一种食品中丙硫菌唑残留量的测定方法与流程

本发明属于农药残留量的测定技术领域，具体地，涉及一种食品中丙硫菌唑残留量的测定方法。

背景技术：

在水果、蔬菜、粮谷等农作物种植过程中，农田真菌细菌病害对农作物产量和品质产生重要影响。杀菌剂在农业生产中的使用，减少了因真菌细菌病害造成的农产品产量和品质的损失，得到可观的经济效益。但是随着人们对食品安全问题的关注，杀菌剂残留对人类健康的危害也倍受关注。如杀菌剂丙硫菌唑(prothioconazole)化学名2-(2-(1-氯环丙基)-3-(2-氯苯基)-2-羟丙基-1-2-二氢-3-1,2,4-三唑-3-硫代属于广谱三唑硫酮类杀菌剂。丙硫菌唑的作用机理是抑制真菌中甾醇的前体一一羊毛甾醇或24-亚甲基二氢芈毛醉l4位上的脱甲基化作用，即脱甲基化抑制剂(dmis)。不仅具有很好的内吸活性，优异的保护、治疗和铲除活性，且持效期长。通过大量的田间药效试验，结果表明丙硫菌唑对作物不仅具有良好的安全性，防病治病效果好，而且增产明显，同三唑类杀茵剂相比，丙硫菌唑具有更广谱的杀菌活性。丙硫菌唑主要用于防治禾谷类作物如小麦、大麦、油菜、花生、水稻和豆类作物等众多病害。几乎对所有麦类病害都有很好的防治效果，如小麦和大麦的白粉病、纹枯病、枯萎病、叶斑病、锈病、菌核病、网斑病、云纹病等。还能防治油莱和花生的土传病害，如菌核病，以及主要叶面病害，如灰霉病、黑斑病、褐斑病、黑胫病、菌核病和锈病等。美国、欧盟和日本等国家对丙硫菌唑均制定了残留限量标准，在水果、蔬菜、鱼、肉等多种食品中的最大残留限量0.01～0.5mg/kg。我国目前已有两家企业申请了该产品的登记证，预计明年将获得登记证，预计随着丙硫菌唑的推广和使用，建立食品中丙硫菌唑残留量的检测方法具有很重要的意义。

quechers方法作为新发展起来的样品前处理技术，是一种快速、简单、价廉、高效、稳定和安全(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe)的样品前处理方法。具有回收率高，精确度和准确度高,分析农药范围广，处理速度快，溶剂使用量少，操作简便，使用的玻璃器皿少等优点。目前国际广泛认可使用quechers方法有欧盟制定的en15662和美国官方分析化学师协会的aoac2007.01标准方法。上述2个方法稍有不同，但是原理相同，都包括提取、净化2个步骤：1.用乙腈或含1％乙酸的乙腈提取样品，通过加入缓冲盐混合物进行盐析萃取实现乙腈和样品所在水相的液-液分离；2.用分散固相萃取剂和无水硫酸镁对提取溶液净化，分散固相萃取剂依据样品基质和待测化合物的性质，可选择psa、gcb、c18ec等。现有技术中尚没有简单具体的丙硫菌唑残留检测方法，因此寻求一种更简单便捷的分析方法是非常必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种食品中丙硫菌唑残留量的测定方法，其前处理是首先用乙腈溶液提取食品样品中的丙硫菌唑，然后选择c18和psa分散固相萃取剂对提取液进行净化，最后结合液相色谱—串联紫外检测器(lc-uv)，通过化合物离子的精确质量数实现食品中残留丙硫菌唑的准确定性和定量分析。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种食品中丙硫菌唑残留量的测定方法，包括如下步骤：

步骤s1、提取

称取均质化的食品样品于具塞塑料离心管中，加乙腈涡旋振荡，离心；

步骤s2、净化

移取上述步骤s1获得的上清液于塑料离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.45μm滤膜，所得样品液待测定；

步骤s3、配制基质标准工作溶液

将空白样品按上述步骤s1、s2处理，用该空白样品基质溶液在0.05～5.0mg/l范围内配制丙硫菌唑系列浓度标准工作液；

步骤s4、液相色谱—串联紫外检测器测定

(1)定性测定：检测步骤s2得到的样品液中目标化合物，若其色谱峰保留时间与基质标准工作溶液一致，且其准确质量数与浓度相当基质标准溶液中目标化合物的准确质量数的相对标准偏差不超过5ppm时，则判断该样品中存在丙硫菌唑；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含丙硫菌唑；

(2)定量测定：将步骤s3中的各浓度基质标准工作液进行lc-uv测定，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤s2得到的样品液注入lc-uv进行测定，测得样品液中丙硫菌唑的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中丙硫菌唑含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中丙硫菌唑残留量。

进一步地，步骤s1中乙腈的加入量与食品样品的质量比为5ml：1g。

进一步地，步骤s1和s2中的涡旋振荡时间为1min。

进一步地，步骤s1和s2中的离心转速5000r/min，离心时间3～5min。

进一步地，步骤s2中基质分散固相萃取剂由c18和psa组成，每毫升上清液中c18和psa的加入量分别为50mg。

进一步地，步骤s4中液相色谱的色谱柱为亲水色谱柱，液相色谱测定的流动相为乙腈溶液+混合溶液，乙腈溶液和混合溶液的体积比为45：55，流速为0.8ml/min，分析时间为20分钟；其中，混合溶液为含0.1％甲酸的10mmol/l甲酸铵水溶液。

进一步地，步骤s4中紫外检测器使用的波长为240nm，保持10分钟，再切换成255nm，保持10分钟。

进一步地，步骤s4中紫外检测中丙硫菌唑的保留时间为13.4分钟。

进一步地，步骤s1～s4中样品接触到的包括离心管在内的容器均为塑料材质制成。

本发明的有益效果：

本发明能有效降低食品中丙硫菌唑残留检测中的基质干扰，将此前处理方法结合hplc-uv应用于食品中丙硫菌唑定性确证和定量检测。本发明具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点，是对已有quechers方法的补充和改进。完全能满足对相应产品安全检测的技术要求，将为保障食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本发明实施例中苯甲酸乙酯(内标物)高效液相色谱图谱；

图2为本发明实施例中丙硫菌唑标准品高效液相色谱图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一种食品中丙硫菌唑残留量的测定方法，包括如下步骤：

步骤s1、提取

称取均质化的食品样品于具塞塑料离心管中，加乙腈(乙腈的加入量与食品样品的质量比为5ml：1g)涡旋振荡，离心；

步骤s2、净化

移取上述步骤s1获得的上清液于塑料离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.45μm滤膜，所得样品液待测定；

步骤s3、配制基质标准工作溶液

将空白样品按上述步骤s1、s2处理，用该空白样品基质溶液在0.05～5.0mg/l范围内配制丙硫菌唑系列浓度标准工作液；

具体的，称取25.0mg丙硫菌唑标准品于25ml塑料容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0μg/ml标准储备液，移取1.0ml标准储备液置于100ml塑料容量瓶中，用乙腈定容得10.0μg/ml标准中间液，按照表1中标准中间液和基质溶液加样比例配制基质-丙硫菌唑标准工作液；

表1基质-丙硫菌唑标准工作液

步骤s4、液相色谱—串联紫外检测器(lc-uv)测定(紫外检测中，将苯甲酸乙酯作为内标物进行测定)

(1)定性测定：检测步骤s2得到的样品液中目标化合物，若其色谱峰保留时间与基质标准工作溶液一致，且其准确质量数与浓度相当基质标准溶液中目标化合物的准确质量数的相对标准偏差不超过5ppm时，则判断该样品中存在丙硫菌唑；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含丙硫菌唑；

(2)定量测定：将步骤s3中的各浓度基质标准工作液进行lc-uv测定，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤s2得到的样品液注入lc-uv进行测定，测得样品液中丙硫菌唑的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中丙硫菌唑含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中丙硫菌唑残留量。

上述步骤s1和s2中的涡旋振荡时间是1min。

上述步骤s1和s2中的离心转速5000r/min，离心时间3～5min。

上述步骤s1～s4中样品接触到的包括离心管在内的容器均为塑料材质制成。

上述步骤s2中基质分散固相萃取剂由c18(十八烷基键合硅胶)和psa(n-丙基乙二胺)组成，每毫升上清液中c18和psa的加入量分别为50mg。

上述步骤s4中液相色谱的色谱柱为亲水色谱柱。

上述步骤s4中液相色谱测定的流动相为乙腈溶液+混合溶液，乙腈溶液和混合溶液的体积比为45：55，流速为0.8ml/min，分析时间为20分钟；其中，混合溶液为含0.1％甲酸的10mmol/l甲酸铵水溶液。

上述步骤s4中紫外检测器使用的波长为240nm，保持10分钟，再切换成255nm，保持10分钟。

上述步骤s4中紫外检测中苯甲酸甲酯的保留时间为8.1分钟，丙硫菌唑的保留时间为13.4分钟。

实施例

本实施例中使用的仪器与试剂：

t18basic均质器(ika，德国)；cr21gⅲ型高速冷冻离心机(hitachi，日本)；ms3型旋涡混合器(ika，德国)；1200高效液相色谱-紫外检测器(agilent，美国)；psa分散固相萃取剂(agilent，美国)；c18分散固相萃取剂(agilent，美国)；

试剂：水(超纯水，哇哈哈)；乙腈(hplc级，merke，德国)；甲酸铵(hplc级，cnw，德国)；甲酸(hplc级，cnw，德国)；苯甲酸乙酯(分析纯，作为内标物)；

丙硫菌唑标准物质：纯度为99.0％，购自德国dr-ehrenstorfer公司。

小麦种子中丙硫菌唑残留量的检测

(1)样品前处理

称取50.0g小麦种子于研磨罐中，研磨成均质样品。称取均质化的小麦种子样品10.0g于50ml具塞塑料离心管中，加入50ml乙腈，涡旋1min，5000r/min离心5min。离心后，取2ml上清提取液至含有100mgc18和100mgpsa的离心管中，涡旋1min，5000r/min离心3min。取上清液过0.45μm滤膜，所得样品液供液相色谱-串联紫外检测器(lc-uv)测定。

(2)标准工作溶液的配制

称取25±0.1mg丙硫菌唑标准品和25±0.1mg苯甲酸乙酯，于25ml塑料容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0μg/ml标准储备液；移取1.0ml标准储备液置于100ml塑料容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/ml标准中间液；

用经检测不含丙硫菌唑的小麦种子作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将标准中间液用空白基质溶液稀释配制成0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0mg/l系列基质标准工作溶液。

(3)液相色谱-串联紫外检测器(lc-uv)测定

定量测定：将步骤(2)中的各浓度基质标准工作液进行lc-uv测定，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线(如图1、2所示)；在相同条件下将步骤(1)得到的样品液注入lc-uv进行测定，测得样品液中丙硫菌唑的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中丙硫菌唑含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中丙硫菌唑残留量。

其中色谱条件为：kinetex色谱柱(15cm×4.6mm,5μm；美国waters)；流动相：乙腈和含0.1％甲酸-10mmol/l甲酸铵水溶液，以体积比45:55等度洗脱；流速：0.8ml/min；柱温：25℃；进样量：10μl；分析时间：20分钟。

其中紫外检测器参数为：检测使用的波长为240nm，保持10分钟，再切换成255nm,保持10分钟。

定性鉴定：检测步骤(1)得到的样品液中目标化合物，若其色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且其准确质量数与浓度相当基质标准溶液中目标化合物的准确质量数的相对标准偏差不超过5ppm时，则判断该样品中存在丙硫菌唑；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含丙硫菌唑。

标准工作曲线和检出限：

以基质标准工作溶液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。以3倍信噪比(s/n)对应的样品中待测物浓度作为检出限(lod)，10倍信噪比(s/n)对应的样品中待测物浓度作为定量限(loq)，获得各待测物的检出限和定量限。结果显示(如表1所示)，相关系数大于0.999，定量限和检出限分别为0.28μg/ml和0.08μg/ml。

表1丙硫菌唑的保留时间、回归方程、相关系数、定量限和检出限

加标回收率和重复性：

用经检测不含丙硫菌唑的小麦种子作为空白样品，加入低、中、高三种不同浓度水平的丙硫菌唑标准溶液，添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表2。由表2可以看出，在3个加标水平上，丙硫菌唑的回收率100.23％～100.84％，相对标准偏差(rsd)为0.04％～0.30％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表2丙硫菌唑的回收率和重复性(n＝6)

显然，本发明能弥补现有技术中丙硫菌唑残留检测方法缺失的空白，实现食品中丙硫菌唑残留的准确分析。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。