外泌体分离方法、免疫磁珠和试剂盒与流程

本发明涉及化学和医学领域。具体而言，本发明涉及一种外泌体分离方法、免疫磁珠和试剂盒。本发明还涉及一种纳米磁珠、所述纳米磁珠的制备方法，所述纳米磁珠在医学领域如免疫检测中的用途，例如在外泌体分离中的用途，以及包含所述纳米磁珠的试剂盒。

背景技术：

外泌体是一种大多数细胞都会分泌的，且分泌到细胞外的膜囊泡。除了在细胞通讯方面发挥着重要作用，越来越多的证据表明外泌体的一些细胞内容物，包括蛋白质、microrna、mrna、融合基因等，与人类恶性肿瘤的发病有着密切的关系；此外，外泌体在疾病的诊断，治疗，预后等方面发挥着重要的作用。为此，人们渴望找到一种简单、有效、高纯度以及可以自动化的方法来进行外泌体的分离。其中基于磁珠的亲和捕获外泌体技术由于简单的操作过程、易于清洗、分离以及自动化尤其受到人们的重视。参见例如oksvold，m.p.，a.neurauter，andk.w.pedersen，magneticbead-basedisolationofexosomes.methodsmolbiol，2015.1218：p.465-81.pedersen，k.w.，b.kierulf，anda.neurauter，specificandgenericisolationofextracellularvesicleswithmagneticbeads.methodsmolbiol，2017.1660：p.65-87。

目前用磁珠亲和捕获外泌体所用磁珠大都是参见例如公开号cn106289926a、cn107893051a、cn108085338a、cn106967747a、us20130273544a1、ep3289361a4、wo2015112382a1、wo2018033929a1等等。这些磁珠都是在上修饰了特异性抗体，再用这些修饰了特异性抗体的去特异性捕获外泌体。的合成技术参见thermofisherscientific等公司的专利或专利申请公开号us8658733b2，us20080139399a1，us20070299249a1，ep1693387b1，wo2010125170a1，us6984702b2以及us6787233b1。

现有的磁珠亲和捕获外泌体的方法需要消耗大量的抗体，抗体昂贵的价格导致磁珠法的成本非常高。以dynabeads^tmmyone^tmcarboxylicacid，货号65012为例，制造商说明书指出其抗体与的质量比在0.1∶1左右。其它一些磁珠上面包被抗体用来进行液体活检的文献，例如cn106279421a、cn106432504a、cn106366197a、cn106279422a、cn106366196a、cn106366195a、cn106381286a等，公开的抗体与磁珠的质量比也在(0.01-1)∶1之间。抗体与磁珠相对较高的比例使得这些方法需要消耗大量的抗体，提升了外泌体捕获磁珠的制备成本。

专利文献例如cn106279421a、cn106432504a、cn106366197a、cn106279422a、cn106366196a、cn106366195a、cn106381286a中公开了如下制备方法：

s1磁性纳米簇的制备；

s1.1二价铁盐在氨水的作用下被还原成fe3o4纳米粒子；

s1.2将油酸加入fe3o4纳米粒子，并通过高温高压反应生成磁性纳米簇；

s2氨基修饰的磁性微球的制备；

s2.1在上述磁性纳米簇中加入氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂，反应1～3天；

s3肼基修饰的a部分的制备；

s3.1将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为10～50倍的sanh(对-丙腙基吡啶甲酸n-羟基琥珀酰亚胺酯，cas：362522-50-7)进行肼基修饰；

s4醛基修饰的b部分的制备；

s4.1将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为5～20倍的sfb(4-甲酰苯甲酸n-琥珀酰亚胺酯，cas：60444-78-2)，进行醛基修饰。

s5肿瘤细胞的捕获。

上述方法免疫磁珠合成麻烦。

还有一些文献例如cn106289926a、cn107893051a等公开了如下方法：

s1基于的外泌体捕获磁珠的制备

s1.1采用链霉亲和素修饰的

s1.2在上述中加入一定体积的抗体进行孵育；

s2外泌体的亲和捕获

s3将血清稀释后进行外泌体捕获。

上述方法使用的磁珠为进口的

因此，本领域亟待开发出更简单的免疫磁珠制备方法，新的外泌体捕获方法和具有自主知识产权的高效、低成本的外泌体捕获试剂盒。

技术实现要素：

发明人通过研究，已经发现一种新的改进的外泌体捕获方法、一种新的改进的免疫磁珠以及相关用途和试剂盒。在一些实施方案中，已经发现本发明的方法和/或产品消耗的抗体量显著降低。在一些实施方案中，已经发现本发明的方法和/或产品外泌体的捕获效率显著提高。在一些实施方案中，已经发现本发明的方法和/或产品具有更广泛的适用范围，例如能够用于在未浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体。

在一些实施方案中，本发明提供一种分离外泌体的方法，所述方法包括将来自受试者的含有外泌体的样品与纳米磁珠接触，从而从所述样品中分离外泌体，其中所述纳米磁珠的尺寸范围在30-600nm的范围，例如30nm，40nm，50nm，60nm，70nm，80nm，90nm，100nm，110nm，120nm，130nm，140nm，150nm，160nm，170nm，180nm，190nm，200nm，210nm，220nm，230nm，240nm，250nm，260nm，270nm，280nm，290nm，300nm，310hm，320nm，330nm，340nm，350nm，360nm，370nm，380nm，390nm，400nm，410nm，420nm，430nm，440nm，450nm，460nm，470nm，480nm，490nm，500nm，510nm，520nm，530nm，540nm，550nm，560nm，570nm，580nm，590nm，600nm，或任何其间的范围，例如30-150nm的范围。在一些实施方案中，已经发现在相同磁珠总质量的前提下，通过调整用于外泌体分离的磁珠的大小能够显著提高外泌体的捕获效率和/或能够提供广泛适用的外泌体捕获方法。在一些实施方案中，本发明的方法中采用的磁珠的尺寸优选与外泌体尺寸近似或相同。在一些实施方案中，本发明的方法中采用的磁珠的尺寸优选在30-600nm的范围，例如32nm，45nm，58nm，62nm，76nm，88nm，95nm，106nm，112nm，125nm，136nm，143nm，155nm，166nm，178nm，184nm，195nm，205nm，216nm，228nm，235nm，246nm，258nm，262nm，275nm，286nm，295nm，306nm，313nm，322nm，332nm，345nm，358nm，365nm，376nm，382nm，393nm，404nm，416nm，428nm，432nm，445nm，456nm，466nm，478nm，483nm，495nm，502nm，512nm，524nm，535nm，546nm，558nm，569nm，572nm，581nm，592nm，600nm，或任何其间的范围，例如30-150nm的范围。

在一些实施方案中，所述分离方法中采用的纳米磁珠具备下述一种或多种性质：1)具备表面修饰的巯基，例如通过巯基功能化的交联剂引入的表面修饰的巯基；2)具有超顺磁性；3)由8-12nm的fe3o4纳米粒子团聚而成；4)具有偶联物，例如抗体，例如外泌体表面蛋白的抗体，例如外泌体表面蛋白cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4中的一种或多种的抗体，5)具有偶联物，例如接头，例如接头蛋白，例如亲和素，例如与外泌体选择性结合的接头，例如与外泌体表面蛋白或修饰的外泌体表面蛋白选择性结合的接头，例如与外泌体表面蛋白cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4或修饰的上述蛋白中的一种或多种选择性结合的接头，所述修饰可以是例如通过所述接头的配体修饰的外泌体表面蛋白，例如通过生物素修饰的外泌体表面蛋白，6)磁珠加入量为每毫升样品1x10⁹-2x10¹²个磁珠，例如1x10⁹个磁珠，1.5x10⁹个磁珠，5x10⁹个磁珠，8x10⁹个磁珠，1x10¹⁰个磁珠，1.5x10¹⁰个磁珠，5x10¹⁰个磁珠，8x10¹⁰个磁珠，1x10¹¹个磁珠，1.5x10¹¹个磁珠，5x10¹¹个磁珠，8x10¹¹个磁珠，1x10¹²个磁珠，1.5x10¹²个磁珠，2x10¹²个磁珠或任何其间的范围，例如1.5x10¹¹-1.5x10¹²之间；和/或7)抗体或接头与磁珠的质量比在(0.00005-0.005)∶1之间，例如0.00005∶1，0.0005∶1，0.005∶1或任何其间的范围。在一些实施方案中，已经发现通过采用具有表面修饰的巯基的磁珠，例如通过巯基功能化的交联剂引入的表面修饰的巯基的磁珠，在磁珠用量为每毫升样品1x10⁹-2x10¹²个时，能够使得使用的抗体量显著降低，和/或使得外泌体的捕获效率显著提高。在一些实施方案中，本发明的方法中采用的磁珠优选具有超顺磁性。在一些实施方案中，本发明的方法中采用的磁珠可以由8-12nm的fe3o4纳米粒子团聚而成。在一些实施方案中，本发明的方法中采用的磁珠可以具有偶联物。在一些实施方案中，本发明的方法中采用的磁珠的偶联物没有特别限制。在一些实施方案中，所述偶联物或缀合物可以是例如抗体，例如外泌体表面蛋白的抗体，例如外泌体表面蛋白cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4中的一种或多种的抗体。在一些实施方案中，通过偶联的抗体，本发明的磁珠选择性结合样品中的外泌体，从而实现外泌体的分离。在一些实施方案中，所述偶联物可以是例如接头。可以用于本发明方法的接头没有特别限制，只要其能够将外泌体特异性连接到本发明的磁珠上即可。在一些实施方案中，所述接头可以是例如接头蛋白，例如亲和素。在一些实施方案中，通过接头蛋白将外泌体特异性结合到本发明的磁珠上。在一些实施方案中，所述接头可以是例如与外泌体选择性结合的接头，例如与外泌体表面蛋白或修饰的外泌体表面蛋白选择性结合的接头，例如与外泌体表面蛋白cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4或修饰的上述蛋白中的一种或多种选择性结合的接头。在一些实施方案中，所述修饰可以是例如通过所述接头的配体修饰的外泌体表面蛋白。在一些实施方案中，如果本发明的磁珠采用接头如亲和素修饰，则可以对外泌体表面蛋白采用所述接头的配体即生物素修饰。因此，在一些实施方案中，例如可以通过生物素修饰的外泌体表面蛋白。在一些实施方案中，磁珠修饰可以通过抗体与交联剂如4-马来酰亚胺基丁酸-n-琥珀酰亚胺酯作用与磁珠偶联得到的。在一些实施方案中，抗体的修饰可以通过接头如亲和素在交联剂如4-马来酰亚胺基丁酸-n-琥珀酰亚胺酯的作用下与磁珠偶联得到。在一些实施方案中，外泌体表面蛋白可以经生物素亲和素反应与磁珠上的亲和素反应连接。

在一些实施方案中，本发明的方法中采用的磁珠的加入量没有特别限制。在一些实施方案中，本发明的方法中采用的磁珠加入量可以为每毫升样品1x10⁹-2x10¹²个磁珠，例如1x10⁹个磁珠，1.5x10⁹个磁珠，5x10⁹个磁珠，8x10⁹个磁珠，1x10¹⁰个磁珠，1.5x10¹⁰个磁珠，5x10¹⁰个磁珠，8x10¹⁰个磁珠，1x10¹¹个磁珠，1.5x10¹¹个磁珠，5x10¹¹个磁珠，8x10¹¹个磁珠，1x10¹²个磁珠，1.5x10¹²个磁珠，2x10¹²个磁珠或任何其间的范围，例如1.5x10¹¹-1.5x10¹²之间。在一些实施方案中，已经发现优选的上述磁珠加入量能够实现外泌体的充分分离，提高了外泌体的分离效率。在一些实施方案中，本发明的方法中抗体或接头与磁珠的质量比没有特别限制，但是优选本发明的方法采用常规方法降低的抗体或接头与磁珠的质量比。在一些实施方案中，本发明的方法中抗体或接头与磁珠的质量比在(0.00005-0.005)∶1之间，例如0.00005∶1，0.0005∶1，0.005∶1或任何其间的范围。

在一些实施方案中，本发明的方法中分离外泌体的样品来源没有特别限制。在一些实施方案中，所述样品来自体液，例如来自人受试者的体液，例如来自患者如肿瘤患者的体液，例如来自血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊液、唾液、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、乳汁、眼泪、腹水，例如来自胸膜、心包、腹膜、腹部或其他体腔的流体，例如来自细胞培养物，例如来自细胞上清，例如经过浓缩/预富集外泌体的细胞上清，例如未经过浓缩处理的细胞上清。在一些实施方案中，已经发现本发明的方法和/或产品具有更广泛的适用范围，例如能够用于在未浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括下述一个或多个特征：在所述样品中加入封闭剂，如牛血清白蛋白，人血清白蛋白，氨基配体，如甘氨酸等；孵育以捕获外泌体，例如在37℃孵育1-4小时，或室温孵育2-6小时，或4℃孵育过夜。

在一些实施方案中，本发明提供一种纳米磁珠，所述纳米磁珠具备下述一种或多种性质：1)尺寸范围在30-600nm的范围，例如30nm，40nm，50nm，60nm，70nm，80nm，90nm，100nm，110nm，120nm，130nm，140nm，150nm，160nm，170nm，180nm，190nm，200nm，210nm，220nm，230nm，240nm，250nm，260nm，270nm，280nm，290nm，300nm，310nm，320nm，330nm，340nm，350nm，360nm，370nm，380nm，390nm，400nm，410nm，420nm，430nm，440nm，450nm，460nm，470nm，480nm，490nm，500nm，510nm，520nm，530nm，540nm，550nm，560nm，570nm，580nm，590nm，600nm，或任何其间的范围，例如30-150nm的范围；2)具有超顺磁性；3)由8-12nm的fe3o4纳米粒子团聚而成；4)具有偶联物，如抗体，例如外泌体表面蛋白的抗体，例如外泌体表面蛋白cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4中的一种或多种的抗体，5)具有偶联物，例如接头，例如接头蛋白，例如亲和素，例如与外泌体选择性结合的接头，例如与外泌体表面蛋白或修饰的外泌体表面蛋白选择性结合的接头，例如与外泌体表面蛋白cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4或修饰的上述蛋白中的一种或多种选择性结合的接头，所述修饰可以是例如通过所述接头的配体修饰的外泌体表面蛋白，例如通过生物素修饰的外泌体表面蛋白，6)相对于待检测的样品而言，磁珠量为每毫升样品1x10⁹-2x10¹²个磁珠，例如1x10⁹个磁珠，1.5x10⁹个磁珠，5x10⁹个磁珠，8x10⁹个磁珠，1x10¹⁰个磁珠，1.5x10¹⁰个磁珠，5x10¹⁰个磁珠，8x10¹⁰个磁珠，1x10¹¹个磁珠，1.5x10¹¹个磁珠，5x10¹¹个磁珠，8x10¹¹个磁珠，1x10¹²个磁珠，1.5x10¹²个磁珠，2x10¹²个磁珠或任何其间的范围，例如1.5x10¹¹-1.5x10¹²之间；7)所述抗体磁珠的质量比在(0.00005-0.005)∶1之间，例如0.00005∶1，0.0005∶1，0.005∶1或任何其间的范围；和/或8)具备表面修饰的巯基，例如通过巯基功能化的交联剂引入的表面修饰的巯基。在一些实施方案中，本发明提供的纳米磁珠优选特别适合用于本发明的分离外泌体的方法中。在一些实施方案中，已经发现本发明的纳米磁珠消耗的抗体量显著降低。在一些实施方案中，已经发现本发明的纳米磁珠外泌体的捕获效率显著提高。在一些实施方案中，已经发现本发明的纳米磁珠具有更广泛的适用范围，例如能够用于在未浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体。

在一些实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包含本文描述的纳米磁珠。在一些实施方案中，所述试剂盒尤其适用于本发明的分离外泌体的方法中。在一些实施方案中，本发明提供用于外泌体的分离的试剂盒，其包含本文描述的纳米磁珠。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含其它适当的成分，例如用于外泌体分离的成分。在一些实施方案中，本发明的试剂盒可以进一步包含封闭剂，如牛血清白蛋白，人血清白蛋白，氨基配体，如甘氨酸等。在一些实施方案中，已经发现本发明的试剂盒消耗的抗体量显著降低。在一些实施方案中，已经发现本发明的试剂盒外泌体的捕获效率显著提高。在一些实施方案中，已经发现本发明的试剂盒具有更广泛的适用范围，例如能够用于在未浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体。

在一些实施方案中，本发明提供制备纳米磁珠的方法，所述方法包括使三价铁盐、巯基功能化的交联剂，配合还原反应进行的稳定剂，和还原剂在容器中高温、高压反应，从而获得纳米磁珠。在一些实施方案中，本发明的纳米磁珠是表面修饰巯基的纳米磁珠。在一些实施方案中，本发明的方法通过功能化的交联剂提供表面修饰巯基的纳米磁珠。在一些实施方案中，本发明的方法是一步法，即通过一步法即可完成对于磁珠的合成及表面修饰。在一些实施方案中，本发明通过一步完成对于磁珠的合成及表面修饰，提供了高效和简便的免疫磁珠合成方法。在一些实施方案中，通过本发明的方法制备的磁珠尤其适合用于本发明的外泌体分离方法和试剂盒中。在一些实施方案中，已经发现本发明的纳米磁珠消耗的抗体量显著降低。在一些实施方案中，已经发现本发明的纳米磁珠外泌体的捕获效率显著提高。在一些实施方案中，已经发现本发明的纳米磁珠具有更广泛的适用范围，例如能够用于在未浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体。

在一些实施方案中，本发明提供一种一步法制备表面修饰巯基的纳米磁珠的方法。在一些实施方案中，可以用于本发明的方法的铁盐没有特别限制。在一些实施方案中，所述三价铁盐可以包括氯化铁，硫酸铁，醋酸铁，硝酸铁，磷酸铁，柠檬酸三铁，焦磷酸铁等。在一些实施方案中，可以采用适当的交联剂制备本发明的磁珠。在一些实施方案中，所述巯基功能化的交联剂可以包括甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯和/或聚(乙二醇)2-巯基乙基醚乙酸等。在一些实施方案中，本发明的方法中可以采用的稳定剂没有特别限制，例如可以采用的配合还原反应进行的稳定剂包括乙酸钠、柠檬酸三钠、尿素等。在一些实施方案中，本发明的方法中可以采用的还原剂没有特别限制，例如可以采用的还原剂包括乙二醇等。在一些实施方案中，本发明的方法中可以采用的表面活性剂没有特别限制，例如可以采用的表面活性剂包括聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮等。

在一些实施方案中，本发明的方法可以在适当的反应温度进行，例如反应温度可以在150～240℃。在一些实施方案中，本发明的方法可以进行适当的时间，例如反应的时间可以在7-72小时。

在一些实施方案中，本发明的方法中的反应成分可以适当的选择。例如在一些实施方案中，所述三价铁盐，巯基功能化的交联剂，配合还原反应进行的稳定剂以及表面活性剂的质量比为1∶(0-0.1)∶(1.4-3.5)∶(0.4-1.3)，例如1∶(0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1或任何其间的范围)∶(1.4，1.5，1.8，2.0，2.2，2.4，2.6，2.8，3.0，3.2，3.4，3.5或任何其间的范围)∶(0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3或任何其间的范围)。

在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括将所述纳米磁珠与偶联物偶联的步骤。在一些实施方案中，本发明的方法中采用的磁珠的偶联物没有特别限制。在一些实施方案中，所述偶联物或缀合物可以是例如抗体，例如外泌体表面蛋白的抗体，例如外泌体表面蛋白cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4中的一种或多种的抗体。在一些实施方案中，通过偶联的抗体，本发明的磁珠选择性结合样品中的外泌体，从而实现外泌体的分离。在一些实施方案中，所述偶联物可以是例如接头。可以用于本发明方法的接头没有特别限制，只要其能够将外泌体特异性连接到本发明的磁珠上即可。在一些实施方案中，所述接头可以是例如接头蛋白，例如亲和素。在一些实施方案中，通过接头蛋白将外泌体特异性结合到本发明的磁珠上。在一些实施方案中，所述接头可以是例如与外泌体选择性结合的接头，例如与外泌体表面蛋白或修饰的外泌体表面蛋白选择性结合的接头，例如与外泌体表面蛋白cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4或修饰的上述蛋白中的一种或多种选择性结合的接头。在一些实施方案中，所述修饰可以是例如通过所述接头的配体修饰的外泌体表面蛋白。在一些实施方案中，如果本发明的磁珠采用接头如亲和素修饰，则可以对外泌体表面蛋白采用所述接头的配体即生物素修饰。因此，在一些实施方案中，例如可以通过生物素修饰的外泌体表面蛋白。在一些实施方案中，本发明的方法中采用的磁珠的加入量没有特别限制。在一些实施方案中，本发明的方法中采用的磁珠加入量可以为每毫升样品1x10⁹-2x10¹²个磁珠，例如1x10⁹个磁珠，1.5x10⁹个磁珠，5x10⁹个磁珠，8x10⁹个磁珠，1x10¹⁰个磁珠，1.5x10¹⁰个磁珠，5x10¹⁰个磁珠，8x10¹⁰个磁珠，1x10¹¹个磁珠，1.5x10¹¹个磁珠，5x10¹¹个磁珠，8x10¹¹个磁珠，1x10¹²个磁珠，1.5x10¹²个磁珠，2x10¹²个磁珠或任何其间的范围，例如1.5x10¹¹-1.5x10¹²之间。在一些实施方案中，已经发现优选的上述磁珠加入量能够实现外泌体的充分分离，提高了外泌体的分离效率。在一些实施方案中，本发明的方法中抗体或接头与磁珠的质量比没有特别限制，但是优选本发明的方法采用常规方法降低的抗体或接头与磁珠的质量比。在一些实施方案中，本发明的方法中抗体或接头与磁珠的质量比在(0.00005-0.005)∶1之间，例如0.00005∶1，0.0005∶1，0.005∶1或任何其间的范围。

在一些实施方案中，本发明的方法制备的磁珠具备下述一种或多种性质：1)尺寸范围在30-600nm的范围，例如30nm，40nm，50nm，60nm，70nm，80nm，90nm，100nm，110nm，120nm，130nm，140nm，150nm，160nm，170nm，180nm，190nm，200nm，210nm，220nm，230nm，240nm，250nm，260nm，270nm，280nm，290nm，300nm，310nm，320nm，330nm，340nm，350nm，360nm，370nm，380nm，390nm，400nm，410nm，420nm，430nm，440nm，450nm，460nm，470nm，480nm，490nm，500nm，510nm，520nm，530nm，540nm，550nm，560nm，570nm，580nm，590nm，600nm，或任何其间的范围，例如30-150nm的范围；2)具有超顺磁性；3)由8-12nm的fe3o4纳米粒子团聚而成；4)具有偶联物，如抗体，例如外泌体表面蛋白的抗体，例如外泌体表面蛋白cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4中的一种或多种的抗体，5)具有偶联物，例如接头，例如接头蛋白，例如亲和素，例如与外泌体选择性结合的接头，例如与外泌体表面蛋白或修饰的外泌体表面蛋白选择性结合的接头，例如与外泌体表面蛋白cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4或修饰的上述蛋白中的一种或多种选择性结合的接头，所述修饰可以是例如通过所述接头的配体修饰的外泌体表面蛋白，例如通过生物素修饰的外泌体表面蛋白，6)相对于待检测的样品而言，磁珠量为每毫升样品1x10⁹-2x10¹²个磁珠，例如1x10⁹个磁珠，1.5x10⁹个磁珠，5x10⁹个磁珠，8x10⁹个磁珠，1x10¹⁰个磁珠，1.5x10¹⁰个磁珠，5x10¹⁰个磁珠，8x10¹⁰个磁珠，1x10¹¹个磁珠，1.5x10¹¹个磁珠，5x10¹¹个磁珠，8x10¹¹个磁珠，1x10¹²个磁珠，1.5x10¹²个磁珠，2x10¹²个磁珠或任何其间的范围，例如1.5x10¹¹-1.5x10¹²之间；7)所述抗体磁珠的质量比在(0.00005-0.005)∶1之间，例如0.00005∶1，0.0005∶1，0.005∶1或任何其间的范围；和/或8)具备表面修饰的巯基，例如通过巯基功能化的交联剂引入的表面修饰的巯基。

发明人已经发现能够显著改进外泌体捕获方法和产品，尤其能够显著改进现有常规方法和磁珠亲和捕获试剂盒，例如基于的外泌体亲和捕获方法。已经发现能够显著提高外泌体的捕获效率。在一些实施方案中，通过ddpcr以及管家基因gapdh对外泌体捕获数进行定量，已经发现本发明的方法和产品与基于的外泌体捕获方法相比，在细胞上清中，本发明消耗0.5μg抗体对于外泌体的捕获效率比27倍抗体消耗量的(消耗13.5μg抗体)的捕获效率还要高的多；对于血浆来说，本发明消耗0.5μg抗体对于外泌体的捕获效率比9倍抗体消耗量的(消耗4.5μg抗体)的捕获效率还要高。与常规外泌体捕获试剂盒相比，本发明在细胞上清以及血浆中对于外泌体都具有更高的捕获效率。

发明人发现现有方法如cn106279421a、cn106432504a、cn106366197a、cn106279422a、cn106366196a、cn106366195a、cn106381286a等描述的磁珠合成过程相当繁琐，需经过fe3o4纳米粒子的还原、高温高压生成磁性纳米簇、在氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂等作用下生成氨基化的二氧化硅包被的磁性微球等过程。发明人研究发现能够通过一步法实现磁珠的合成和修饰。例如，在一些实施方案中，本发明中实现了磁性微球通过一步法即可合成。在一些实施方案中，所述方法可以采用六水合三氯化铁，乙酸钠，聚乙二醇，甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯、乙二醇在高温高压下反应完成。已经发现现有技术中的表面修饰以及抗体包被同样很麻烦。例如在磁珠氨基化修饰后还需要进一步修饰肼基以及醛基的抗体才能完成修饰。相比之下，本发明中仅需将所制备的磁珠与反应试剂如羟基琥珀酰亚胺酸反应15min后再加入抗体或亲和素进行孵化即可。

因此，在一些实施方案中，本发明提供一种低抗体磁珠比例包被的，高磁珠含量外泌体捕获磁珠。

在一些实施方案中，优选的，所述磁珠通过被迫裂解法一步即可制备。

在一些实施方案中，优选的，所述磁珠的尺寸与外泌体尺寸相同，为30-150nm。

在一些实施方案中，优选的，所述磁珠为超顺磁性。

在一些实施方案中，优选的，所述磁珠由8-12nm的fe3o4纳米粒子团聚而成。

在一些实施方案中，优选的，所述抗体为外泌体常用蛋白的抗体，包括但不限于cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4等蛋白质的一种或多种的抗体。

在一些实施方案中，优选的，所述低抗体磁珠比例指的是抗体与磁珠的质量比在(0.00005-0.005)∶1之间；

在一些实施方案中，优选的，所述高磁珠含量指的是在每毫升细胞上清/血浆中磁珠个数在1x10⁹-1x10¹²之间

在一些实施方案中，本发明提供了一种外泌体捕获磁珠的制备方法，其步骤可以包括：s1：磁珠的制备；s2：抗体的修饰。

在一些实施方案中，所述步骤s1中的磁珠是通过被迫裂解法，经过一步反应制备而成的。

在一些实施方案中，所述步骤s1中的磁珠优选是通过如下方法制备得到的：

1)在高温反应釜中加入三价铁盐、交联剂如甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯，稳定剂如乙酸钠，表面活性剂如聚乙二醇，还原剂如乙二醇，150～240℃加热反应7-72小时，即可得到所属磁珠。

在一些实施方案中，所述步骤s2中抗体的修饰是通过抗体在4-马来酰亚胺基丁酸-n-琥珀酰亚胺酯的作用下与磁珠偶联得到的。

在一些实施方案中，所述步骤s2中抗体的修饰还可以通过亲和素在4-马来酰亚胺基丁酸-n-琥珀酰亚胺酯的作用下与磁珠偶联并经生物素亲和素反应与磁珠上的亲和素反应连接得到的。

在一些实施方案中，本发明提供了一种用于在细胞上清中分离外泌体的试剂盒。

在一些实施方案中，优选的，所述细胞上清包括经过浓缩/预富集外泌体的细胞上清以及未经过浓缩处理的细胞上清。

在一些实施方案中，优选的，所述在细胞上清中分离外泌体的试剂盒中包括上述外泌体捕获磁珠、bsa(牛血清白蛋白)或hsa(人血清白蛋白)以及氨基配体，如甘氨酸等。

在一些实施方案中，在浓缩/预富集处理的细胞上清中进行外泌体分离可以包括如下步骤：

s1在浓缩/预富集处理的细胞上清中加入1-10倍体积的0.11％-0.2％的bsa溶液；

s2在所述步骤s1的体系中加入0.001％-0.1％的鼠igg；

s3在所述步骤s2的体系中加入每毫升细胞上清1x10⁹-1x10¹²个磁珠；

s4在所述步骤s2中抗体与磁珠的质量比在(0.00005-0.005)∶1之间；

s5将所述步骤s4的体系在37℃孵育1-4小时，或室温孵育2-6小时，或4℃孵育过夜；外泌体捕获完毕。

在一些实施方案中，在未经过外泌体浓缩/预富集处理的细胞上清中进行外泌体分离可以包括如下步骤：

s1在未经过浓缩处理的细胞上清中加入相对于细胞上清质量分数为0.1％-2％的bsa；

s2在所述步骤s1的体系中加入0.001％-0.1％的鼠igg；

s3在所述步骤s2的体系中加入每毫升细胞上清1x10⁹-1x10¹²个磁珠；

s4在所述步骤s2中抗体与磁珠的质量比在(0.00005-0.005)∶1之间；

s5将所述步骤s4的体系在37℃孵育1-4小时，或室温孵育2-6小时，或4℃孵育过夜；外泌体捕获完毕。

在一些实施方案中，本发明提供了一种用于在血浆中分离外泌体的试剂盒。

在一些实施方案中，优选的，所述在血浆中分离外泌体的试剂盒中包括上述外泌体捕获磁珠、bsa或hsa以及鼠igg。

在一些实施方案中，在血浆中进行外泌体分离可以包括如下步骤：

s1在血浆中加入1-5倍体积的0.12％-0.2％的bsa或hsa溶液；

s2在所述步骤s1的体系中加入0.001％-0.1％的鼠igg；

s3在所述步骤s2的体系中加入每毫升血浆1x10⁹-1x10¹²个磁珠；

s4在所述步骤s2中抗体与磁珠的质量比在(0.00005-0.005)∶1之间；

s5将所述步骤s4的体系在37℃孵育1-4小时，或室温孵育2-6小时，或4℃孵育过夜；外泌体捕获完毕。

在一些实施方案中，本发明中偶联的抗体为外泌体常用蛋白的抗体，所述蛋白包括但不限于cd9，cd63，cd81，cd44，cd31，rab5b，epcam，tsg101，hsp90，hsp70，anxa5，flot1，icam1，alix，gm130，icam-1，snap，mhci/ii，hla-g，integrins，claudins，tim4等蛋白质的一种或多种。

在一些实施方案中，本发明的方法和产品中偶联的抗体还包括先在磁珠外修饰亲和素再通过生物素亲和素反应连接上述抗体的方法。

在一些实施方案中，本发明的方法和产品中的bsa可以替换为hsa。

在一些实施方案中，本发明的方法和产品中的所述细胞上清可替换描述为细胞培养基。

在一些实施方案中，本发明的方法和产品的应用范围包括但不限于细胞上清，血浆，血清，尿液，乳汁，脑脊液，肿瘤腹水，唾液样品。

在一些实施方案中，本发明的方法和产品具有下述一种或多种优势：

1)通过一步法即可完成对于磁珠的合成及表面修饰，免疫磁珠合成方便；

2)磁珠具有与外泌体相同的尺寸为30-150nm；

3)包被磁珠所需抗体少，抗体与磁珠的质量比在(0.00005-0.005)∶1之间；在细胞上清和血浆中，本发明磁珠分别仅需消耗的1/27和1/9抗体就能取得比更高的外泌体捕获效率；在细胞上清和血浆中，本发明磁珠与消耗同样的抗体量，在细胞上清和血浆中对于外泌体的捕获效率分别可以达到28倍以及2.4倍。因此，本发明的方法和磁珠可以有效地减少抗体消耗，同时提升外泌体捕获效率，是低成本，高效率的外泌体捕获方法和产品；

4)通过一步法合成的磁珠配合极低的抗体用量来降低成本；

5)外泌体捕获试剂盒不仅可以应用于浓缩、预富集的细胞上清和血浆，还适用于未经过浓缩、预富集的细胞上清。本发明的方法和产品具有有比常规外泌体捕获试剂盒更高的外泌体捕获效率，以及更大的使用范围(在未浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体)。

附图说明

图1显示合成磁珠的sem表征。

图2显示合成磁珠的磁滞回线。

图3显示反应成分比例的改变对制备磁珠以及偶联蛋白质的影响；其中图3a显示巯基交联剂、naac、peg和六水合氯化铁比例，其中+表示符合要求的磁珠；-表示不符合要求的磁珠，表格中出现的所有数字均为该物质与六水合氯化铁的质量比；图3b显示甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯的加入比例对于磁珠偶联蛋白质效果的影响。

图4显示用不同方法合成的磁珠对蛋白质的偶联效率(用相对于本磁珠的相对荧光强度表示)。

图5显示h3122细胞上清中本发明磁珠与对于外泌体捕获效率的对比(ddpcr阳性液滴数定量)。

图6显示消耗同样的0.5μg抗体，本发明磁珠与对于细胞上清中的外泌体捕获效率的对比(ddpcrgapdh拷贝数定量)。

图7显示血浆中本发明磁珠与消耗不同抗体量的对于外泌体捕获效率的对比(ddpcr阳性液滴数定量)。

图8显示消耗同样0.5μg抗体，本发明磁珠与对于血浆中的外泌体捕获效率的对比(ddpcrgapdh拷贝数定量)。

图9显示本发明中具有不同抗体磁珠包被比例的磁珠与磁珠对于细胞上清中外泌体捕获效率的对比(ddpcr阳性液滴数定量)。

图10显示不同粒径，相同抗体含量、磁珠总质量的磁珠对于血浆中外泌体捕获效率的对比(ddpcrgapdh拷贝数定量)。

图11显示相同抗体含量，相同磁珠粒径，本发明中不同磁珠数量对于细胞上清中外泌体捕获效率的对比(ddpcr阳性液滴数定量)。

图12显示相同抗体含量本发明中不同磁珠数量对于血浆中外泌体捕获效率的对比(ddpcr阳性液滴数定量)。

图13显示在细胞上清和血浆中用本发明磁珠以及对照细胞上清外泌体捕获试剂盒(exosome-humancd63isolation/detectionreagent，invitrogen^tm)和对照血浆外泌体捕获试剂盒(exocap^tm，jsrlifesciences)捕获外泌体后，进行的wb表征。

图14显示在细胞上清中本发明磁珠与对照外泌体捕获试剂盒(exosome-humancd63isolation/detectionreagent，invitrogen^tm)对于外泌体捕获效率的对比(ddpcrgapdh拷贝数定量)。

图15显示在血浆中本发明磁珠与对照外泌体捕获试剂盒(exocap^tm，jsrlifesciences)对于外泌体捕获效率的对比(ddpcrgapdh拷贝数定量)。

图16显示本发明外泌体磁珠在预浓缩/未预浓缩的细胞上清中捕获外泌体(ddpcrgapdh拷贝数定量)。

图17显示在血浆中本发明磁珠利用亲和素抗体体系偶联抗体后与对照外泌体捕获试剂盒(exocap^tm，jsrlifesciences)对于外泌体捕获效率的对比(ddpcrgapdh拷贝数定量)。

具体实施方式

本发明与现有技术相比，具有以下一种或多种优点及突出效果：本发明通过一步法即可完成对于磁珠的合成及表面修饰，免疫磁珠合成方便。

在细胞上清和血浆中，本发明磁珠分别仅需消耗的1/27和1/9抗体就能取得比更高的外泌体捕获效率；在细胞上清和血浆中，本发明磁珠与消耗同样的抗体量，在细胞上清和血浆中对于外泌体的捕获效率分别可以达到28倍以及2.4倍。因此，本发明磁珠可以有效地减少抗体消耗，同时提升外泌体捕获效率。是低成本，高效率的外泌体捕获试剂盒。

本发明外泌体捕获试剂盒具有有比对照外泌体捕获试剂盒更高的外泌体捕获效率，以及更大的使用范围(在未浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体)。

本发明合成磁珠的方法简单，与现有技术(如cn106279421a、cn106432504a、cn106366197a、cn106279422a、cn106366196a、cn106366195a、cn106381286a等)的繁琐方法有显著区别。本发明中的磁珠合成更为简单，经过一步反应既可获得。合成的磁珠的一个非限制性实例如下：

实例1磁珠的合成，抗体包被及封闭(图1，图2)

在100ml乙二醇中加入3.12g六水合三氯化铁、0.23g甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯，4.2g乙酸钠，2.4g聚乙二醇，搅拌均匀后在马弗炉中220℃反应8h，得到磁珠。

磁珠用乙醇清洗后，加入0.01μmol/ml4-马来酰亚胺基丁酸-n-琥珀酰亚胺酯反应15min，洗净后按照磁珠与cd63抗体(用其他外泌体表面特异性抗体经同样的过程得到类似产品)比为1∶0.0005的比例加入抗体，孵育过夜完成磁珠抗体的包被。

包被好的磁珠用5％(w/v)的血清白蛋白封闭过夜，外泌体捕获磁珠制备完成。

合成的磁珠的扫描电子显微镜表征如图1所示，合成磁珠的磁滞回线如图2所示：

从图1可以看出本发明中的磁珠尺寸在30-150nm之间(和外泌体尺寸恰好相同)。从图2中的磁滞回线可以看出本发明中的磁珠的饱和磁强度为60emu/g，且为超顺磁性。因此本发明外泌体捕获磁珠合成方便简单。

实例2确定合成磁珠过程中各试剂的添加范围(图3a)

在100ml乙二醇中加入3.12g六水合三氯化铁，再按一定的比例分别加入甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯，乙酸钠以及聚乙二醇，搅拌均匀后在高压反应釜中以220℃反应8h，对得到的物质进行表征判断，其中磁珠发生严重团聚或不成磁珠或尺寸不在30-600nm范围内判定为不合格(-)；形成30-600nm范围内的单分散磁珠判定为合格(+)，结果如图3a。

从图3a中可以看出当三价铁盐，巯基功能化的交联剂，配合还原反应进行的稳定剂以及表面活性剂的质量比为1∶(0-0.1)∶(1.4-3.5)∶(0.4-1.3)时可以合成出符合要求的磁珠。

实例3确定巯基功能化交联剂的最适加入量(图3b)

在100ml乙二醇中加入3.12g六水合三氯化铁、一定质量的甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯，4.2g乙酸钠，2.4g聚乙二醇，搅拌均匀后在马弗炉中220℃反应8h，得到磁珠。

磁珠用乙醇清洗后，加入0.01μmol/ml4-马来酰亚胺基丁酸-n-琥珀酰亚胺酯反应15min，洗净后将磁珠放入10μm荧光染料cy5标记的bsa中，室温下旋转孵育2h。pbst洗两次，pbs洗一次，利用荧光显微镜检测荧光，依据荧光强度判断蛋白质的包被效率。结果如图所示。

从图3b中可以看出当甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯相对于六水合三氯化铁的质量比为0.7∶1时即可达到最佳的捕获效率。

实例4合成磁珠的其他替代方案(图4)

在100ml乙二醇中加入3.12g硫酸铁、0.23g的甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯，4.2g乙酸钠，2.4g聚乙二醇，搅拌均匀后在马弗炉中220℃反应8h，得到磁珠①。

用醋酸铁，硝酸铁，磷酸铁，柠檬酸三铁，焦磷酸铁等替代硫酸铁经同样的过程制得类似产品。

在100ml乙二醇中加入3.12g六水合三氯化铁、0.23g的聚(乙二醇)2-巯基乙基醚乙酸，4.2g乙酸钠，2.4g聚乙二醇，搅拌均匀后在马弗炉中220℃反应8h，得到磁珠②。

在100ml乙二醇中加入3.12g硫酸铁、0.23g的甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯，4.2g乙酸钠，2.4g聚乙烯吡咯烷酮，搅拌均匀后在马弗炉中220℃反应8h，得到磁珠③。

在100ml乙二醇中加入3.12g六水合三氯化铁、一定质量的甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯，4.2g乙酸钠，0.72g柠檬酸三钠，2.4g聚乙二醇，搅拌均匀后在马弗炉中200℃反应10h，得到磁珠④。用尿素替代柠檬酸三钠经同样的过程制得类似产品。

判断磁珠是否符合要求后，磁珠用乙醇清洗后，加入0.01μmol/ml4-马来酰亚胺基丁酸-n-琥珀酰亚胺酯反应15min，洗净后将磁珠放入10μm荧光染料cy5标记的bsa中，室温下旋转孵育2h。pbst洗两次，pbs洗一次，利用荧光显微镜检测荧光，并依据荧光强度判断制备的磁珠对于蛋白质的偶联效率，结果如图4所示。

结果显示，以上几种替代方案都可以制备出符合要求的磁珠，且都能包被上抗体，但按照本方案，以六水合三氯化铁、甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯，乙酸钠，聚乙二醇为反应物效果最佳(图中显示为原始磁珠)。综上所述，本发明通过一步法即可完成对于磁珠的合成及表面修饰，免疫磁珠合成快捷、方便。

(2)现有的磁珠亲和捕获外泌体的方法需要消耗大量的抗体，抗体昂贵的价格导致磁珠法的成本非常高。以dynabeads^tmmyone^tmcarboxylicacid，货号65012为例，官方给的说明书其抗体与的质量比在1∶10左右。而对于一些自己合成的磁珠上面包被抗体用来进行液体活检(cn106279421a、cn106432504a、cn106366197a、cn106279422a、cn106366196a、cn106366195a、cn106381286a等)，其抗体与磁珠的质量比也在(0.01-1)∶1之间，但对于本发明而言，抗体与磁珠的质量比在(0.00005-0.005)∶1，极大的节省了抗体的用量，极大的降低了外泌体亲和磁珠的制备成本，但却不会降低外泌体捕获效率。

操作方法如下：

实例5在浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体(本发明磁珠)并用于外泌体定量检测。(图5，图6)

在h3122细胞(一种肺癌细胞株)密度约80％的培养皿中加入无外泌体的培养基，培养3天后收集培养基，300g离心10min，取上清，2000g离心30min取上清；将上清通过0.22μm的滤膜过滤后得到无细胞、凋亡小体的细胞上清。将20ml上述培养基通过30kda的超滤管超滤浓缩至130μl，得到外泌体预富集的培养基。

在外泌体浓缩/预富集处理的130μl细胞上清中加入6倍体积的0.12％(w/v)的bsa溶液、0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后加入0.5μgcd63(一种外泌体表面特异性抗体)含量的本发明中的外泌体捕获磁珠(cd63与磁珠质量比为0.0005∶1)，4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

将捕获了外泌体的磁珠用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlgapdh引物，1μl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因gapdh定量，并用管家基因gapdh的含量反应外泌体的含量。

实例6在浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体(图5，图6)

与本发明磁珠包被了同一批cd63抗体(用其他外泌体表面特异性抗体经同样的过程得到类似产品)，包被方法按照的官方说明书。

在h3122细胞(一种肺癌细胞株)密度约80％的培养皿中加入无外泌体的培养基，培养3天后收集培养基，300g离心10min，取上清，2000g离心30min取上清；将上清通过0.22μm的滤膜过滤后得到无细胞、凋亡小体的细胞上清。将20ml上述培养基通过30kda的超滤管超滤浓缩至130μl，得到外泌体预富集的培养基。

在两份等量外泌体浓缩/预富集处理的130μl细胞上清中分别加入6倍体积的0.12％(w/v)的bsa溶液、0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后分别加入4.5μg、13.5μgcd63抗体(用其他外泌体表面特异性抗体经同样的过程得到类似产品)含量的4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

将捕获了外泌体的用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlgapdh引物，1μl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因gapdh定量，并用管家基因gapdh的阳性液滴数反应外泌体的含量。

结合实例5以及实例6，并依据图5和图6可以看出在细胞上清中本发明外泌体捕获试剂盒具有比高得多的外泌体捕获效率：消耗同等抗体，本发明外泌体捕获试剂盒对于细胞上清中的外泌体捕获效率可以达到的28倍左右；消耗本发明外泌体捕获试剂盒27倍量的抗体后，其对细胞上清外泌体的捕获效率仍然比不上本发明外泌体捕获试剂盒。

实例7在血浆中捕获外泌体(本发明磁珠)(图7，图8)

将血浆12000g离心10min取上清，在400μl血浆中加入1000μl的0.14％的bsa溶液，再加入0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后加入0.5μgcd63含量的本发明中的外泌体捕获磁珠(cd63与磁珠质量比为0.0005：1)，4℃旋转孵育过夜。

将捕获了外泌体的磁珠用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlgapdh引物，1μl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因gapdh定量，并用管家基因gapdh的阳性液滴数反应外泌体的含量。

实例8在血浆中捕获外泌体(图7，图8)

将血浆12000g离心10min取上清，在在400μl血浆中加入1000μl的0.14％的bsa溶液，再加入0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后加入0.5μg、1.5μg、4.5μgcd63抗体(用其他外泌体表面特异性抗体经同样的过程得到类似产品)含量的4℃旋转孵育过夜。

将捕获了外泌体的用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlgapdh引物，1μl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(n0dutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因gapdh定量，并用管家基因gapdh的阳性液滴数反应外泌体的含量。

结合实例7以及实例8，并依据图7和图8可以看出在血浆中本发明外泌体捕获试剂盒具有比高得多的外泌体捕获效率：消耗同等抗体，本发明外泌体捕获试剂盒对于血浆中的外泌体捕获效率可以达到的240％左右；消耗本发明外泌体捕获试剂盒9倍量的抗体后其对血浆泌体的捕获效率仍然比不上本发明外泌体捕获试剂盒。

实例9探索本发明磁珠在保证外泌体捕获效率的前提下的抗体磁珠包被比例(图9)

在h3122细胞(一种肺癌细胞株)密度约80％的培养皿中加入无外泌体的培养基，培养3天后收集培养基，300g离心10min，取上清，2000g离心30min取上清；将上清通过0.22μm的滤膜过滤后得到无细胞、凋亡小体的细胞上清。将20ml上述培养基通过30kda的超滤管超滤浓缩至130μl，得到外泌体预富集的培养基。

在外泌体浓缩/预富集处理的130μl细胞上清中加入6倍体积的0.12％(w/v)的bsa溶液、0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后加入0.01-1μgcd63(一种外泌体表面特异性抗体)含量的本发明中的外泌体捕获磁珠(磁珠质量为0.2mg，cd63与磁珠质量比为(0.00005-0.005)∶1)，4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

在两份等量外泌体浓缩/预富集处理的130μl细胞上清中分别加入6倍体积的0.12％(w/v)的bsa溶液、0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后分别加入20μgcd63抗体(用其他外泌体表面特异性抗体经同样的过程得到类似产品)含量的(质量为0.2mg，cd63与质量比为0.1∶1)，4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

将捕获了外泌体的磁珠用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlgapdh引物，1μl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因gapdh定量，并用管家基因gapdh的阳性液滴数反应外泌体的含量，结果如图9所示。

结果显示，本发明磁珠中抗体与磁珠的质量比在(0.00005-0.005)∶1之间时就能取得较好的外泌体捕获效果。其外泌体捕获效果优于抗体与磁珠的质量比为0.1∶1的极大程度的节省了抗体的用量，提高了外泌体的捕获效率。

实例10探索不同尺寸的磁珠对于外泌体捕获效率的影响(图10)

在100ml乙二醇中加入3.12g六水合三氯化铁、0.23g甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯，4.2g乙酸钠，2.4g聚乙二醇，搅拌均匀后在马弗炉中220℃反应8h，得到本发明中30-150nm的磁珠。

不同尺寸磁珠的合成方法如下：在100ml乙二醇中加入3.38g六水合三氯化铁、0.23g甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯-半胱氨酸乙酯，9g乙酸钠，2.5g聚乙二醇，搅拌均匀后在马弗炉中200℃反应8-72h，得到200-800nm的磁珠。其中可以通过控制反应时间调节磁珠的尺寸，例如，8h得到200nm的磁珠，72h得到800nm的磁珠。

磁珠用乙醇清洗后，加入0.01μmol/ml4-马来酰亚胺基丁酸-n-琥珀酰亚胺酯反应15min，洗净后按照磁珠与cd63抗体(用其他外泌体表面特异性抗体经同样的过程得到类似产品)比为1∶0.0005的比例加入抗体，孵育过夜完成磁珠抗体的包被。

包被好的磁珠用5％(w/v)的血清白蛋白封闭过夜，外泌体捕获磁珠制备完成。

将血浆12000g离心10min取上清，在400μl血浆中加入1000μl的0.14％的bsa溶液，再加入0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后加入0.5μgcd63含量的本发明中的外泌体捕获磁珠(磁珠质量均为0.2mg)，4℃旋转孵育过夜。

将捕获了外泌体的磁珠用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlgapdh引物，1μl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因gapdh定量，并用管家基因gapdh的浓度反应外泌体的含量，结果如图10所示。

结果显示，在相同抗体加入量，相同磁珠质量的情况下，在800-30nm的范围内，随着磁珠粒径的减小。免疫磁珠对于血浆外泌体的捕获效率逐渐提高，这可能是由于磁珠的数量n＝m/(4/3*∏r³ρ)，其中m为磁珠总质量，r为磁珠半径，ρ为磁珠密度。可以看出在m一定的情况下，磁珠数量与r³成反比。因此，相同质量下100nm磁珠的数量可以达到800nm的500倍以上，通过相同磁珠总质量的情况下本发明磁珠(更小的磁珠)通过更多的磁珠数量来提高外泌体的捕获效率。

实例11探索不同磁珠加入量对于外泌体捕获效率的影响(图11，图12)

在h3122细胞(一种肺癌细胞株)密度约80％的培养皿中加入无外泌体的培养基，培养3天后收集培养基，300g离心10min，取上清，2000g离心30min取上清；将上清通过0.22μm的滤膜过滤后得到无细胞、凋亡小体的细胞上清。将20ml上述培养基通过30kda的超滤管超滤浓缩至130μμl，得到外泌体预富集的培养基。

在外泌体浓缩/预富集处理的130μl细胞上清中加入6倍体积的0.12％(w/v)的bsa溶液、0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后加入0.5μgcd63(一种外泌体表面特异性抗体)含量的本发明中的外泌体捕获磁珠(加入磁珠数量为1x10⁶-1x10¹²个)，4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

将捕获了外泌体的磁珠用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlgapdh引物，1μl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因gapdh定量，并用管家基因gapdh的含量阳性液滴数反应外泌体的含量，结果如图11所示。

将血浆12000g离心10min取上清，在400μl血浆中加入1000μl的0.14％的bsa溶液，再加入0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后加入0.5μgcd63含量的本发明中的外泌体捕获磁珠(cd63与磁珠质量比为0.0005∶1)，4℃旋转孵育过夜。

将捕获了外泌体的磁珠用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlgapdh引物，1μμl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因gapdh定量，并用管家基因gapdh的阳性液滴数反应外泌体的含量，结构如图12所示。

从图11和图12中我们可以看出，对于细胞上清来说，当捕获磁珠的数量大于1x10⁹时，捕获磁珠对于细胞上清外泌体的捕获可以达到最大值；对于血浆来说当捕获磁珠的数量大于1x10¹¹时，捕获磁珠对于血浆外泌体的捕获可以达到最大值。这个结果与资料中(https：//www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/cell-analysis/exosomes/exosomes-webinar-q-and-a.html)报道的外泌体数量——细胞中外泌体数量在10⁹个/ml左右，血浆中10¹¹个/ml左右相符。

考虑到成本效益问题，每毫升样本中磁珠的推荐数量在1x10⁹-1x10¹²之间。

综上所述，在细胞上清和血浆中，本发明磁珠分别仅需消耗的1/27和1/9抗体就能取得比更高的外泌体捕获效率；在细胞上清和血浆中，本发明磁珠与消耗同样的抗体量，在细胞上清和血浆中对于外泌体的捕获效率分别可以达到28倍以及2.4倍。因此，本发明磁珠可以有效地减少抗体消耗，同时提升外泌体捕获效率。

(3)现有的磁珠亲和捕获外泌体试剂盒以及基于的外泌体亲和捕获方法对于外泌体的捕获效率不高。本发明具有比对照外泌体捕获试剂盒以及基于的外泌体亲和捕获方法具有更高的捕获效率(在本文描述实例中，在细胞上清中的对照外泌体捕获试剂盒为exosome-humancd63isolation/detectionreagent，invitrogen^tm；在血浆中的对照外泌体捕获试剂盒为exocap^tm，jsrlifesciences)。

操作方法如下：

实例12在浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体(本发明磁珠与对照外泌体捕获试剂盒)并用westernblot进行表征。(图13)

在h2228细胞(一种非小细胞肺癌细胞株)密度约80％的培养皿中加入无外泌体的培养基，培养3天后收集培养基，300g离心10min，取上清，2000g离心30min取上清；将上清通过0.22μm的滤膜过滤后得到无细胞、凋亡小体的细胞上清。将20ml上述培养基通过30kda的超滤管超滤浓缩至130μl，得到外泌体预富集的培养基。

本发明试剂盒处理方法：在浓缩/预富集处理的130μl细胞上清中加入6倍体积的0.12％(w/v)的bsa溶液、0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后加入0.5μgcd63含量的本发明中的外泌体捕获磁珠(cd63与磁珠质量比为0.0005∶1)，4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

对照外泌体捕获试剂盒处理方法：取100μl试剂盒中的外泌体捕获磁珠，用0.1％的bsa溶液洗3次，在等量外泌体浓缩/预富集处理的130μl细胞上清中分别加入70μl的0.1％的bsa溶液，4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

将捕获了外泌体的磁珠用pbst洗两次，pbs洗一次；加入40μl裂解液进行裂解，裂解30min后加入10μlloadingbuffer，95℃煮5min；磁分离后取14μl上清点样；80v电泳30min，120v电泳1h。

电泳结束后转膜，然后用5％(w/v)的奶粉的pbst溶液进行封闭，室温封闭1h；

按1∶1000的比例加入兔抗人epcam(上皮细胞粘附分子，一种肿瘤患者外泌体富含的蛋白)，4℃孵育过夜；

用wb(westernblot)洗液清洗3次后，用1∶10000的hrp标记的羊抗兔igg室温孵育1h；

用wb(westernblot)洗液清洗3次后，加入显影液进行显影。结果如图13所示。

结果显示，在细胞上清中，本发明外泌体捕获试剂盒提取的外泌体经wb检测时可以显示出明显的条带，而在同等条件下对照外泌体试剂盒提取的外泌体经wb检测时明显的条带很淡。这从蛋白质的角度证明了本发明外泌体捕获试剂盒具有比对照外泌体试剂盒更高的外泌体捕获效率。

实例13在血浆中捕获外泌体(本发明磁珠与对照外泌体捕获试剂盒)并用westernblot进行表征。(图13)

本发明试剂盒处理方法：将血浆12000g离心10min取上清，在300μl血浆中加入1000μl的0.14％的bsa溶液，再加入0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后加入0.5μgcd63含量的本发明中的外泌体捕获磁珠(cd63与磁珠质量比为0.0005∶1)，4℃旋转孵育过夜。

对照外泌体捕获试剂盒处理方法：取500μl亲和素偶联的磁珠；磁分离，去上清；用1mlwashingbuffer(试剂盒提供)重悬；加入5μl(1μg/μl)biotin-cd63；室温旋转孵育1h；磁分离，去上清；用0.5mlwashingbuffer洗3次；用0.5mlwashingbuffer重悬备用；取100μl上述磁珠，磁分离弃上清；加入300μltreamentbuffer(试剂盒提供)，重悬；加入300μl血浆；室温旋转孵育过夜；孵育结束后磁分离，弃上清；加入1mlwashingbuffer重悬转移到新管子；磁分离，弃上清；用1mlwashingbuffer再洗一次；100μlwashingbuffer重悬待用。

将血浆12000g离心10min取上清；在上述磁珠中加入100μl血浆，4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

将捕获了外泌体的磁珠用pbst洗两次，pbs洗一次；加入40μl裂解液进行裂解，裂解30min后加入10μlloadingbuffer，95℃煮5min；磁分离后取14μl上清点样；80v电泳30min，120v电泳1h。

电泳结束后转膜，然后用5％(w/v)的奶粉的pbst溶液进行封闭，室温封闭1h；

按1∶1000的比例加入兔抗人epcam(上皮细胞粘附分子，一种肿瘤患者外泌体富含的蛋白)，4℃孵育过夜；

用wb(westernblot)洗液清洗3次后，用1∶10000的hrp标记的羊抗兔igg室温孵育1h；

用wb(westernblot)洗液清洗3次后，加入显影液进行显影。结果如图13所示。

结果显示，在血浆中，本发明外泌体捕获试剂盒提取的外泌体经wb检测时可以显示出明显的条带，而在同等条件下对照外泌体试剂盒提取的外泌体经wb检测时未检测出条带。这从蛋白质的角度证明了本发明外泌体捕获试剂盒具有比对照外泌体试剂盒更高的外泌体捕获效率。

实例14在浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体(本发明磁珠与对照外泌体捕获试剂盒)并用ddpcr进行捕获效率的对比。(图14)

在h2228细胞(一种非小细胞肺癌细胞株)密度约80％的培养皿中加入无外泌体的培养基，培养3天后收集培养基，300g离心10min，取上清，2000g离心30min取上清；将上清通过0.22μm的滤膜过滤后得到无细胞、凋亡小体的细胞上清。将20ml上述培养基通过30kda的超滤管超滤浓缩至130μl，得到外泌体预富集的培养基。

本发明试剂盒处理方法：在浓缩/预富集处理的130μl细胞上清中加入6倍体积的0.12％(w/v)的bsa溶液、0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后加入0.5μgcd63含量的本发明中的外泌体捕获磁珠(cd63与磁珠质量比为0.0005∶1)，4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

对照外泌体捕获试剂盒处理方法：取100μl试剂盒中的外泌体捕获磁珠，用0.1％的bsa溶液洗3次，在等量外泌体浓缩/预富集处理的130μl细胞上清中分别加入70μl的0.1％的bsa溶液，4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

将捕获了外泌体的磁珠用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlgapdh引物，1μl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因gapdh定量，并用管家基因gapdh的浓度来反应外泌体的含量，结果如图14所示。

结果显示，本发明的外泌体捕获试剂盒在细胞上清中对于外泌体的捕获效果远好于对照外泌体捕获试剂盒。该实例从核酸角度证明了本发明的外泌体捕获试剂盒在细胞上清中具有比对照外泌体捕获试剂盒更高的外泌体捕获效率。

实例15在血浆中捕获外泌体(本发明磁珠与对照外泌体捕获试剂盒)并用ddpcr进行捕获效率的对比。(图15)

本发明试剂盒处理方法：将血浆12000g离心10min取上清，在300μl血浆中加入1000μl的0.14％的bsa溶液，再加入0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后加入0.5μgcd63含量的本发明中的外泌体捕获磁珠(cd63与磁珠质量比为0.0005：1)，4℃旋转孵育过夜。

对照外泌体捕获试剂盒处理方法：取500μl亲和素偶联的磁珠；磁分离，去上清；用1mlwashingbuffer(试剂盒提供)重悬；加入5μl(1μg/μl)biotin-cd63；室温旋转孵育1h；磁分离，去上清；用0.5mlwashingbuffer洗3次；用0.5mlwashingbuffer重悬备用；取250μl上述磁珠，磁分离弃上清；加入300μltreamentbuffer(试剂盒提供)，重悬；加入300μl血浆；室温旋转孵育过夜；孵育结束后磁分离，弃上清；加入1mlwashingbuffer重悬转移到新管子；磁分离，弃上清；用1mlwashingbuffer再洗一次；250μlwashingbuffer重悬待用。

将血浆12000g离心10min取上清；在上述磁珠中加入100μl血浆，4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

将捕获了外泌体的磁珠用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlgapdh引物，1μl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因gapdh定量，并用管家基因gapdh的浓度来反应外泌体的含量，结果如图15所示。

结果显示，本发明的外泌体捕获试剂盒在血浆中对于外泌体的捕获效果远好于对照血浆外泌体捕获试剂盒。

实例15在未浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体(本发明磁珠)并用于外泌体定量检测。(图16)

在h2228细胞(一种非小细胞肺癌细胞株)密度约80％的培养皿中加入无外泌体的培养基，培养3天后收集培养基，300g离心10min，取上清，2000g离心30min取上清；将上清通过0.22μm的滤膜过滤后得到无细胞、凋亡小体的细胞上清。

在20ml未浓缩/预富集处理的h2228细胞(一种非小细胞肺癌细胞株)上清中加入0.4gbsa溶液、0.4ng的鼠igg，混合均匀后加入0.5μgcd63含量的本发明中的外泌体捕获磁珠(cd63与磁珠质量比为0.0005∶1)，4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

将捕获了外泌体的磁珠用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlgapdh引物，1μl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因gapdh定量，并用管家基因gapdh的含量反应外泌体的含量。

结果显示，本发明磁珠不仅适用于在预富集的细胞上清中捕获外泌体，同样适用于在未预富集的细胞上清中捕获外泌体。

实例16利用本发明磁珠亲和素抗体磁珠在血浆中捕获外泌体并与市售试剂盒进行对比。(图17)

磁珠用乙醇清洗后，加入0.01μmol/ml4-马来酰亚胺基丁酸-n-琥珀酰亚胺酯反应15min，洗净后按照磁珠与亲和素比为1∶0.005的比例加入亲和素，孵育过夜完成磁珠抗体的包被。

包被好的磁珠用5％(w/v)的血清白蛋白封闭过夜，pbs洗净后按照1∶0.0005的比例加入生物素标记的cd63抗体(用其他外泌体表面特异性抗体经同样的过程得到类似产品)，孵育1h后用pbs洗净，外泌体捕获磁珠制备完成。

本发明试剂盒处理方法：将血浆12000g离心10min取上清，在300μl血浆中加入1000μl的0.14％的bsa溶液，再加入0.002％(w/v)的鼠igg，混合均匀后加入0.5μgcd63含量的本发明中的外泌体捕获磁珠(cd63与磁珠质量比为0.0005∶1)，4℃旋转孵育过夜。

对照外泌体捕获试剂盒处理方法：取500μl亲和素偶联的磁珠；磁分离，去上清；用1mlwashingbuffer(试剂盒提供)重悬；加入5μl(1μg/μl)biotin-cd63；室温旋转孵育1h；磁分离，去上清；用0.5mlwashingbuffer洗3次；用0.5mlwashingbuffer重悬备用；取250μl上述磁珠，磁分离弃上清；加入300μltreamentbuffer(试剂盒提供)，重悬；加入300μl血浆；室温旋转孵育过夜；孵育结束后磁分离，弃上清；加入1mlwashingbuffer重悬转移到新管子；磁分离，弃上清；用1mlwashingbuffer再洗一次；250μlwashingbuffer重悬待用。

将血浆12000g离心10min取上清；在上述磁珠中加入100μl血浆，4℃旋转孵育过夜，得到捕获了外泌体的磁珠。

将捕获了外泌体的磁珠用mirneasyserum/plasmaadvancedkit(qiagen的rna提取试剂盒)提取rna，再将rna逆转录成cdna，每个ddpcr孔中加入8μl逆转录得到的cdna，1μlgapdh引物，1μl无酶水，以及10μlddpcr^tmsupermixforprobes(n0dutp)。pcr扩增后，用bio-radqx200^tm进行外泌体中管家基因gapdh定量，并用管家基因gapdh的浓度来反应外泌体的含量，结果如图17所示。

结果显示，本发明的外泌体捕获试剂盒利用亲和素抗体在血浆中对于外泌体的捕获效果远好于对照血浆外泌体捕获试剂盒。

综上实例所述，从蛋白质和核酸两个角度证明了本发明外泌体捕获试剂盒在细胞上清以及血清中都有比对照外泌体捕获试剂盒更高的外泌体捕获效率，以及更大的使用范围(在未浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体)。综上(1)、(2)、(3)点所述，本发明通过一步法即可完成对于磁珠的合成及表面修饰，免疫磁珠合成方便。

不受特定理论限制，在本发明中，可以通过在更多巯基小磁珠上(例如，每毫升样品1x10⁹-2x10¹²个磁珠)修饰更少的抗体来捕获外泌体，由于样品中外泌体数量是有限的，因此更多的磁珠意味着每个磁珠捕获的外泌体数更少，从而避免了外泌体在磁珠上的空间位阻，提高了外泌体的捕获效率；同时也因为每个磁珠仅需捕获少量的外泌体，因此磁珠上的抗体包被浓度可以降低，从而节约抗体。因此，本发明提供了低抗体消耗，高外泌体捕获效率的技术方案。

在细胞上清和血浆中，本发明磁珠分别仅需消耗的1/27和1/9抗体就能取得比更高的外泌体捕获效率；在细胞上清和血浆中，本发明磁珠与消耗同样的抗体量，在细胞上清和血浆中对于外泌体的捕获效率分别可以达到28倍以及2.4倍。因此，本发明磁珠可以有效地减少抗体消耗，同时提升外泌体捕获效率。

本文从蛋白质和核酸两个角度证明了本发明外泌体捕获试剂盒在细胞上清以及血清中都有比对照外泌体捕获试剂盒更高的外泌体捕获效率，以及更大的使用范围(在未浓缩/预富集的细胞上清中捕获外泌体)。