一种卵巢癌的诊断标志物及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及癌症的诊断/分级/分期和预后的领域，更具体来说，本发明涉及卵巢癌的领域。本发明还涉及了包括生物标志物表达的卵巢癌诊断、分级、分期和预后领域，并且还提供了相关的分析试剂、诊断模型、测试试剂盒和临床分析。

背景技术：

卵巢癌多发于围绝经期的女性，约有60％～70％的患者发现疾病时已经进展为iii－iv期或已发生腹部转移。由于患者早期症状不明显，通常在晚期才会表现出腹痛、腹胀、腹部包块、消化系统症状以及肿瘤压迫等症状和体征，因此大部分卵巢癌患者在发病中晚期才能得到诊断。尽管卵巢癌的手术治疗技术以及放化疗手段不断进展，但疾病的5年生产率仍低至30％，且预后差。

目前最常用早期诊断方式包括经阴道彩色多普勒超声、血清ca125等检查方法。然而临床实践表明，以上方法尚存在局限性:b超诊断卵巢癌的准确性较低，难以发现微小肿瘤，且受操作者主观因素影响较大；血清ca125检查特异性及敏感性较低。

进入21世纪以来，随着分子生物学的发展，陆续有多种关于卵巢癌的诊断标志物被开发，如2016年dayyanif等的一项系统性回顾，纳入了5篇文献、1975个研究对象，分析结果表明ca125诊断卵巢癌的敏感性和特异性分别为0.796(95％ci:0.663～0.885)和0.825(95％ci:0.662～0.919)。然而ca125检测在早期卵巢癌患者的诊断中表现欠佳，且受月经及妊娠等因素的影响较大；。美国食品药品管理局(foodanddrugadministration，fda)已经批准将he4和ca125用于卵巢癌的检测。现主要通过elisa技术作为he4的检测手段。dayyanif等的一项研究表明，血清he4用于检测卵巢癌的敏感性和特异性分别为0.817(95％ci:0683～0.902)和0.851(95％ci:0.716～0.928)；simoni等设计了一种双抗体夹心酶联免疫吸附试验用以检测血液中共刺激分子b7同源体4(b7-h4)的水平，发现卵巢癌患者血液b7-h4水平明显增高，b7-h4和ca125联合诊断卵巢癌敏感性和特异性可分别达到65％和97％，高于ca125单独诊断；另外还有研究表明，甲壳质酶蛋-40((ykl-40)在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌中均有较高的表达，并且在肿瘤的发生、发展中起到重要的作用；resnickke等通过检测28例浆液性卵巢癌患者的血清标本和15例正常对照组的血清标本，发现卵巢癌患者血清中mir-21、mir-29b、mir-92、mir-93和mir-126水平较高，其中mir-21、mir-92和mir-93在ca125升高前即有显著的上调，表明这三种microrna可用于卵巢癌的早期诊断；另外，还有研究表明多个非编码长链rna也在卵巢癌中有异常表达，如多种lncrna都在卵巢癌中表现出了失调，研究显示，对比健康组织，卵巢肿瘤组织中有多个lncrna上调，如anril、ab073614、bcyrn1、ccat1、fali等。

近期的研究则显示组合型标记物及基于血清标志物建立的卵巢癌风险评估模型，能增加其特异性和敏感性，从而提高卵巢癌的早期诊断率，因此我们在以后的研究中，也应更加关注多种标志物的组合检验及更有效的评估模型。同时，ca-125也并不适合在人群中进行大规模筛查，所以我们需要寻找更加敏感以及信息更丰富的生物标志物。

现有技术中曾研究过肌纤蛋白(myocilinilin)与青光眼相关，在长期的地塞米松治疗的患者中，其出现了高表达，且有研究表明其参与了wnt信号通路，且可以调控细胞的增殖，但是并未有确切的证据表明所述的myocilinilin与卵巢的关系。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于诊治卵巢癌标志物，具体的，所述的标志物为myocilin基因或其编码的产物。

在一个具体的实施例中，所述的myocilin基因的序列包含如seqidno:1所示，或者包含与seqidno:1所示的基因具有90％以上同源性的基因；在另外一个具体的实施例中，所述myocilin基因的编码产物为myocilin蛋白，其具体的氨基酸序列包含seqidno:2所示的多肽序列，或者包含与seqidno:2具有90％以上同源性的多肽序列。

本发明的另外一个目的是提供了检测myocilin基因或其表达产物在制备诊断卵巢癌的试剂中的应用。在一个具体的实施例中，所述的试剂包括：可以通过rt-pcr、实时定量pcr、qpcr、原位杂交或芯片检测myocilin基因的表达水平以诊断卵巢癌的产品；进一步，所述用rt-pcr诊断卵巢癌的试剂至少包括一对特异扩增myocilin基因的引物，优选的，所述用实时定量pcr诊断卵巢癌的试剂至少包括的一对特异扩增myocilin基因的引物和探针，其中引物如seqidno.3和seqidno.4所示；所述用实时定量pcr诊断卵巢癌的试剂至少包括一对特异扩增myocilin基因的引物；所述用dpcr诊断卵巢癌的试剂至少包括一对特异扩增myocilin基因的引物；所述用免疫检测诊断卵巢癌的试剂包括：与myocilin蛋白特异性结合的抗体，优选为多克隆抗体或单克隆抗体；所述用原位杂交诊断卵巢癌的试剂包括：与myocilin基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断卵巢癌的试剂包括：蛋白芯片和基因芯片，优选的，蛋白芯片包括与myocilin蛋白特异性结合的抗体，优选的，抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；基因芯片包括与myocilin基因的核酸序列杂交的探针。

进一步的，本发明中针对myocilin基因的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率；优选的，所述的探针原位杂交的探针序列如seqidno:5所示。

本发明的另外一个方面是提供一种可以检测myocilin基因或其表达产物表达量的试剂。在一个具体的实施例中，所述试剂包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测myocilin基因转录水平的针对myocilin基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的myocilin蛋白的特异性抗体。

在一个具体的实施例中，所述myocilin蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述myocilin蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与myocilin蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组dna技术合成；所述的特异性抗体是单克隆抗体，所述的抗体特异性接合myocilin的抗原表位为seqidno:6所示。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了myocilin基因在卵巢癌的发生发展中起着重要的作用，通过检测受试者卵巢组织中myocilin的表达水平，可以判断受试者是否患有卵巢癌，从而指导临床医师给受试者提供个性化预防方案或者治疗方案，同时本发明的研究为揭示卵巢癌的发病机理提供了理论和实验依据。

附图说明

图1显示利用qpcr检测myocilin基因在卵巢癌组织中的表达情况；

图2显示利用western检测myocilin蛋白在正常卵巢(图2a)及卵巢癌组织(图2b)中的表达情况。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1样本准备

1、样品收集

收集各8例正常卵巢组织和卵巢癌组织样本，手术切除30min内液氮保存。上述所有标本的取得均通过医院组织伦理委员会的同意。

2、rna样品的制备

上述获得的组织剪碎后投入液氮中并研磨至粉末状，按照试剂盒中的说明书提取分离rna。具体如下：

组织提取釆用液氮研磨法，将组织在液氮下用研钵研杵捣碎研磨，待液氮挥发后，加试剂，充分研磨直至试剂由结冰状态变为澄清液体，立即移至离心管中，加入氯仿，彻底振荡混匀后静置15min，4℃12000rpm离心15min，将上层水相移至另一1.5ml离心管中，加500ul异丙醇，振荡混匀后静置10min，4℃12000rpm离心弃上清，加入1ml70％乙醇，振荡片刻，4℃7500rpm离心5min，加入100μl0.1％depcddh2o。

3、逆转录

采用随机引物和作为逆转录引物进行逆转录反应；反应体系如表所示：

混匀后，逆转录反应条件为：37℃45min，85℃5min，4℃保存。

实施例2qpcr测序检测myocilin在癌症组织和正常组织中的差异表达

(1)引物设计

根据genebank中myocilin基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

gapdh的引物序列：

正向引物：5’-ggcgctgagtacgtcgtgga-3’(seqidno.7)

反向引物：5’-gtggtgcaggaggcattgctgat-3’(seqidno.8)

myocilin的引物序列：

正向引物：5’-tgaagtccgagctaactgaa-3’(seqidno.3)，

反向引物：5’-catccgtgccaactgtgtcg-3’(seqidno.4).

以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

(2)按照表1配制pcr反应体系：

其中，sybrgreen聚合酶链式反应体系购自invitrogen公司。

表2pcr反应体系

(3)pcr反应条件：95℃10min，(95℃30s，60℃60s)×40个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

(4)、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

(5)、结果

结果如图1所示，与正常卵巢组织相比，myocilin基因在卵巢癌组织中下调，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例3单克隆抗体的制备

结合文献并应用dnastar软件,对myocilin蛋白序列的抗原性、亲水性及表面结构可能性进行分析,选择抗原性高,亲水性强,表面可能性大的16个氨基酸左右的肽段作为免疫肤段：dtvgtdvrqvfeydlic(命名为myo-ag，seqidno:6),序列对应于蛋白的289-304位的氨基酸,末端的半耽氨酸是人为加上的,以提供游离巯基与载体蛋白偶联。委托杭州中肤生物有限公司进行免疫肽段的合成及偶联,并提供完整的质检报告,并与核酸数据库比对以确定其特异性。

(1)抗原制备

a)由公司合成能够表达上述多肽的原核表达质粒pet-28a(+)，质粒命名为pet-myo-ag；

b)将质粒转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，经卡那青霉素抗性筛选，挑取单菌落进行pcr鉴定，筛选出阳性克隆细胞即为含重组质粒pet-myo-ag的工程菌。

c)表达纯化重组抗原蛋白——重组质粒pet-myo-ag在e.colibl21(de3)中的表达和纯化：将含有重组质粒pet-myo-ag的e.colibl21(de3)单菌落接种于5ml含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃下200r/min震荡培养9～10h，将5ml菌液加入500ml含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，1：100扩大培养2h，至od600约为0.6。向菌液中加入终浓度为0.6mmol/l的iptg，16℃震荡培养过夜。离心收集过夜诱导的菌体，lysisbuffer重悬，冰浴30min后超声破碎15min，离心收集上清。用ni-nta纯化上清液中的重组groel蛋白，先用含有20mmol/l咪唑的洗脱液洗去杂质，再用含200mmol/l咪唑的洗脱液洗脱重组蛋白。

(2)动物免疫balb/c小鼠免疫

第1天经眼静脉采集免疫前小鼠血清作为阴性对照。起始免疫抗原重组蛋白20μg与等体积的弗氏完全佐剂混合,采用注射器法使抗原和佐剂充分乳化。对小鼠进行腹腔多点皮下注射。第14天加强免疫抗原用量为初始免疫量的,与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化,采用腹腔多点注射。第21天眼静脉取血,间接方法检测抗体滴度。第28天加强免疫直到产生满意的免疫效果。冲击免疫，在融合前三天进行一次免疫。

(3)细胞融合

无菌条件下取免疫后的小鼠脾脏,放入平皿中用不完全培养基冲洗脾脏组织用两只镊子剥离脾脏包膜并将脾脏组织镊碎,使细胞尽可能多地游离加入更多的不完全培养基,以利于过滤用目不锈钢丝网,过滤脾细胞。过滤前先从下面湿润网,将细胞虑入50ml融合管将生长状态好,处于对数生长期的sp2/0细胞与脾细胞混合,比例为1:10

以分子量为1500的peg为介导进行融合,离心后用hat培养基重悬细胞,并用该含有细胞的hat培养基铺孔板,每孔2滴。置于37℃,5％co2培养箱中培养。融合后第3天用hat培养基半量换液,第五天、第七天分别半量换液一次。两周后换ht培养基。

(4)单克隆抗体筛选

观察杂交瘤细胞的生长情况,当克隆生长至孔底面积的1/3-1/2时,取上清,用间接方法进行检测,筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养,五次后,克隆化细胞抗体阳性率为100％。将阳性克隆细胞进行进一步扩大培养。杂交瘤细胞经体外连续传代3月以上,反复冻存,复苏,定期收集上清,用筛选抗体的方法测定上清中的抗体,直至细胞系能稳定分泌单克隆抗体。

(5)单克隆抗体制备

选用12周龄以上的小鼠,腹腔注射液体石蜡,一周后收集生长状态良好的单克隆杂交瘤细胞,每只小鼠腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞。7-10天后收集腹水，等体积的腹水与生理盐水混合后，利用饱和硫酸铵沉淀法沉淀，去上清后沉淀用生理盐水重悬溶解，再此加入饱和硫酸铵至33％,弃上清，用生理盐水重悬溶解沉淀，装入透析袋，透析，aktaproteina层析柱层析纯化后备用。

实施例4免疫组化检测卵巢癌中myocilin蛋白的表达

组织为取自浙江省肿瘤医院的活检或手术标本，卵巢癌标本共109例,正常卵巢组织8例，每一例标本的组织学类型均经病理证实。

(1)利用envision加强免疫组织化学法进行染色，所述的方法是本领域技术人员所公知的技术，主要包括脱蜡水化，利用3％的过氧化氢甲醇阻断内源性的过氧化物酶，利用柠檬酸盐溶液中微波处理对抗原进行修复，血清封闭后，利用实施例3制备的单克隆抗体进行免疫反应，第二天后添加二抗后室温孵育，利用新配制的dab显色液进行显色，苏木素复染细胞核，二甲苯透明后封片。读片结果见图2。

(2)免疫组化评分

阳性细胞病理评分等级0分(阴性)

1分(≤30％)

2分(30-70％)

3分(≥70％)

染色强度分级评分

0分阴性(-)

1分弱阳性(+)

2分中度阳性(++)

3分强阳性(+++)

将阳性细胞百分比评分与染色强度评分相加,总分<2为阴性,2-3为弱阳性,4中度阳性,5-6强阳性。

对上述病理的统计结果见表3。

通过本发明发现，myocilin基因及其表达产物在正常卵巢组织中具有显著的高表达，是良好的潜在的卵巢癌诊断标志物，可以与ca-125等标志物共同作为卵巢癌诊断标志物，提高卵巢癌的诊断特异性和灵敏性。

上述的基因序列和蛋白序列仅是发明人的实验所使用的，而本发明的技术贡献在于发现了myocilin与卵巢癌的关系，任何与此相关的技术方案均涵盖于本发明之内。

序列表

<110>浙江省肿瘤医院

<120>一种卵巢癌的诊断标志物及其应用

<130>cn-cn-2019-0114-1

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1515

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

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