一种高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物检测
技术领域：
，具体涉及一种高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其应用。
背景技术：
：人血清中的脂蛋白根据密度不同，主要分为：乳糜微粒(chylomicrons，cm)、极低密度脂蛋白(very-low-densitylipoprotein，vldl)、中间密度脂蛋白(intermediate-densitylipoprotein，idl)、低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein，ldl)和高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein，hdl)。其中，hdl是颗粒最小的脂蛋白，促进胆固醇从外周组织移去，转运胆固醇至肝脏或其他组织再分布，可减少胆固醇在血管壁的沉积，起到抗动脉粥样硬化作用。胆固醇又称胆甾醇，以游离胆固醇的形式或以和脂肪酸结合的胆固醇酯的形式存在于血液脂蛋白中，例如：极低密度脂蛋白胆固醇(vldl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)等。hdl主要由肝脏和小肠合成，是颗粒最小的脂蛋白，其中脂质和蛋白质部分几乎各占一半。hdl是一类异质性脂蛋白，由于hdl颗粒中所含脂质、载脂蛋白、酶和脂质转运蛋白的量和质各不相同，采用不同分离方法，可将hdl分为不同亚组分。这些hdl亚组分在形状、密度、颗粒大小、电荷和抗动脉粥样硬化特性等方面均不相同。hdl将胆固醇从周围组织(包括动脉粥样硬化斑块)转运到肝脏进行再循环或以胆酸的形式排泄，此过程称为胆固醇逆转运。gotto等人研究发现，血清hdl-c水平与动脉粥样硬化性心血管疾病(atheroscleroticcardiovasculardisease，ascvd)发病危险呈负相关(gottoamjr,brintonea.assessinglowlevelsofhigh-densitylipoproteincholesterolasariskfactorincoronaryheartdisease:aworkinggroupreportandupdate.jamcollcardiol,2004,43:717-724.)。因此，临床上将hdl-c的高低作为冠心病和动脉粥样硬化的辅助诊断指标之一。根据我国《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》提出的临床血脂测定建议，血清hdl-c的测定主要使用超速离心法、电泳法、色谱法，沉淀法、匀相法等。早期hdl-c常规测定主要采用的是沉淀法，该法可实现较高的分析特异性，但其主要缺点是需预先对标本进行沉淀、离心等处理，结果易受高血脂的影响；超速离心法主要用于靶值的确定及各种hdl-c检测方法学评价，但该法对设备和技术操作有严格要求，一般实验室难以开展。目前通常使用匀相法测定hdl-c含量，其中过氧化氢酶清除法最为常用。比如，中国专利cn107449748a公开了高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其使用方法，采用多种混合表面活性剂，包括泊洛沙姆系列、聚乙烯硫酸盐、十二烷基硫酸钠等，但是大量表面活性剂的添加极有可能对hdl-c进行消耗，进而导致含量测定不准确。再如，中国专利cn106383116a公开了一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，该专利在选择性抑制法的基础上进行改良，加入优选的复合表面活性剂，根本上是使用聚乙二醇修饰胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，并添加硫酸α-环糊精与非高密度脂蛋白形成复合物，但硫酸化环糊精会降低胆固醇的活性，导致hdl-c含量的测定存在极大误差。因此，急需一种准确度高的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。技术实现要素：针对现有技术在高密度脂蛋白胆固醇含量测定过程中存在的准确性差的缺陷，本发明提供一种高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，该试剂盒准确性高、特异性高且具有较宽的线性范围的，适用于临床全白动或半自动生化分析。为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案实现：一方面，本发明提供了一种高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，所述的试剂盒包括试剂r1和试剂r2；所述的试剂r1包括：表面活性剂、氯化镁、4-氨基安替比林和缓冲液；所述的试剂r2包括：胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、脱氧胆酸钠、显色剂、氯化镁和缓冲液。所述的试剂r1还包括叔丁基-4-羟基苯甲醚。所述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，所述试剂r1包括：表面活性剂10.0-30.0mmol/l、氯化镁5.0-15.0mmol/l、4-氨基安替比林0.2-2.0mmol/l、缓冲液50.0-150.0mmol/l和叔丁基-4-羟基苯甲醚0.1-0.7g/l；所述的试剂r2包括：胆固醇酯酶0.2-3.0ku/l、胆固醇氧化酶1.0-5.0ku/l、过氧化物酶5.0-15.0ku/l、脱氧胆酸钠40.0-70.0mmol/l、显色剂1.0-5.0mmol/l、氯化镁5.0-15.0mmol/l和缓冲液50.0-150.0mmol/l。优选地，所述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，所述的试剂r1包括：表面活性剂15.0-25.0mmol/l、氯化镁6.0-10.0mmol/l、4-氨基安替比林0.3-1.5mmol/l、缓冲液70.0-120.0mmol/l和叔丁基-4-羟基苯甲醚0.2-0.6g/l；所述的试剂r2包括：胆固醇酯酶0.5-2.5ku/l、胆固醇氧化酶2.0-4.5ku/l、过氧化物酶7.0-12.0ku/l、脱氧胆酸钠45.0-65.0mmol/l、显色剂2.0-4.0mmol/l、氯化镁6.0-10.0mmol/l和缓冲液70.0-120.0mmol/l。再优选地，所述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，所述的试剂r1包括：表面活性剂18.0-23.0mmol/l、氯化镁7.0-9.0mmol/l、4-氨基安替比林0.5-1.0mmol/l、缓冲液80.0-100.0mmol/l和叔丁基-4-羟基苯甲醚0.3-0.5g/l；所述的试剂r2包括：胆固醇酯酶0.8-1.5ku/l、胆固醇氧化酶2.5-3.5ku/l、过氧化物酶9.0-11.0ku/l、脱氧胆酸钠50.0-62.0mmol/l、显色剂2.5-3.5mmol/l、氯化镁7.5-9.0mmol/l和缓冲液80.0-100.0mmol/l。其中，所述的表面活性剂为鲸蜡醇聚醚-23、吐温-60和span-60中的一种或几种；优选地，所述的表面活性剂为鲸蜡醇聚醚-23。其中，所述的显色剂为2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠和苯酚中的一种或几种；优选地，所述的显色剂为2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸。其中，所述的缓冲液为ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液和ph值为7.0的硼酸盐缓冲液中的一种或几种；优选地，所述的缓冲液为ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液。在一个优选实施方案中，所述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，所述的试剂1包括：鲸蜡醇聚醚-2322.5mmol/l、氯化镁8.0mmol/l、4-氨基安替比林0.6mmol/l、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液90mmol/l和叔丁基-4-羟基苯甲醚0.4g/l；所述的试剂r2包括：2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸3.0mmol/l、胆固醇酯酶1.0ku/l、胆固醇氧化酶3.0ku/l、过氧化物酶10.0ku/l、脱氧胆酸钠56.0mmol/l、氯化镁8.0mmol/l和ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液90mmol/l。所述的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，还包括高密度脂蛋白胆固醇标准品冻干粉2g，需用生理盐水溶解后使用。。另一方面，本发明还提供了一种高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒的使用方法：本试剂盒适用于杜邦ar、日立7080/7170/7600/7180、迈瑞bs320、迪瑞cs600、雅培c8000、东芝tba40fr、奥林巴斯au2700、贝克曼dxc800、西门子advia2400、罗氏p800等全自动生化分析仪。该测定试剂盒的测定方法为两点终点法，反应方向为升反应：(1)将300μl试剂r1和3μl待测样本混合均匀，37℃孵育5min后得到反应液1，测定吸光度a1，测定主波长为546nm、次波长为660nm；(2)加入100μl试剂r2混合均匀，反应5min，得到反应液2，测定吸光度a2，测定主波长为546nm、次波长为660nm；(3)按照步骤(1)-(2)，对不同浓度的高密度脂蛋白胆固醇标准品的吸光度进行测定，得到吸光度a空白和a标准；(4)以标准品的吸光度变化值δa(a标准-a空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度c为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程；(5)计算样本的吸光度变化值δa(a2-a1)，根据标准曲线方程，得到样本中高密度脂蛋白胆固醇浓度。本发明还提供了该试剂盒在测定人血清高密度脂蛋白胆固醇含量中的应用。本发明与现有技术相比，本发明的有益效果有：(1)本发明提供的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分简单，各试剂组分以较优浓度进行配比即可准确测定hdl-c含量，线性范围可达13mmol/l；(2)本发明提供的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒使用选择抑制法，试剂r1选用的表面活性剂(鲸蜡醇聚醚-23)以最佳浓度发挥清除非hdl-c的作用，使非高密度脂蛋白胆固醇彻底释放，与胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下生成氧气和水，从而使非高密度脂蛋白胆固醇彻底被消除；(3)本发明提供的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒通过添加叔丁基-4-羟基苯甲醚，准确度显著提高，理论浓度与实测浓度的线性相关系数r≧0.9950；(4)本发明提供的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，所需标本量少(3μl血清即可)，且基本不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素等影响；当血红蛋白、甘油三酯、胆红素分别高至8.5g/l、8.0mmol/l和140μmol/l时，对hdl-c测定无明显影响。附图说明图1为高密度脂蛋白胆固醇标准曲线；图2为本发明高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒线性范围。具体实施方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。测试条件与方法：仪器：日立7080全自动生化分析仪参数：操作步骤：实施例1本实施例的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：试剂r1包括：吐温-6010.0mmol/l、氯化镁5.0mmol/l、4-氨基安替比林0.2mmol/l、缓冲液50.0mmol/l和叔丁基-4-羟基苯甲醚0.1g/l；试剂r2包括：胆固醇酯酶0.2ku/l、胆固醇氧化酶1.0ku/l、过氧化物酶5.0ku/l、脱氧胆酸钠40.0mmol/l、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠1.0mmol/l、氯化镁5.0mmol/l和ph值为7.0的磷酸盐缓冲液50.0mmol/l。实施例2本实施例的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：试剂r1包括：吐温-6030.0mmol/l、氯化镁15.0mmol/l、4-氨基安替比林2.0mmol/l、缓冲液150.0mmol/l和叔丁基-4-羟基苯甲醚0.7g/l；试剂r2包括：胆固醇酯酶3.0ku/l、胆固醇氧化酶5.0ku/l、过氧化物酶15.0ku/l、脱氧胆酸钠70.0mmol/l、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠5.0mmol/l、氯化镁15.0mmol/l和ph值为7.0的磷酸盐缓冲液150.0mmol/l。实施例3本实施例的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：试剂r1包括：span-6015.0mmol/l、氯化镁6.0mmol/l、4-氨基安替比林0.3mmol/l、ph值为7.0的硼酸盐缓冲液70.0mmol/l和叔丁基-4-羟基苯甲醚0.2g/l；试剂r2包括：胆固醇酯酶0.5ku/l、胆固醇氧化酶2.0ku/l、过氧化物酶7.0ku/l、脱氧胆酸钠45.0mmol/l、苯酚2.0mmol/l、氯化镁6.0mmol/l和ph值为7.0的硼酸盐缓冲液70.0mmol/l。实施例4本实施例的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：试剂r1包括：span-6025.0mmol/l、氯化镁10.0mmol/l、4-氨基安替比林1.5mmol/l、ph值为7.0的硼酸盐缓冲液120.0mmol/l和叔丁基-4-羟基苯甲醚0.6g/l；试剂r2包括：胆固醇酯酶2.5ku/l、胆固醇氧化酶4.5ku/l、过氧化物酶12.0ku/l、脱氧胆酸钠65.0mmol/l、苯酚4.0mmol/l、氯化镁10.0mmol/l和ph值为7.0的硼酸盐缓冲液120.0mmol/l。实施例5本实施例的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：试剂r1包括：鲸蜡醇聚醚-2318.0mmol/l、氯化镁7.0mmol/l、4-氨基安替比林0.5mmol/l、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液80.0mmol/l和叔丁基-4-羟基苯甲醚0.3g/l；试剂r2包括：胆固醇酯酶0.8ku/l、胆固醇氧化酶2.5ku/l、过氧化物酶9.0ku/l、脱氧胆酸钠50.0mmol/l、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸2.5mmol/l、氯化镁7.5mmol/l和ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液80.0mmol/l。实施例6本实施例的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：试剂r1包括：鲸蜡醇聚醚-2323.0mmol/l、氯化镁9.0mmol/l、4-氨基安替比林1.0mmol/l、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液100.0mmol/l和叔丁基-4-羟基苯甲醚0.5g/l；试剂r2包括：胆固醇酯酶1.5ku/l、胆固醇氧化酶3.5ku/l、过氧化物酶11.0ku/l、脱氧胆酸钠62.0mmol/l、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸3.5mmol/l、氯化镁9.0mmol/l和ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液100.0mmol/l。实施例7本实施例的高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：试剂1包括：鲸蜡醇聚醚-2322.5mmol/l、氯化镁8.0mmol/l、4-氨基安替比林0.6mmol/l、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液90mmol/l和叔丁基-4-羟基苯甲醚0.4g/l；试剂r2包括：2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸3.0mmol/l、胆固醇酯酶1.0ku/l、胆固醇氧化酶3.0ku/l、过氧化物酶10.0ku/l、脱氧胆酸钠56.0mmol/l、氯化镁8.0mmol/l和ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液90mmol/l。对比例1中国专利cn108627510a公开试剂盒。对比例2与实施例1相比，试剂r1中不含叔丁基-4-羟基苯甲醚。对比例3与实施例1相比，试剂r1中叔丁基-4-羟基苯甲醚浓度为0.05g/l。对比例4与实施例1相比，试剂r1中叔丁基-4-羟基苯甲醚浓度为0.8g/l。对比例5与实施例3相比，试剂r1中不含叔丁基-4-羟基苯甲醚。实验例1高密度脂蛋白胆固醇标准曲线采用高密度脂蛋白胆固醇标准品，浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mmol/l，以实施例7为例，按照上述测定步骤得到高密度脂蛋白胆固醇标准曲线(如图1所示)。其中，标准品的吸光度变化值δa(a标准-a空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度为横坐标，标准曲线方程：y＝0.194x+0.0221，r2＝0.9963。实验例2高密度脂蛋白胆固醇试剂盒线性范围的测试使用生理盐水分别配制浓度为3.0、6.0、9.0、12.0、13.0mmol/l的高密度脂蛋白胆固醇标准品，分别用实施例和对比例测定hdl-c含量，结果如表1所示：表1试剂盒线性范围理论值mmol/l3.006.009.0012.0013.00对比例12.905.808.4011.4011.90对比例22.705.808.8011.9012.50对比例32.605.908.5011.7012.10对比例42.805.808.6011.8012.20对比例52.706.308.7011.9012.60实施例12.905.708.9011.8012.70实施例23.305.809.3012.3012.80实施例33.306.209.2012.2013.30实施例43.206.309.3012.3013.20实施例53.106.209.2012.2013.10实施例63.106.109.1012.1013.20实施例73.006.009.2012.1013.10实施例均值3.136.049.1712.1413.06结果表明：在0-13.00mmol/l浓度范围内，本发明试剂盒的测试值能够达到理论值且二者相关性较好(图2)。而对比例1在样本浓度为9.0mmol/l时，测试结果低于理论值，不能满足要求。由此可见本试剂盒的线性范围较广且准确度较高。实验例3高密度脂蛋白胆固醇试剂盒准确度的测试使用本发明试剂盒测定临床样本的hdl-c含量(每例测定3次，计算平均值m)，将超速离心法测得的hdl-c含量作为评价该试剂盒的准确度的标准，计算相对偏差。如表2所示，本试剂盒通过添加叔丁基-4-羟基苯甲醚，与超速离心法测得结果的相对偏差均小于5％，使得hdl-c含量测试结果更加准确；而未添加叔丁基-4-羟基苯甲醚的对比例所得结果均与超速离心法的结果偏差较大。表2试剂盒准确度对比实验例4干扰实验在正常人血清中各自添加一定量的血红蛋白、甘油三酯和胆红素，同时加入等体积的去离子水作为无干扰物血清，使用实施例1-7的高密度脂蛋白胆固醇试剂盒，同时测定这些样本的浓度。以干扰程度为5％为测定系统对干扰物的最高忍受限，血清中血红蛋白8g/l以下、甘油三酯8.0mmol/l以下和胆红素140μmol/l以下，不影响高密度脂蛋白胆固醇试剂盒。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12