分钟后的光谱。可可碱(1.00×10^-10、1.00×10^-9、3.00×10^-9、5.00×10^-9、7.50×10^-9、1.00×10^-8mol/l)与纳米卟啉荧光传感器结合后的荧光强度随着可可碱的浓度增加而增强，如图6，线性相关系数为0.996如图8。在1.5ml比色皿中加入100μl可可碱(1.00×10^-9mol/l)、100μl干扰物质(1.00×10^-5mol/l)、80μl1.392×10^-4mol/l步骤(2)中合成的四-(4-吡啶基)锌卟啉自组装溶液和610μlph＝6.02的tris-hcl缓冲溶液，静置5分钟。再加入110μl2.37×10^-8mol/l步骤(1)合成的zncdse量子点，在400-550nm处用荧光光谱测定,测得其5分钟后的光谱，荧光恢复几乎不受干扰因素的影响，表现出很强的抗干扰能力，如图10。