一种基于QuEChERS-分散液液微萃取痕量检测5-羟甲基糠醛的方法与流程

本发明属于分析化学及食品安全技术领域，具体涉及一种基于quechers-分散液液微萃取痕量检测5-羟甲基糠醛的方法。

背景技术：

大米作为一种富含淀粉的产品，是世界上大多数人口的主要食物。大米经电饭锅烹饪后，会在温度为60～80℃的条件下维持保温状态。同时，电饭锅中的温度和水分含量较高，因此，在米饭烹饪和保温过程中会发生美拉德反应并加速了5-羟甲基糠醛的形成。据报道，美拉德反应和长时贮藏过程都有助于大米中5-羟甲基糠醛的形成。5-羟甲基糠醛是食品在热处理过程中发生美拉德反应产生的副产物，通常被作为一种热损伤指标，以用于评估米饭在热加工过程中美拉德反应的程度，也是衡量含糖食品在贮藏期间质量损失的指标。除此之外，5-羟甲基糠醛作为一种食品污染物，在食品中具有潜在的危害性。据报道，5-羟甲基糠醛广泛存在于种类繁多的富含碳水化合物的食品，如谷物制品、饼干、果酱、婴儿奶制品、果汁等。特别的是，lamberts和villanova等人已发表了关于大米中含有5-羟甲基糠醛的文献。分析食品中的5-羟甲基糠醛有多种分析方法，其中超高效液相色谱质谱联用是结合了uplc的高效分离能力与ms/ms的高灵敏度和极强专属性的分离检测技术，即使在复杂的样品基质中还具有重复性好、灵敏度高、分析速度快等特点，然而由于基质较为复杂而且5-羟甲基糠醛的含量是痕量级的，直接采用仪器分析较为困难，因此有必要在仪器分析之前，对分析物进行净化、富集预处理。样品的前处理是关系到分析结果准确性的关键步骤，是去除复杂基质干扰、提高分析物回收率的重要步骤。目前，文献报道了许多用于提取样品中5-羟甲基糠醛的前处理方法，如传统的固相萃取、液相萃取，但是传统方法耗时、耗材昂贵且消耗大量的有机溶剂。为解决这一问题，分散液液微萃取(dllme)技术得到广泛应用，该微萃取技术由rezaee等人于2006年首次提出，具有操作简便、回收率高、萃取时间短、价格低廉、富集因子高等优点，但不适用于固体样品。迄今为止，尚未见关于大米中5-羟甲基糠醛的有效前处理净化、富集方法和痕量检测的报道。因此，开发一种准确、快速、有效、价格低廉、简便的前处理净化以及富集方法(quechers-分散液液微萃取)用于检测和定量大米中的5-羟甲基糠醛具有重要意义。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种快速、准确、有效、简便、稳定，而且兼顾高富集因子、环境污染小、经济优势的前处理方法，用以痕量检测米饭中美拉德反应副产物5-羟甲基糠醛。本发明采用改进的quechers结合分散液液微萃取(dllme)作为前处理净化技术，并利用超高效液相色谱-质谱联用(uplc-ms/ms)为检测方法，克服了现有方法有机溶剂消耗大、耗时长、基质干扰多、步骤繁琐等问题，能够快速地检测米饭中的5-羟甲基糠醛，适用范围广，测定结果具有较高的准确度、良好的灵敏度和优异的回收率。

quechers萃取分离技术近年来已被进行了改进，用于测定蔬菜、土壤、茶叶等不同基质的农药残留量。但是，目前为止，尚未见有用quechers萃取分离技术处理大米(固体样品)中5-羟甲基糠醛的文献报道，也未见将quechers与dllme联合用于净化、富集浓缩大米中5-羟甲基糠醛的文献。

本发明的第一个目的是提供一种米饭中5-羟甲基糠醛的前处理方法，所述方法包括：

(1)在有机溶剂中，将每8～12g米饭与40mg～80mg的十八烷基硅烷键合硅胶(c18)、40mg～80mg的n-丙基乙二胺(psa)作用，进行净化，得到净化液；

(2)将步骤(1)所得的净化液与萃取剂混合，然后加入水，实现富集，即得前处理样品。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中还可以加入0mg～15mg的碳黑(gcb)。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中优选不加入gcb。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中还包括加入0.5g～2g的硫酸镁(mgso4)和0.5g～1.5g氯化钠(nacl)作为除水剂。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的有机溶剂包括乙腈。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中有机溶剂的添加量为米饭质量的0.5～1.5倍体积。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的净化液与萃取剂的体积比为(2～8):1。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中萃取剂包括三氯甲烷、二氯甲烷、四氯化碳、氯苯；优选三氯甲烷。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中水的ph为7～10。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中水与净化液和萃取剂体积之和的体积比为(0.5～2):1。

在本发明的一种实施方式中，所述米饭的制备方法包括：粳米中加入1～1.5倍体积的水蒸煮保温0h～42h，即得保温不同时间的米饭，而且保温时间的长短对本发明的内容产生影响。

本发明的第二个目的是提供一种定量检测米饭中5-羟甲基糠醛的方法，所述方法包括：预先进行米饭的前处理，得到前处理样品，然后进行检测；所述前处理的方法为上述的前处理方法。

在本发明的一种实施方式中，所述检测包括高效液相色谱(hplc)检测、液相色谱-质谱联用(lc-ms)检测、气相色谱(gc)检测、气相色谱-质谱联用(gc-ms)检测、胶束电动毛细管色谱(mekc)检测、高效阴离子交换色谱(hpaec)等。

本发明的第三个目的是提供一种超高效液相色谱-质谱联用(uplc-ms)痕量检测5-羟甲基糠醛的方法，所述方法包括：预先进行米饭的前处理，得到前处理样品，然后进行液相色谱-质谱联用检测；所述前处理的方法为上述的前处理方法。

在本发明的一种实施方式中，所述液相色谱的条件为：色谱柱为反相c18色谱柱(包括acquityuplcbeh反相c18柱、phenomenexsynergifusion反相c18柱、sunfirewaters反相c18柱等)，柱温为25～40℃；流动相a为100％的超纯水溶液，流动相b为100％的甲醇，采取梯度洗脱程序，流速为0.2～1ml/min，进样量为10～15μl。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括：

(1)取米饭8～12g放入离心管中，加入0.5～1.5倍体积的乙腈溶液并通过高速剪切分散器在5000～8000rpm转速下匀浆2～5min进行粗提操作，得到匀浆液；

(2)净化过程：

在步骤(1)的匀浆液中加入0.5g～2g的硫酸镁(mgso4)和0.5g～1.5g氯化钠(nacl)作为除水剂，随后迅速涡旋0.5～1.5min，再在7000～9000rpm下离心4～8min以沉淀米饭样品获得澄清的含有5-羟甲基糠醛的乙腈层；然后在澄清溶液中加入吸附剂包括40mg～80mg的十八烷基硅烷键合硅胶(c18)，主要用于去除样品中的脂质和其他非极性干扰物；40mg～80mg的n-丙基乙二胺(psa)作为弱阴离子交换吸附剂，通常用于去除脂肪酸、有机酸、各种糖类和基质共萃取物等；0mg～15mg的碳黑(gcb)作为一种除色剂，主要用于去除样品中的色素。随后迅速涡旋0.5～1.5min并在7000～9000rpm下离心4～8min，将澄清的上层清液置于离心管中，即为净化液；

(3)分散液液微萃取进一步净化处理和富集浓缩过程：

取一定体积的步骤(2)中的乙腈层(净化液作为分散剂)与一定体积的萃取剂混合，使净化液与萃取剂的体积比为(2～8):1，随后向混合液中加入ph范围在7～10的超纯水，使超纯水与净化液和萃取剂体积之和的体积比为(0.5～2):1；混合溶液立即呈现出云雾状，在7000～9000rpm下离心4～8min，然后收集最下层的有机相经氮气吹干，得残渣备用；

(4)超高效液相色谱-质谱联用测定米饭中的5-羟甲基糠醛：

超高效液相色谱条件为：色谱柱为反相c18色谱柱(包括acquityuplcbeh反相c18柱、phenomenexsynergifusion反相c18柱、sunfirewaters反相c18柱等)，柱温为25～40℃；流动相a为100％的超纯水溶液，流动相b为100％的甲醇，采取梯度洗脱程序，流速为0.2～1ml/min，进样量为10～15μl；质谱条件为：离子源为电喷雾离子源(esi)，源参数为：入口电压(ep)为10v，电喷雾电压为5500v，碰撞能量(ce)为15v，离子源温度为600℃，源气体和辅助气体分别设定为15l/min和18l/min，扫描模式为正离子扫描，采集模式为多反应监测(mrm)；

(5)米饭中的5-羟甲基糠醛含量测定结果的计算：

移取特定浓度的5-羟甲基糠醛标准品溶液添加到米饭中，对其进行样品前处理-超高效液相色谱-质谱联用(改进的quechers-分散液液微萃取前处理净化方法-uplc-ms/ms)测定，得到标准曲线；将步骤(5)中的测定结果带入标准曲线求得待分析米饭中5-羟甲基糠醛的含量。

本发明的优点和效果：

本发明将改进的quechers和分散液液微萃取技术联用，并有效结合uplc-ms/ms检测方法，建立了quechers-dllme-uplc-ms/ms法痕量测定米饭中的美拉德反应副产物5-羟甲基糠醛的检测方法。该方法用乙腈溶剂粗提米饭中的5-羟甲基糠醛，利用c18、psa等吸附剂净化，随后通过分散液液微萃取步骤(优化萃取剂、分散剂、ph等条件)，达到进一步净化与富集浓缩的效果，然后进行uplc-ms/ms分析测定。该方法提高了对待测物5-羟甲基糠醛的选择性，也大大增加了富集倍数，为前处理技术的开发应用提供了新思路，也对痕量检测米饭(固体样品)中美拉德反应副产物5-羟甲基糠醛的提取、分离、富集浓缩增加了新方法。

本发明方法有效缩短了前处理时间，30min内至少可以同时完成6个样品的前处理，而且有机试剂用量少、废弃物少、对环境污染小；此外，通过对除水剂、吸附剂、萃取剂、分散剂等的条件优化，降低了复杂基质的干扰，提高了净化效率和回收率。结果表明，该方法不仅实现了对5-羟甲基糠醛的高选择性和高灵敏度的有效结合，而且具有准确、快速、简便、有效、稳定、低成本、重复性好、回收率高等优点，适合米饭(固体样品)中5-羟甲基糠醛的痕量测定。其中检测限和定量限分别为0.1、0.3μg/l，具有较高的灵敏度；日内和日间精密度的相对标准偏差均在9％以内，平均准确度在93.95％～114.22％之间；平均回收率在82.87％～104.86％之间，相对标准偏差在9％以内。

附图说明

图1为实施例1-2优化改进的quechers-dllme前处理方法，其中a：改进的quechers方法条件优化；b：dllme萃取条件优化；

图2为实施例3中米饭未经前处理和经改进的quechers-dllme前处理方法对比色谱图，其中a、c：米饭样品中分别添加50、500μg/l的5-羟甲基糠醛标品，未经前处理的色谱图；b、d:米饭样品中分别添加50、500μg/l的5-羟甲基糠醛标品，经改进的quechers-dllme前处理方法的色谱图；

图3为实施例4米饭只经改进的quechers处理和只经dllme前处理和经改进的quechers-dllme前处理方法对比色谱图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

富集因子的测定方法：

改进的quechers-dllme前处理的富集因子按照以下公式计算：富集因子ef＝ca/cb，ca为米饭中加入5-羟甲基糠醛标准品通过改进的quechers-dllme前处理后得到的峰面积，cb为米饭中加入5-羟甲基糠醛标准品未经过以上前处理方法得到的峰面积。

实施例1

一、样品前处理：

(1)制备米饭：

粳米中加入1.5倍体积的水，随后在电饭锅中煮制得到米饭。

米饭中5-羟甲基糠醛的粗提过程：

称取米饭10g放入离心管中，加入10ml的乙腈溶液并通过高速剪切分散器在8000rpm转速下匀浆3min进行粗提操作。

(2)改进的quechers前处理净化过程：

在步骤(1)中的米饭中加入1g的硫酸镁(mgso4)和0.5g氯化钠(nacl)作为除水剂，随后迅速涡旋1min，再在8000rpm下离心5min以沉淀米饭样品获得澄清的含有5-羟甲基糠醛的乙腈层。然后在澄清溶液中加入一定量的吸附剂包括60mg的十八烷基硅烷键合硅胶(c18)、50mg的n-丙基乙二胺(psa)。随后迅速涡旋1min，再在8000rpm下离心5min，将澄清的上层清液置于离心管中，即为净化液。

(3)分散液液微萃取进一步净化处理和富集浓缩过程：

取一定体积的步骤(3)中的乙腈层(净化液作为分散剂)与一定体积的萃取剂混合，使净化液与萃取剂的体积比为4:1，所述萃取剂优化为三氯甲烷。随后向混合液中加入一定体积的ph为7的超纯水，使超纯水与净化液萃取剂体积之和的比值为1:1。混合溶液立即形成呈现出云雾状，在8000rpm下离心5min，然后收集最下层的有机相经氮气吹干，得到前处理样品。

二、利用超高效液相色谱-质谱联用测定米饭中的5-羟甲基糠醛：

超高效液相色谱条件为：色谱柱：acquityuplcbeh-rpc18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm)，柱温为40℃。流动相a为100％的超纯水溶液，流动相b为100％的甲醇，采取梯度洗脱程序，流速为0.3ml/min，进样量为10μl。质谱条件为：离子源为电喷雾离子源(esi)，源参数为：入口电压(ep)为10v，电喷雾电压为5500v，碰撞能量(ce)为15v，离子源温度为600℃，源气体和辅助气体分别设定为15l/min和18l/min，扫描模式为正离子扫描，采集模式为多反应监测(mrm)。

计算米饭中的5-羟甲基糠醛含量测定结果：

移取特定浓度的5-羟甲基糠醛标准品溶液添加到米饭中，对其进行样品前处理-超高效液相色谱-质谱联用(改进的quechers-dllme-uplc-ms/ms)测定，得到标准曲线；将检测结果带入标准曲线求得待分析米饭中5-羟甲基糠醛的含量。

定量分析及方法的有效性评价：

(1)线性关系、检出限、定量限：准确移取适量的5-羟甲基糠醛标准品溶液，添加到米饭样品(无5-羟甲基糠醛的样品)中，待前处理后经uplc-ms/ms分析。以目标组分峰面积为纵坐标，以组分相应的添加浓度(μg/l)为横坐标，绘制标准曲线，结果如表1所示。5-羟甲基糠醛在0.5～50.0μg/l的范围内具有较好的线性关系，回归系数大于0.999，检测限和定量限分别为0.1、0.3μg/l，具有较高的灵敏度。

表1米饭中5-羟甲基糠醛的标准曲线范围、回归方程、检测限和定量限

注：上标a和b值分别表示信噪比的3倍和10倍。

(2)准确度和精密度：在米饭样品中，做2.0、5.0、10.0、20.0和50.0μg/l四个浓度水平的添加实验，每个浓度水平做6个平行样品，分别进行前处理和仪器分析，日内和日间精密度和准确度如表2所示。由表2可知，日内和日间精密度的相对标准偏差均在9％以内，平均准确度在93.95％～114.22％之间，符合国内外分析标准和要求。

表2米饭中5-羟甲基糠醛的精密度和准确度(n＝6)

(3)回收率：分别对实际样品按低、中、高三个浓度加标水平进行测定，即在2.0、5.0、10.0μg/l三个浓度水平做加标回收实验，每个浓度水平做3个平行样品，分别进行前处理和仪器分析，并按加标量和测定值计算回收率，结果如表3所示。由表3可知，平均回收率在82.87％～104.86％之间，相对标准偏差在9％以内，符合国内外分析标准和要求。

表3米饭中5-羟甲基糠醛的回收率(n＝3)

(4)实际样品测定：

运用本发明建立的方法处理不同保温时间的米饭(即不同5-羟甲基糠醛含量)并进行5-羟甲基糠醛检测，结果如表4所示，该方法简便、快捷、准确、有效，具有很好的适用性和操作性。

表4保温不同时间的米饭样品中5-羟甲基糠醛的测定

上标字母(a-f)表示统计学显著性差异(p<0.05)。

实施例2：

采用单因素实验，对改进的quechers-dllme萃取米饭中5-羟甲基糠醛的方法进行条件考察和优化，包括除水剂、吸附剂种类和含量、分散液液微萃取萃取剂和分散剂的种类与用量、ph的范围等条件，选择最优的条件，得到在最优条件下对米饭中5-羟甲基糠醛的最大萃取率(最高富集因子)。

quechers条件优化：

1)优化mgso4和nacl的用量：固定c1820mg、psa20mg、体积比1为4:1、体积比2为2:1、ph为7，将mgso4的用量分别替换为1g、2g、3g、4g，将nacl的用量分别替换为0g、0.5g、1g、1.5g，具体实验参数如表5所示，处理后的富集效果如图1(a)所示，当加入2gmgso4时，富集因子为0.6，结果表明：加入1gmgso4和0.5gnacl时，5-羟甲基糠醛的富集因子达到0.90。

表5优化mgso4和nacl用量的实验参数

表5中“—”代表应用的实验参数。

2)优化吸附剂的组分和用量：

根据1)优化结果，选用1gmgso4和0.5gnacl，优化吸附剂条件，测定富集效果，具体实验参数如表6所示，处理后的富集效果如图1(a)所示，结果发现：随着c18的用量从20mg增加到60mg，5-羟甲基糠醛的富集因子也增加。c18量继续增加却导致5-羟甲基糠醛的富集因子明显降低，当加至200mg时，富集因子只有0.1。因此，c18的用量为60mg可获得最高的富集因子1.12；当添加50mgpsa时，可获得5-羟甲基糠醛的最大富集因子1.56，当加入100mgpsa时，富集因子只有0.6。此外，由图1(a)所示，随着gcb量的增加，5-羟甲基糠醛的富集因子一直在降低，当加入10mggcb时，富集因子只有0.7，为确保有较好的灵敏度，在本发明样品前处理中不添加gcb。

表6优化吸附剂用量的实验参数

表6中“—”代表应用的实验参数。

结果表明，1gmgso4，0.5gnacl，60mgc18，50mgpsa和0mggcb的组合可以为米饭中5-羟甲基糠醛的提取提供较好的净化处理效果，富集因子为1.98。

dllme条件优化：

1)优化萃取剂的选择：选取quechers的最优条件，改变萃取剂的种类，包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、氯苯，其他条件不变，具体实验参数如表7所示，测定处理后的富集强度，结果如图1(b)所示，萃取剂中选择三氯甲烷可得到最大的5-羟甲基糠醛富集因子1.56。

2)优化萃取剂的用量：选取quechers的最优条件，萃取剂选择三氯甲烷，改变净化液与萃取剂的用量(体积比1)，分别为0.25:1、1:1、4:1、8:1，其他条件不变，具体实验参数如表7所示，测定处理后的富集强度，结果如图1(b)所示，体积比从0.25:1～4:1时，5-羟甲基糠醛的富集因子也随之增加，而体积比1继续增大富集因子出现下降趋势。因此，最佳体积比1的值为4:1，得到1.56的富集因子。

表7优化萃取剂种类和用量的实验参数

表7中“—”代表应用的实验参数。

3)优化水的工艺条件：选取quechers的最优条件，萃取剂选择三氯甲烷，体积比1为4：1，改变水与净化液萃取剂体积之和的比(体积比2)，分别为：0.5:1、1:1、2:1、4:1，具体实验参数如表8所示，测定处理后的富集强度，结果如图1(b)所示，在比值为1:1时获得最大的富集因子1.98；同时，超纯水调节ph范围为3～10，ph值的从3增加到10，5-羟甲基糠醛的最大富集因子2.0在ph10时获得，但是当ph值从7到10时，5-羟甲基糠醛的富集因子增加缓慢，为了实验操作的便利性，ph可选择7即可得到富集因子为1.98的5-羟甲基糠醛萃取效率。

表8优化水的工艺条件实验参数

表8中“—”代表应用的实验参数。

实施例3：

米饭未经前处理进行检测分析：粳米中加入1.5倍体积的水，随后在电饭锅中煮制并维持保温状态0h(保温0h无5-羟甲基糠醛产生，对添加标品无干扰)，并添加50、500μg/l的5-羟甲基糠醛标品。称取米饭10g放入离心管中，加入1倍体积的乙腈溶液并通过高速剪切分散器在8000rpm转速下匀3min进行粗提操作。随后，匀浆液通过0.22μm膜过滤，通过超高效液相色谱分离和质谱检测。

米饭经改进的quechers-dllme前处理方法进行检测分析：选用实施例1中条件下的quechers-dllme前处理方法对添加50、500μg/l的5-羟甲基糠醛标品的米饭进行净化处理，随后通过超高效液相色谱分离和质谱检测。

以上两种处理条件下得到的米饭中5-羟甲基糠醛的色谱图如图2所示，由图2b、d可知，经过改进的quechers-dllme前处理方法，所得谱图无干扰峰，峰型对称性良好且无拖尾，此外相同浓度的5-羟甲基糠醛具有较明显的富集浓缩作用。然而，未经前处理的谱图杂峰较多，峰型不对称，拖尾严重(图2a、c)。因此，改进的quechers-dllme前处理方法降低了基质的干扰，操作性强，富集浓缩效果好，适用于米饭(固体样品)中5-羟甲基糠醛的测定。

实施例4：

米饭只经改进的quechers前处理进行检测分析：粳米中加入1.5倍体积的水，随后在电饭锅中煮制并维持保温状态30h。称取保温不同时间的米饭10g放入离心管中，加入1倍体积的乙腈溶液并通过高速剪切分散器在8000rpm转速下匀浆3min进行粗提操作。然后在匀浆液中加入1gmgso4、0.5gnacl作为除水剂，随后迅速涡旋1min并在8000rpm下离心5min以沉淀米饭样品获得澄清的含有5-羟甲基糠醛的乙腈层。然后在澄清溶液中加入60mgc18、50mgpsa，随后迅速涡旋1min并在8000rpm下离心5min，将澄清的上层清液通过0.22μm膜过滤，通过超高效液相色谱分离和质谱检测。

米饭只经dllme前处理进行检测分析：粳米中加入1.5倍体积的水，随后在电饭锅中煮制并维持保温状态30h。称取保温不同时间的米饭10g放入离心管中，加入1倍体积的乙腈溶液并通过高速剪切分散器在8000rpm转速下匀浆5min进行粗提操作。然后，取一定体积的净化液(分散剂)与一定体积的三氯甲烷(萃取剂)混合，使净化液与萃取剂的体积比(体积比1)为4:1。随后向混合液中加入一定体积的ph值为7的超纯水，使超纯水与净化液萃取剂体积之和的比(体积比2)为1:1。混合溶液立即呈现出云雾状，在8000rpm下离心5min，然后收集最下层的有机相经氮气吹干，用超纯水复溶并通过0.22μm膜过滤，随后通过超高效液相色谱分离和质谱检测。

米饭经改进的quechers-dllme前处理方法进行检测分析：选用最优条件的quechers-dllme前处理方法对米饭进行净化处理，随后通过超高效液相色谱分离和质谱检测。

以上三种处理方式条件下得到的米饭中5-羟甲基糠醛的色谱图如图3所示。由图3可知，只经改进的quechers前处理得到的5-羟甲基糠醛的色谱峰强度最小而且噪音较多、基质干扰较为严重；只经dllme前处理得到的色谱图有所改善，但仍然有较多的噪音，峰型有拖尾且不对称；相比之下，经改进的quechers-dllme前处理得到的5-羟甲基糠醛谱图基线较为平稳、噪音较少、基质干扰小而且峰型对称、峰强度较高。并且，只经改进的quechers前处理和只经dllme前处理得到的检测限分别为5.0μg/l，2.0μg/l；回收率分别为25.86％～42.94％，44.02％～68.55％。

因此，改进的quechers-dllme前处理方法大大消除了基质的干扰、净化作用明显、富集浓缩效果好，适用于米饭中5-羟甲基糠醛的测定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的范围之内。