低样本容量的凝血检测的制作方法
本申请声明拥有2012年7月18日提交的美国临时申请序列号61/673,227的权益，将其以引用方式完全纳入本文。
背景资料
凝血是一个复杂的过程，血液或血浆通过该过程形成血凝块。它是机体内稳态的重要部分，停止自损伤血管的失血，且受损血管管壁通过血小板和含有纤维蛋白的血凝块覆盖进行止血，并开始损伤血管的修复。由于凝血不充分可以导致出血风险增加(出血)，而过度凝血可以导致阻塞性血块(血栓形成)，所以凝血过程在整个生物机体中被严格地控制并处于高度守恒状态。
凝血异常非常危险，而且很难对处理和控制凝血的治疗方法进行管理，实施起来也很危险。除此以外，许多患者长期服用抗凝药进行治疗，例如心脏瓣膜置换后使用华法令，需要对抗凝效果进行监测。能够将凝血参数，特别是凝血时间(“pt”，也可以用数学转换形式表达为国际标准化比值：“inr”)和激活部分凝血时间(“aptt”)作为更全面的健康和治疗检测项目的一部分进行监测是极为有益的，这些项目是对一些生物标记物和其他治疗性药物进行测定。pt、inr和aptt可以在临床实验室通过传统方法进行测定，但需要相对较大的血液或血浆容量，通常是采集5ml样本至容量固定的真空试管内。为了提高对患者凝血参数的监测，需要改进凝血检测的实施方法和凝血参数的测定方法。
摘要
发明者认识到需要使用和提供一种方法，通过微量血液样本来测定凝血参数。有利的是，此处所描述的方法可以通过一滴血(大约20μl)中的一个微量全血或血浆进行检测，同时通常保留出足够量的样本用于执行其他测定，可选择地以一种复合检测的模式进行。该方法和设备不需要有经验的操作人员，并且可以在定点服务场所进行，这对于凝血异常的处理以及治疗非常重要，可以提供有用的信息用以调整药物使用剂量和次数。
一些实例中，用来检测凝血的方法包括：a)对一份微量血液样本(例如20μl或更少)的凝血进行监测；b)对一份血液样本的全部或一部分进行稀释，使用稀释后的血液样本进行检测，这样可以减少用于该检测的总样本量。
一方面，多种技术被提供用来对稀释后或未稀释的样本进行凝血检测。一个实例中，一种凝血检测在一个小容器内进行，该容器含有较高的表面积/体积比值，有助于初始血凝块附着到该容器的表面。另一个实例中，一种外源性的可以在凝血过程中生成的物质(例如纤维蛋白原)被添加至样本中，以增加血凝块的强度和(或)浊度。另一个实例中，一些小滚珠被添加至一份血样中，并使用视频成像跟踪该滚珠因重力所致的沉淀运动，当血凝块形成后这种运动则会减小或终止。另一个实例中，一些小荧光滚珠被添加至一份血样中，并使用荧光显微镜跟踪该滚珠因布朗运动、以及因对流和(或)气流所致的运动，当血凝块形成后这种运动则会减小或终止。在另一个实例中，一份血液样本在外力推动下通过一个容器，视频成像被用于跟踪该样本运动，当血凝块形成时该样本在容器中的运动会减小或终止。
一方面，此处所提供的方法用于测定一个研究对象血液样本的凝血时间。该方法含有(a)启动该研究对象血液样本的一个凝血反应；(b)获得一套凝血反应图像；(c)对该套图像进行分析以测定该血液样本的凝血时间。
一方面，此处所提供的方法用于测定一个研究对象血液样本的凝血时间。该方法含有(a)通过非静脉途径从研究对象处获得一份血液样本；(b)启动该血液样本的一个凝血反应；(c)获得一套凝血反应图像；(d)对该套图像进行分析仪测定该血液样本的凝血时间，其中执行步骤(a)到(d)所需时间小于或大约为1小时。一些实例中，执行步骤(a)到(d)所需时间小于或大约为30分钟。一些实例中，执行步骤(a)到(d)所需时间小于或大约为10分钟。
在一些实例中，20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1μl或更少量的血样被用于凝血检测。
在一些实例中，该凝血反应的血容量少于或大约为20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1μl。
一些实例中，该套图像中的一幅单独图像被像素化，含有至少1、10、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个像素。
一些实例中，该方法还进一步含有对该血液样本进行稀释，这样稀释后该样本的凝血时间会介于30秒到10分钟之间。
一些实例中，该方法进一步含有向凝血反应中添加纤维蛋白原。
一些实例中，其起始步骤含有向该血液样本中加入一种凝血启动试剂。
一些实例中，该血液样本是一份血浆样本。
一些实例中，该血液样本通过指尖采血获得。
一些实例中，该图像是凝血反应的光散射图像。
一些实例中，凝血时间根据该散射光强度的转变进行测定。
一些实例中，该方法进一步含有在获得整套图像前向该血液样本中添加一种多元化的滚珠。例如，至少有2、3、4、5、10、100或1000个滚珠可能被添加至该血液样本内。
一些实例中，该多元化滚珠至少包括两种不同的尺寸。
一些实例中，该多元化滚珠的尺寸从1μm到5μm。
一些实例中，该多元化滚珠的尺寸从5μm到50μm。
一些实例中，该多元化滚珠包括一种或多种聚苯乙烯、乳胶、丙烯酸塑料或玻璃材料。在特定方面，这些滚珠可能具有与反应介质不同的折射率(例如高于或低于1、2、3、4、5、8、10、15、16、20、25、30、35、40或50％)，或者可能是不透光的。而且，这些滚珠可能具有与反应介质不同的密度(例如高于或低于1、2、3、4、5、8、10、15、16、20、25、30、35、40或50％)。一些检测中，该反应介质的密度为1.01g/cc。
一些实例中，对该套图像的分析步骤含有对滚珠大致上变为无运动时的时间点进行设置。
一些实例中，对该套图像的分析步骤含有对滚珠运动能力发生变化时的时间点进行设置。
一些实例中，滚珠运动能力发生变化可通过该滚珠在凝血反应中的沉淀减速来得以证实。
一些实例中，对该套图像的分析步骤含有对该套图像中的两幅图像进行比较，以测定滚珠的运动状态。
一些实例中，如果两幅图像大致相同，说明该滚珠基本上无运动。
一些实例中，该滚珠被标记。
一些实例中，该滚珠被一种荧光标记物标记。
另一方面，一种方法被提供用于测定一个研究对象血液样本中的多个凝血参数。该方法含有(a)获得该研究对象的血液样本，而该血样少于或大约50μl，(b)从该血液样本中制备血浆样本。(c)通过该血浆样本实施多个检测以测定多个凝血参数，其中多个参数中至少有一个是凝血时间。
一些实例中，其中的一个凝血参数从下列一组参数中选择：激活部分凝血时间(aptt)、凝血时间(pt)、国际标准化比值(inr)、出血时间、凝血因子、抗磷脂抗体、稀释拉塞尔氏蝰蛇毒试验(drvvt)以及血小板功能、血栓弹力图(teg或sonoclot)和优球蛋白溶解时间(elt)。
一些实例中，使用不到10μl的血浆样本进行多项检测中的一项单独检测。一些实例中，使用不到2μl的血浆样本进行多项检测中的一项单独检测。
一些实例中，该多项检测中的一些检测或每一项检测，其反应容量大约或少于6μl。一些实例中，该多项检测中的一些检测或每一项检测，其反应容量大约或少于10μl。
一些实例中，进行凝血测定检测的时间少于或大约为1小时、30分钟、10分钟、5分钟或1分钟。
一些实例中，获得一套凝血反应图像包括(i)获得一套该多项检测中至少一项检测的图像；(ii)对该套图像进行分析以测定凝血时间。
一方面，一个用于测定一个研究对象血液样本凝血时间的设备被提供。该设备含有(a)一个组成部分设计用来在一种适合血凝块生成的条件下，向来自研究对象的血液样本中添加一种凝血启动试剂，以启动凝血反应；(b)一个组成部分设计用来获得一套该凝血反应的图像；(c)一个组成部分用于对该套图像进行分析以测定该血液样本的凝血时间。
一方面，一个用于测定一个研究对象血液样本凝血时间的系统被提供。该系统含有(a)一个设备设计用来在一种适合血凝块生成的条件下，向来自研究对象的血液样本中添加一种凝血启动试剂，以启动凝血反应；(b)一台照相机用来获得一套该凝血反应的图像；(c)一台计算机用于对该套图像进行分析以测定该血液样本的凝血时间。
在一些方面，一份抗凝血液样本可能被用于此处所提供的任何检测。为了准备一份用于凝血检测的抗凝血液样本，一种可以拮抗抗凝剂效果的试剂被添加，并超过该抗凝剂的剂量。对于乙二胺四乙酸(edta)、枸橼酸盐和草酸盐等抗凝剂，适合的试剂是钙盐(ca2+)；对于抗凝剂肝素，其适合的试剂是聚凝胺。
一些实例中，此处提供的是一种检测混合液凝血方法，含有：在一种含有一定量初始生物学样本的混合液内启动一种凝血反应，其中该混合液：i)总容量不超过500微升；ii)含有不超过5微升的初始生物学样本；iii)含有不超过95％容量的初始生物学样本；对该混合液进行照明并探测来自该混合液的光线；根据对来自该混合液光线的分析对该混合液进行分析以用于凝血。
实例中，此处所提供的方法中涉及一种含有一定量原始生物学样本的混合液，该混合液的总容量可能不超过500、400、300、200、100、75、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0.1微升。
实例中，此处所提供的方法中涉及一种含有一定量原始生物学样本的混合液，该混合液中含有的原始生物学样本可能不超过50、40、30、20、10、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、4、0.1、2、1、0.5或0.1微升。
实例中，此处所提供的方法中涉及一种含有一定量原始生物学样本的混合液，该混合液中含有的原始生物学样本可能不超过总容量的95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
实例中，此处所提供的方法中涉及探测来自混合液的光线，对来自该混合物的光线进行探测含有获得该混合液的一幅图像。
实例中，此处所提供的方法中涉及获得该混合液的一幅图像，该方法进一步含有对该图像进行分析以识别出其中的感兴趣区域(roi)，其中图像中的感兴趣区域包含该混合液的成像信息。
实例中，此处所提供的方法中涉及识别一幅图像中的一个roi，该方法进一步含有对图像中的roi进行分析以确定该roi的平均光线强度。
实例中，此处所提供的方法中涉及获得该混合液的一幅图像，该方法包括获得该混合液的至少一个第一幅图像和一段时间后的一个第二幅图像，其中根据对roi第一幅图像和第二幅图像之间光线强度差异的分析结果确定该混合液的凝血时间。
实例中，此处所提供的方法涉及获取混合液的一幅图像，该混合液图像通过一台ccd或cmos图像传感器来获得。
实例中，此处所提供的方法涉及获取混合液的一幅图像，获得该混合液的一幅图像包括获取该混合液的一段视频。
实例中，此处所提供的方法中涉及探测来自混合液的光线，对来自该混合物的光线进行探测包括探测透过该混合液的光线。
实例中，此处所提供的方法中涉及探测透过该混合液的光线，一段时间内透过该混合液的光线被探测。
实例中，此处所提供的方法中涉及探测透过一种混合液的光线，当透过该混合液的光线强度与透过该混合液的光线强度基础值相比减少一个选定数量时，确定其所经历的时间；根据对该时间的分析结果确定该混合液的凝血时间。
实例中，此处所提供的方法中涉及探测透过一种混合液的光线，当透过该混合液的光线强度与透过该混合液的光线强度基础值相比减少20％或更多时，确定其所经历的时间；根据对该时间的分析结果确定该混合液的凝血时间。
实例中，此处所提供的方法中涉及探测来自混合液的光线，对来自该混合物的光线进行探测包括探测被该混合液散射的光线。
实例中，此处所提供的方法中涉及探测被该混合液散射的光线，一段时间内被该混合液散射的光线被探测。
实例中，此处所提供的方法中涉及探测被一种混合液散射的光线，当被该混合液散射的光线强度与该混合液散射光线强度的基础值相比减少一个选定数量时，确定其所经历的时间；根据对该时间的分析结果确定该混合液的凝血时间。
实例中，此处所提供的方法中涉及探测被一种混合液散射的光线，当被该混合液散射的光线强度与该混合液散射光线强度的基础值相比减少20％或更多时，确定其所经历的时间；根据对该时间的分析结果确定该混合液的凝血时间。
实例中，此处所提供的方法中涉及探测透过该混合液或被该混合液散射的光线，通过一台ccd传感器、cmos传感器、发光二极管或光电倍增管对透过该混合液或被该混合液散射的光线进行探测。
实例中，此处所提供的方法中涉及在一种含有一定量原始生物学样本的混合液中发生一种凝血反应，该混合液中含有外源性纤维蛋白原。实例中，该混合液中的外源性纤维蛋白原的浓度可能至少是0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或150mg/ml。实例中，该混合液中的外源性纤维蛋白原的浓度可能不超过0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150或200mg/ml。实例中，该混合液中的外源性纤维蛋白原的浓度可能至少是0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或150mg/ml，而且不超过0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150或200mg/ml。
实例中，此处所提供的方法中涉及在一种含有一定量原始生物学样本的混合液中发生一种凝血反应，该原始生物学样本是全血。实例中，该原始生物学样本可能是来自一名研究对象的全血样本，从该研究对象抽取该全血样本后，尚未向其中加入任何液体进行稀释。
实例中，此处所提供的方法中涉及在一种含有一定量原始生物学样本的混合液中发生一种凝血反应，该原始生物学样本是血浆。实例中，该原始生物学样本可能是来自一名研究对象的血浆样本，从该研究对象抽取该血浆样本后，尚未向其中加入任何液体进行稀释。
实例中，此处所提供的方法中涉及在一种含有一定量原始生物学样本的混合液中发生一种凝血反应，用一种白光光源向该混合液进行照明。
实例中，此处所提供的方法中涉及在一种含有一定量原始生物学样本的混合液中发生一种凝血反应，用一种或多种所选波长的光线向该混合液进行照明。
实例中，此处所提供的方法中涉及在一种含有一定量原始生物学样本的混合液中发生一种凝血反应，用一种发光二极管(led)发出的光线对该混合液进行照明。
实例中，此处显示的一种光学信号可能是光线。实例中，此处显示的一种光学信号可能是可见光谱以外的电磁放射线。
所提供的这个摘要以简化形式介绍了一个选择概念，这些概念将在以后的详细描述章节做进一步介绍。本摘要意图不是对所权利要求的标的的关键配置或必要配置进行确定，也不是用来对所权利要求的标的进行限制。
引置条款
本说明书中提及的所有出版物和专利应用都是以同等程度的引用方式并入本文中，就像每一个单独的出版物或专利应用被特定地和单独地指示作为引用方式并入本文一样。并入本文的出版物包括美国专利发行号2010/0081144a1、美国专利号7,888,125、美国专利发行号2011/0093249a1、美国专利发行号2009/0318775a1、美国专利号7,291,497、美国专利号8,012,744、美国专利发行号2006/0264783a1、美国专利发行号2007/0224084a1以及美国申请号13/244,947。
图形的简要描述
在该图形中，
图1显示一份血浆样本凝血前(左侧容器)到凝血后(右侧容器)散射的光线增加。
图2显示一份血浆样本凝血过程中平均散射光信号对时间所做的曲线。
图3显示拟合为四参数对数-逻辑函数进展曲线的平均散射光信号对时间的曲线
图4显示通过psnr法分析的一个代表性的反应时间进程。
图5显示了一个滚珠沉淀实例的示意图。
图6显示了一个荧光显微技术实例的示意图。
图7显示了一个适用于显微技术的比色杯实例的示意图。
图8显示了作为一个时间函数的相关因子图形，用于一份血浆样本pt激活因子的测定。
图9显示了一种从视频图像中排除背景噪音的方法。
图10显示了通过光散射测定的典型的pt结果。
图11显示了通过光散射测定的典型的aptt结果。
图12显示了通过滚珠沉淀测定的典型的pt结果。
图13显示了通过滚珠沉淀测定的典型的aptt结果。
图14显示从一个典型的荧光显微镜实例中获取的图像。
图15显示了通过荧光显微镜测定的典型的pt结果。
图16显示了通过光散射测定凝血时间时，向血浆样本中添加肝素后的典型结果。
图17显示的是根据图16的结果所获得的校准后的对肝素剂量-反应的aptt值。
图18显示的是通过光散射所测得的人血浆样本(正常受试者和华法令治疗的受试者)pt的典型结果。
图19显示了平均散射光信号对凝血检测时间作图拟合成的一个双线性曲线。
详细描述
在对发明实例进行描述前，应该理解这种实例仅以示范的方式被提供，而且此处所描述的发明实例的多个替代产品在实践中也可能被使用。有经验的技术人员使用中会出现许多变异、更改和替代，但并不违背本发明。
除非特别定义，此处使用的所有技术性和科学性术语与本发明所属领域内普通技术人员的常规理解具有相同的含义。但是与此处所述相似或相同的方法和材料可以在实践工作使用或对当前发明进行检查，适合的方法和材料将在下面进行描述。在冲突的情况下，将通过该专利指定，包括定义，进行控制。而且，该材料、方法和示范仅用于说明，没有限制性目的。有经验的技术人员使用中会出现许多变异、更改和替代，但并不违背本发明。
定义
冠词“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”是非限制性的。例如，“方法”包括对该词汇意思的最广泛定义，可以是一种以上的方法。
一个“受试者”可能是一个人或动物。该研究对象可能是活着的或是死亡的。该研究对象可能是一位患者、临床研究对象或基础研究对象。一个受试者可能要经过疾病的诊断、处理、和(或)预防的过程。该研究对象可能，或不必，正在接受一项专业医疗服务。
一种“血液样本”是一份血样，或者任何一种血液成分、血液衍生物以及类似物质。血浆是一种血液成分的示例。该血液样本可以是任意适合的容量、通过任意合适的方法获得、在任何时间点从该受试者的任何部位采集、从任意适合的血管内采集，以及类似的情况。血液是动物(包括人类)体内一种特定的体液，用来将机体必需的物质，诸如营养和氧气输送给细胞，并将代谢废物从这些相同的细胞中传送出。血液样本可能有任意适合的物质添加其中，选择性地是一种或多种抗凝剂。“血液样本”还包括被稀释的血样。
“血浆”是血液中的液体成分，全血中的血细胞正常情况下悬浮在其中。它是细胞外液(细胞外的所有体液)中血管内液体的部分。主要是水分(大约占到容量的93％)，而且可能含有溶解后的蛋白质、葡萄糖、凝血因子、电解质离子、激素以及二氧化碳(血浆是用来传输代谢产物的主要介质)。血浆可能通过将一管含有一种抗凝剂的血液在一个离心机内旋转(离心)直到血细胞沉淀到该试管的底部为止的方法来进行准备。然后该血浆被抽出或汲出。
“血清”是不含纤维蛋白、纤维蛋白原或其他凝血因子的血浆(就像从全血中去掉细胞和凝血因子)。
血液样本可能通过一种“非静脉途径”获得，意思是该血液不是用针头从机体的静脉或动脉中抽取的。非静脉途径并不限制该血液样本为静脉血(去氧血)或是动脉血(氧合血)。静脉血和动脉血二者都适合。从机体的毛细血管中获得的血液是一种非静脉途径的示例。
“指尖采血”，“指尖穿刺”或类似的方法是通过非静脉途径获得血液样本的一种方法示例。这里，一个锋利的尖端或锐缘可能被用于穿刺之间的皮肤(或身体的任何其他部位)，造成血液从身体内流出。指尖穿刺也可能在脚跟处进行，例如选择性地从身体的脚跟处采集。该血液可能使用一种毛细血管、移液管、拭子、滴管、或任何已知的其他机制来采集。
术语“凝血(clotting)”和“凝血(coagulation)”，以及其语法变异可以互换使用。它们指一种液体或液体的任何一部分出现固化或变得极度粘稠的一种过程。一般情况下，此处所使用的“凝血”是指血液形成如上所述血凝块的一种生物学过程。
“凝血反应”是一种液体出现凝血的过程，包括血液出现凝血的过程。该凝血反应可能是自然发生未经修饰的，或者可能是经过修饰、人为操作、控制而发生的，如此处所述。
一种“凝血启动试剂”是添加到一份血液样本中以启动凝血反应的任何物质。如此所述，典型的凝血启动试剂包括促凝血酶原激酶和加钙促凝血酶原激酶。
“凝血时间”是指一个启动时间，例如添加一种凝血启动试剂，到血凝块形成所经历的一段时间。如此处所述，一种检测方法中，血凝块的形成可以通过添加滚珠并观察其大致成为无运动状态或历经活动度变化状态的时间来进行探测。
术语“滚珠”和“颗粒”可以互换，是指小的(如此处所述)、固态元素，适用于此处所述的成像过程。
“大致上无运动”是指诸如滚珠的物体不在相对于凝血反应介质的任何方向上产生运动(例如悬浮在反应介质中)。小幅度运动是允许的，包括大约为凝血时间以前滚珠运动速率0.01％、0.1％或1％。
凝血时间还可能指一个启动时间扩展到滚珠“活动度转变”所经历的一段时间，通常意味着对滚珠运动状态的探测。
“凝血参数”是指对一种凝血反应定量或定性测定的任何特性。凝血参数可能与凝血时间相关，如此出所述或已广为人知。
“图像”是任何人工制品，例如对一些物体有着一种相似显像的一张二维照片、一套照片、或录像。图像可能涉及通过一台相机进行的光线捕获。
图像可能是被“像素化”的，即它们含有像素成分。
像在此处所使用的，“定点服务地点”可能包括一个实验对象可能接受一项服务的地点(例如检查、监护、治疗、诊断、指导、样本采集、id确认、医疗服务、非医疗服务等等)；以及可能包括但不限于，一个实验对象的家里、一个实验对象的工作地点、一个医疗服务提供人员(例如医生)的地点、医院、急诊室、手术室、诊所、医疗服务专业人员的办公室、实验室、零售店【例如药店(例如零售药店、临床药店、医院药店)、药房、超市、食品店等等】、交通车辆(例如轿车、船、卡车、公共汽车、飞机、摩托车、救护车、活动专门设备车、消防车、急救车、执法车辆、警车、或用于将一个实验对象从一个地点运送到另一个地点的其他车辆等等)、旅游医疗服务单元、移动单元、学校、育儿中心、安检地点、比赛场所、医疗辅助生活住宅、政府办公室、写字楼、帐篷、体液样本获取站点(例如采血中心)、位于或临近一个实验对象可能希望进入的一个地点的入口处、位于或临近一个研究对象可能希望使用的一个设备的地点(例如一台计算机所处的地点，如果该研究对象希望使用这台计算机)、一个样本处理设备接收一个样本的地点、或者此文其他地方描述的任何其他定点服务地点。一些实例中，一项定点服务是一种定点医疗。如此处所使用的，一种“定点医疗”实质任何受试者所在地或其附近的位置(例如一位受试者的家里或工作地点、食品店、药店、医疗诊所、医院、学校等等)，受试者在该地点可能接受医学相关的治疗(例如，处理、检查、监测、诊断、咨询、样本采集等等)。
“视频”图像是在一段时间内采集的一系列图像。视频图像可能以任何速率被采集，包括例如至少1帧/分钟、至少1帧/10秒钟、至少1帧/秒钟、至少10帧/秒钟、至少20帧/秒钟、至少30帧/秒钟、至少40帧/秒钟、至少50帧/秒钟、至少100帧/秒钟或者至少200帧/秒钟。
凝血参数
凝血在整个机体内是高度守恒的。哺乳动物中，凝血通常同时涉及细胞(血小板)和蛋白(凝血因子)成分(虽然在一些情况下，血浆可以在没有血小板存在的情况下发生凝血)。人类凝血系统已经经过了最为广泛的研究，因此被最好地理解。
在血管受伤损伤了血管内皮层后凝血几乎是瞬间开始。将血液暴露于诸如重组凝血因子的分子时会使血液中的血小板和血浆蛋白纤维蛋白原，一种凝血因子，发生改变。血小板会在损伤位置立即形成一种栓子。这就是通常所说的初期止血。二期止血通常同时发生。血浆中的蛋白，例如凝血因子，以一种复杂的级联方式进行反应来形成纤维蛋白原交联，可加强血小板栓子。这种级联方式至少包括13个凝血因子，任何一种因子的缺乏都可以导致凝血障碍。进一步讲，该凝血级联反应包括组织因子途径(也被称为外源性途径)和接触激活途径(也被称为内源性途径)。临床检查通常会经过设计以消除潜在凝血途径的复杂性，而只报告一个单一易用的参数。
一般情况下，凝血参数通过测定“凝血时间”来确定，它是从凝血时间启动到血凝块形成所经历的时间。凝血参数包含所测定的凝血时间。一些情况下，该凝血参数是存在一定试剂，在一定温度下或类似情况下的凝血时间。
许多检查和(或)检测被研发用来评价凝血系统功能，其中任何一种检测都可能适合使用此处所描述的方法进行测定。常规凝血参数检测包括aptt、pt和inr，这在前面已经做过介绍，并在后面有详细描述。在学术界众所周知的其他凝血参数包括纤维蛋白原检查，常常通过clauss方法进行；血小板计数检测以及血小板功能检测，这常常通过西门子公司pfa-100tm分析以进行。在学术界众所周知的进一步凝血检测和(或)临床操作包括凝血酶凝结时间(tct)检测、出血时间检测、混合检测(将患者血浆与正常血浆混合后，其凝血异常是否被纠正)、凝血因子检测、抗磷脂抗体检测、d-二聚体检测、基因检测(例如凝血因子vleiden、凝血酶原突变g20210a)、稀释罗素蝰蛇毒素时间(drvvt)检测、各种血小板功能检测、血栓弹性图检测(teg或sonoclot)，以及优球蛋白溶解时间检测(elt)。
接触激活(内源性通路)通过“血浆中的”接触因子激活而触发，且可以通过激活部分凝血酶原时间(aptt)检测进行测定(正式成为高岭土脑磷酯凝血时间，“kcct”)。历史上该方法涉及将血液收集到一个含有草酸盐或枸橼酸盐的容器内，因其与钙结合而抑制凝血。添加磷脂、一种活化因子(例如硅胶、硅藻土、高岭土、鞣花酸)和钙盐后可以逆转草酸盐或枸橼酸盐的效果，从而激活内源性凝血途径。测定直到血凝块形成所经历的时间。该检查之所以被称为“部分”是由于反应混合物中缺乏组织因子。
在一定实例中，目前的方法涉及对样本的稀释，这可能会延长样本的凝血时间。实例中，通过对样本的稀释来增加一份样本的凝血时间可能是有优势的，例如为了延长从样本凝血反应启动到样本出现凝血这段时间。这种延长可能是有利的，例如可能允许有更多的时间将一种凝血反应物移动到一台光线探测器处，或反之。另一个示范中，通过对样本的稀释来增加一份样本的凝血时间可能是有优势的，以便提供一个较大的时间框架，其间可能对凝血时间检测进行更为准确的评估。实例中，通过制备一份校准曲线可能对稀释后样本和未稀释样本进行比较(例如凝血时间的比较)。
一个异常的aptt时间可以是存在一种凝血抑制因子的表现，也可以是一种特定凝血因子的数量或功能缺陷。可以进行一些检查来鉴别这种情况，其中用正常血浆对该样本进行稀释(初始比例大约为50：50)。如果该异常未消失，那么该样本内可能含有一种凝血抑制剂，例如肝素、抗磷脂抗体或凝血因子特异性抗体。如果异常的aptt得以纠正，那么该样本内可能存在凝血因子viii、ix、xi、xii和(或)vonwillebrand因子缺乏。目前的发明涵盖aptt测定和涉及aptt测定的混合检测。
组织因子(外源性)凝血途径通过组织因子(一种特异性的细胞脂蛋白)的释放而启动，而且可以通过凝血酶原时间(pt)检测进行测定。pt结果通常以一个比值(inr)的形式进行报告，以对口服抗凝药诸如华法令的剂量进行监测、表明肝脏损害或维生素k的状态。pt测定凝血因子i、ii、v、vii和x。该方法历史上涉及将血液采集到一个含有枸橼酸盐的容器内，并离心式血细胞核血浆分离。通常将过量钙盐添加到edta/枸橼酸盐/草酸盐抗凝的血浆中，再加入组织因子(也成为凝血因子iii)，观察该样本出现凝血的时间。该凝血时间可以存在一些变异，大致是由于所使用的分析系统以及检测中所使用的厂家生产的组织因子不同批号之间的差异所致。inr被设计成将该结果标准化。如等式1中所见，inr是凝血酶原比值(患者的凝血酶原时间除以正常对照血浆的平均值)的isi次幂。isi(国际敏感性指数)表示一个特定批号的组织因子与国际组织因子参照标准相比较其敏感性如何。isi通常在1.0到2.0之间，由该组织因子的生产厂家进行报告。
高inr水平，例如大约为5.0，表示出血的机会较高。低inr水平，例如大约为0.5，表示出现血凝块的机会较高。一名健康人的正常范围通常在0.9到1.3之间。华法令治疗的患者其正常值范围通常在2.0到3.0之间，但是对于诸如心脏机械瓣患者其目标inr可能会稍高。
通过凝血酶凝结时间(tct)所测定的结果可能能够对纤维蛋白原异常的患者进行定量和定性筛查。血液中存在的凝血酶原确切含量的测定通常使用对凝血酶原进行测定的clauss法进行。许多分析以能够从凝血酶原时间凝血图中测定出一个“衍生的纤维蛋白原”水平。此处所描述的方法和设备同样可以被用来对纤维蛋白原进行定量和(或)定性测定。
如果一个凝血因子是接触性激活或组织因子激活途径的一部分，该凝血因子的缺乏不一定对所有的凝血参数检测产生影响。例如a型血友病是凝血因子viii缺乏，该因子是接触性激活途径的一部分。因此，a型血友病导致异常延长的aptt检测，而pt检测正常。此处所描述的方法和设备允许进行多项检测，包括对多元、易用模式中的一滴全血进行多种凝血检测，这种功能可以是非常有优势的。
凝血测定的方法、设备和系统
此处所描述的方法、设备和系统可能被用于对上述提及的任何凝血参数进行测定，以及(或者)对接受抗凝药治疗患者的药物剂量效果进行监测。抗凝剂抑制凝血并延长血液凝结时间，而且可以作为药物治疗血栓性疾病或用于医疗装置。典型的抗凝药包括香豆素类，例如华法令、醋硝香豆素，苯丙香豆素和苯茚满二酮；肝素及其衍生物，例如低分子量肝素；合成戊糖凝血因子xa抑制剂，例如磺达肝癸和艾卓肝素；凝血酶直接抑制剂包括阿加曲班，重组水蛭素，比伐卢定，希美加群和达比加群；凝血因子xa直接抑制剂，例如利伐沙班和阿哌沙班；以及其他类型抗凝剂，例如巴曲酶和裂纤酶。
一些实例中，此处所提供的方法设备和系统用于测定一个研究对象血液样本的凝血时间。一些实例中，该方法含有在一种适合血凝块生成的条件下，向来自研究对象的血液样本中添加一种凝血启动试剂，以启动凝血反应；获得该凝血反应的一套图像；以及对该套图像进行分析以测定该血液样本的凝血时间。一些实例中，该方法进一步包括通过一种非静脉采血途径从该研究对象处获得一份血液标本。
一些实例中，一个设备含有一个组成部分能够在一种适合血凝块生成的条件下，向来自研究对象的血液样本中添加一种凝血启动试剂，以启动凝血反应；一个组成部分能够获得一套该凝血反应的图像；一个组成部分能够对该套图像进行分析以测定该血液样本的凝血时间。能够分析一套图像以对一份学血液样本的凝血反应进行测定的组成部分可能是该设备内一种装置的一部分，该装置同样被设计用于获得一幅以上的凝血反应图像。能够分析一套图像以对一份血液样本的凝血时间进行测定的组成部分可能被安装在该设备内。能够分析一套图像以对一份血液样本的凝血时间进行测定的组成部分可能被设计在该设备内执行多种类型的分析，或者可能被用于多种用途。能够分析一套图像以对一份血液样本的凝血时间进行测定的组成部分可能被放置在远离该设备的位置。能够分析一套图像以对一份血液样本的凝血时间进行测定的组成部分可能被放置在一台云端计算基础结构模式内(如云端计算)。能够分析一套图像以对一份血液样本的凝血时间进行测定的组成部分可能位于云端内，而且该设备可能被设计受来自该云端的动态控制。一些实例中，该设备被设计用来根据一项凝血检测分析结果对一个继发操作产生影响。在一些实例中，一台能够执行此处所述凝血检测的设备可能被设计作为一种美国系列号13/244,947中所描述的设备，该描述以引用的方式完全纳入本文中。
本发明的系统可能包括一个设备能够在一种适合血凝块生成的条件下，向来自研究对象的血液样本中添加一种凝血启动试剂，以启动凝血反应；一台照相机用来获得一套该凝血反应的图像；以及一台计算机用于对该套图像进行分析以测定该血液样本的凝血时间。设计用于分析一套图像以对一份血液样本的凝血时间进行测定的计算机可能是该系统内一种装置的一部分，该装置同样被设计用于获得一幅以上的整套凝血反应图像。设计用来分析一整套图像以对一份血液样本的凝血时间进行测定的计算机可能被安装在该系统内。设计用来分析一整套图像以对一份血液样本的凝血时间进行测定的计算机可能被设计在该系统内执行多种类型的分析，或者可能被用于多种用途。设计用来分析一套图像以对一份血液样本的凝血时间进行测定的计算机可能是被置于远离一台照相机的位置，该照相机被设计用于获得一幅以上的整套凝血反应图像。设计用来分析一整套图像以对一份血液样本的凝血时间进行测定的计算机可能位于该系统内。设计用来分析一套图像以对一份血液样本的凝血时间进行测定的计算机可能位于云端内，而且该系统可能被设计受来自该云端的动态控制。该系统可能被设计用来根据一项凝血检测分析结果对一个继发操作产生影响。在一些实例中，一个能够执行此处所述凝血检测的系统可能被设计作为一种美国系列号13/244,947中所描述的系统，该描述以引用的方式完全纳入本文中。
一方面，此处所描述的方法、设备和系统使用小容量血液或血浆来测定凝血时间。该血液可以通过一次指尖采血而获得，其中通常获得容量大约为20μl的一滴血样。此处所描述的凝血测定方法可以使用这一整个容量(或者甚至大于20μl，包括大约2滴、3滴或4滴血样)。这些方法也可以使用不到一滴血的容量。一些情况下，单独一滴血样可以用于几个不同测定，凝血或其他检测，可选择性地在一个多元模式中进行。
用于此处所述方法、设备和系统的血液或血浆容量可以是任何适合的数量。一些实例中，该容量大约为1ml、大约为500μl、大约为400μl、大约为300μl、大约为200μl、大约为100μl、大约为75μl、大约为50μl、大约为40μl、大约为20μl、大约为10μl、大约为9μl、大约为8μl、大约为7μl、大约为6μl、大约为5μl、大约为4μl、大约为3μl、大约为2μl、大约为1μl、大约为0.8μl、大约为0.6μl、大约为0.4μl、大约为0.2μl、大约为0.1μl、大约为0.05μl、大约为0.01μl，以此类推。一些实例中，该容量最多大约为1ml、最多大约为500μl、最多大约为400μl、最多大约为300μl、最多大约为200μl、最多大约为100μl、最多大约为75μl、最多大约为50μl、最多大约为40μl、最多大约为20μl、最多大约为10μl、最多大约为9μl、最多大约为8μl、最多大约为7μl、最多大约为6μl、最多大约为5μl、最多大约为4μl、最多大约为3μl、最多大约为2μl、最多大约为1μl、最多大约为0.8μl、最多大约为0.6μl、最多大约为0.4μl、最多大约为0.2μl、最多大约为0.1μl、最多大约为0.05μl、最多大约为0.01μl，以此类推。实例中，此处所提供的方法可能被使用，其中使用容量不多于原始样本(未稀释的)中的200μl、100μl、75μl、50μl、40μl、20μl、10μl、9μl、8μl、7μl、6μl、5μl、4μl、3μl、2μl、1μl、0.8μl、0.6μl、0.4μl、0.2μl、0.1μl、0.05μl、0.01μl、0.005μl或0.001μl。
这个实例中，此处所提供的方法可能使用一个很低容量的总反应混合液。例如，此处所提供的方法可能被使用，其中使用的反应混合液总容量为200μl、100μl、75μl、50μl、40μl、20μl、10μl、9μl、8μl、7μl、6μl、5μl、4μl、3μl、2μl、1μl、0.8μl、0.6μl、0.4μl、0.2μl、0.1μl、0.05μl、0.01μl、0.005μl或0.01μl。在反应混合液的总容量内，只要足够执行一种检测方法(例如不多于200μl、100μl，等等)，此处所述的原始样本(未稀释的)中的任何一个容量都可能被使用。
一些实例中，该设备或系统包括一台显微镜和(或)一台照相机。该照相机可能是一台录像机。该显微镜可能被设计用于亮视野、暗视野或荧光显微技术。该设备或系统可能进一步被设计接收一个暗盒。该暗盒可能含有一份血液样本和(或)试剂用于执行凝血检测。该设备或系统可能包含整合的样本处理机制；或者该系统或设备可能具备自动化的样本处理机制。一些方面，该设备或系统可能被设计接收一个含有一份血液样本的暗盒，并执行一个自动设置的凝血检测。
一些实例中，一位使用者可能将一定容量的来自一名研究对象的血液样本引入一个暗盒内。血液样本可能是一个小容量，例如1ml或以下、500μl或以下、400μl或以下、300μl或以下、200μl或以下、100μl或以下、75μl或以下、50μl或以下、40μl或以下、30μl或以下、20μl或以下、15μl或以下、10μl或以下、9μl或以下、8μl或以下、7μl或以下、6μl或以下、5μl或以下、4μl或以下、3μl或以下、2μl或以下、1μl或以下、0.8μl或以下、0.6μl或以下、0.5μl或以下、0.4μl或以下、0.3μl或以下、0.2μl或以下或0.1μl或以下。该暗盒可能包含一种抗凝剂与该血液样本混合。该暗盒可能被置于一个设备内。实例中，该血液样本被置于暗盒内以前可能与一种抗凝剂相混合。在暗盒内或在设备内，可能对该血液样本的血浆和含有红细胞的压积部分进行分离。或者，该血液样本可能仍保持全血状态。该血液样本可能在该设备内被分配至一个或多个不同的检测单元内，用于一种或多种不同的检测。该血液样本可能通过一个液体输送设备该设备内进行分配。该血液样本可能被稀释。该样本可能与一种或多种试剂混合。该试剂可能执行以下一个或多个功能：a)逆转一种抗凝剂的作用(例如，将钙离子添加至含有edta的样本内可能逆转该edta的抗凝效果)；b)促进该样本的凝血(例如磷脂、硅胶，硅藻土，高岭土，鞣花酸)；c)有助于该抗凝反应的可视性(例如可能被观察到的滚珠或其他颗粒)；d)增加血凝块的强度和(或)体积(例如纤维蛋白原)；e)减少与反应容器内血液样本分析底物的特异性结合(例如洗涤剂或蛋白质)。除此以外，该试剂还可能执行其他的功能。该试剂可能是液态或固态的形式。诸如蔗糖，海藻糖，聚乙二醇或白蛋白等反应剂可能按任何不同的固体形式进行配制，例如制成一种可蚀性薄膜以利于快速溶解。该血液样本与试剂的混合液可能通过任何能够获得与有关该凝血反应一幅或多幅图像的设备进行观察。视频图像可能被获得。该凝血反应图像可能被分析以便确定该反应的凝血时间。对一种凝血反应的分析可能在一台计算机或其他设备组成部分的辅助下进行。该反应的凝血时间可能被用来对研究对象的医疗状况进行分析。该方法的一个或多个步骤可能在定点服务或定点医疗站点进行。在一个定点医疗站点实施此处所示的方法能够使医护人员根据指定受试者的相关检测数据对该患者快速做出处理决策。
样本处理及反应室
此处所描述的样本、试剂和凝血检测可以被各种不同的反应容器类型处理和盛装。一个样本处理设备和一个反应容器可以是，诸如，一个反应孔、一个试管、一个末端开放的吸头，也可以是一个比色杯，或者长方形或方形横截面的毛细管。在此处应用时，一个吸头也可以被称为一个样本吸头、一个比色杯吸头、一个反应腔、一个比色杯、一个毛细管、一个样本处理设备或一个样本转移设备。样本可能从一个样本源处采集到一个吸头或一个试管内。该吸头可能被密封。这种密封可能是永久性的或可逆性的。一旦该检测结果已备好随时读取，即可以将该凝血反应引入一个光学系统内进行图像分析或其他类型的解读。多个检测可以被平行处理。实例中，一个反应容器可以包含多个相互分开的液体隔离室，这样多个不同的检测反应混合液可以放置在同一个反应容器内。根据检测操作规程和(或)孵育时间，检测数据的读取可以顺序进行或同时进行。对于涉及一个变化率测定的检测，该检测元件可以在不同时间被多次引入到光学系统中。
液体和材料处理系统
一个液体转移装置可以是一个设备的一部分。一个液体转移设备可以是一个系统的一部分。该液体转移设备或装置可以含有多个移液头。该液体转移设备的一部分可能备有任何数目的移液头。一个示范中，一个液体转移设备具有大约八个移液头，被安装在一条直线上并按一定距离分开。一个实例中，该移液头具有一个锥形管嘴，通过压合方式与多种吸头相接合。该吸头可以具备一个结构使其能够被器械自动移除并在使用完毕后弃之于设备的外壳内。一个实例中，该检测吸头是无色且透明的，其可以与一个比色杯相类似，让一个检测在该吸头内运行，这样可以被一个光学探测仪，例如一个光电倍增管或照相机传感器探测到。
一个示范中，一个系统的程序化处理器可以含有一些使用说明或指令，而且可以根据该使用说明操作一个液体传送设备，通过将一个活塞回撤(用于吸进液体)或延伸(用于排除液体)至一个封闭气室内，空气移动量和速度都可以被诸如程序化的处理器精确地控制。
通过将需要混合的成分吸入到一个共用试管内，然后在一个吸头内将大部分混合在一起的液体容量上下反复抽吸的方法可以获得样本(或试剂)和稀释液(或其他试剂)的混合液。对在一个试管内干燥后的试剂进行溶解也可以通过类似的方法进行。样本和试剂的移除可以通过将该液体排弃到设备内的一个储液器内或一个吸收垫上来完成。根据来自程序化处理器的使用说明或操作规程，另一种试剂可以被吸入到该吸头内。
一个系统可以含有一个支架或衔接器用于移动该检测单元或吸头。一个衔接器可能含有一个真空抽吸组件，或者一个被设计刚好放进检测单元吸头套筒内的组件。例如，可以按类似的方法将该吸头移动到液体传送设备的移液管头处。根据一个衔接器或支架的位置，该设备还可以被移动至一个载物台上。
一个实例中，移动该吸头的使用说明与移动一个样本量的说明相似，例如此处所述的一个液体传送设备。例如，根据采集吸头上的套筒，一个样本采集吸头可以恰好放入一个移液管头内。然后该采集吸头可以被用来在该设备和系统内的各个位置上分配液体。液体分配完毕后该采集吸头可以被丢弃，根据检测单元上的套筒，该移液管头可以被放进一个检测单元内。然后该检测单元吸头可以从一个试剂单元移动到另一个试剂单元；根据移液管头所提供的抽吸或移液作用类型，试剂可以被分配至该检测单元内。移液管头也可以通过抽吸或注射器作用类型在采集吸头、检测单元或试剂单元内执行混合功能。
另一个实例中，含有包括凝血检测液体的吸头可以从移液管设备上脱离，“停放”在该装置或一个废弃单元内的指定位置上。如果需要，吸头可以用一个封盖密封以防止液体漏出。一些实例中，该密封盖可以是一种乙烯类密封盖。此处说明的，或者在美国系列号13/244,947或美国专利号8,088,593中所描述的该液体和材料处理系统中的任何变异都可以被采用。
典型的样本吸头
各种容器形状都可以被用作样本吸头、反应室、毛细管和比色杯。例如，一个比色杯可以是圆形、圆柱形、房型、长方形、立方形、圆锥形、锥体形或任何可以盛装液体样本的其他形状。长方形比色杯在光束以直角或其他角度(非零度角)照射比色杯表面时可以被使用。在这种长方形比色杯中，被照射的液体样本也成长方形，是由比色杯形状决定的。具有圆形横截面的比色杯也可以被使用。
不同路径长度的设备可以被使用以优化和延伸检测反应，并使检测测定所需样本量最小化。比色杯至少在一个区域内可以长于其横截面。
一些实例中，一种检测比色杯的形式在光照入射方向是一个圆形的横截面。使用圆形横截面的比色杯可能有几个优势，包括但不限于以下几点：
1.光学路径可以被精确地定义。注塑制品尺寸的精准度可以是变异系数(cv)优于1-2％。传统微量滴定板内未受限制的液体半月面可以在路径长度上造成测定不准确。
2.末端开放的腔室和吸头的圆形切面赋予其极佳的液体处理特性，使液体抽吸非常精确。
3.吸头的光学图像提供给我们一种能力，即识别该吸头的位置和液体柱的边界，以及准确定位具有最大信号的吸头中心位置。
4.多个液体样本可以在同一个吸头内进行孵育和分析。这是因为在吸头的狭窄部分，相邻液滴之间只出现非常少量的物质传递(轴线方向)
此处说明的，或者在美国系列号13/355,458中所描述的比色杯和成像系统中的任何变异都可以被采用。
一个典型的吸头可能具备以下一些普通特征：
吸头长度：0.5–4cm.
吸头外径：0.2–1.0cm.
吸头内径：0.1–0.5cm.
吸头吸取液体的容量：0.5–50ul.
系统储存精确度通常优于2％或+/-0.001cm。
吸头设计结构：该吸头通常备有一个与移液管(圆柱形)衔接的结构，以便形成一个液体密封效果。它还通常含有一段用于成像的圆柱形或圆锥形区域。吸头下半部分通常很狭窄，有助于在重力作用下保留垂直液体柱。
吸头材料：首选无色塑料(聚苯乙烯、聚丙烯等等)(例如在可见光谱内透射光线>80、60、40、20％)。也不除外其他合适的材料。
一个示范中，圆柱体上端是一个截去顶端的圆柱形套筒，与该圆柱体液态相连并向适合，以便能够与一个移液管的锥形结构相衔接。该吸头的下端可能变得很狭窄，以提供一种结构使吸头在垂直方位时能够保留其液体内容物而不用接触移液管。吸头下端的外部形态通常也多少有些尖头状，其直径从圆柱体主要部分向末端逐步减小，以便该吸头末端能够压合进一个柔软的(乙烯材料)盖帽内进行液态密封。吸头通常由一种铸型塑料制成(聚苯乙烯、聚丙烯以及类似材料)。该吸头可以是无色或透明的，这样有关该样本的信息可以通过成像获取。
在一些实例中，该吸头被设计为(1)带有一个上端结构可以与移液管头相衔接形成一个空气密封；(2)一个基本上是圆柱形(或者是一个脫模角度非常小的圆锥形)杆体和一个狭窄的尖端。这种吸头可以与一个盖帽形成一个液体密封结构。尖头形状有助于在中等程度外力下与盖帽形成良好的一致性。吸头的材料可能是注塑聚苯乙烯。
密封结构可以使用一种由乙烯或其他材料制成的盖帽形成，使用沿z方向移动装置平台所产生的外力，很容易将其与含样本吸头的狭窄末端压合相适。
试剂和反应
任何人员均可实施此处所描述的方法。使用者可以是受试者本身。使用者可以是经过医疗培训的人员。例如医生或护士，但并非必需。使用者可能接受过普通的或特殊的技术培训以实施此处所描述的方法，但并非必需。该方法也可能被多名使用者实施，例如不同使用者执行不同的步骤。
此处所述的方法可能以使用一份以前抽取的血液和(或)血浆样本开始。在这个实例中，该样本常常含有添加其中的一种抗凝剂，通常为edta。此处描述的方法还可能以从一位受试者处获取血液样本开始。该血液可能通过一种非静脉途径获得(例如从毛细血管获得；例如不涉及针头)。例如，该血液可能从一次指尖采血获得。该血液可能被采集至任何合适的容器内。一些实例中，该血液被采集至一个暗盒内。该容器和(或)采集暗盒内可能含有一种抗凝剂，通常为edta。开抗凝剂可能自主地狱该血液样本混合并且(或者)溶解在该血液样本内。
一些实例中，该样本(通常含有一种抗凝剂)被离心处理。离心可能在任何适合的时间和离心力组合下进行，以将该血液分离为压积的有形成分和血浆。这种有形成分通常主要含有红细胞，血浆中通常情况下基本上不含任何细胞。离心并非必需步骤。一些实例可以使用全血进行。该全血样本可能被稀释。一些实例还可能不使用离心的方法从血液样本中制备血浆，例如通过通过添加一种试剂凝集血细胞。
全部或一部分血浆可能被用在检测中。该血浆还可能被分配至一个多元化格式内的几个检测中。用于移液低容量血浆的适合方法在美国序列号13/244,947和美国专利号8,088,593中有所描述。一些实例中，该血浆用以下所述方法进行稀释。该血浆可以被任何适合的液体稀释。典型的液体包括hepes缓冲盐水(hbs)、磷酸缓冲盐水(pbs)、三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(tbs)，以及含有咪唑，乙二胺，n-乙基吗啉、三羟乙基胺或其他缓冲试剂的中性范围(例如ph5-9)的溶液。该血浆或血浆样本可能在测定凝血参数和(或)在多元化格式检测分配前、分配中或分配后被一次或多次稀释。
然后将一个小容量的最佳稀释后样本与特定的试剂相混合。该混合液通常被快速实施检测，例如在不到10秒钟、不到5秒钟或不到1秒钟内进行。该试剂通常包括(a)如果需要，一种逆转抗凝效果的试剂；(b)一种促进凝血的试剂；(c)用于所稀释样本的一种或多种辅助性试剂，例如纤维蛋白原或以下所述的蛋白。一些情况下，一种弥散的荧光或其他颗粒可能被添加，以用来通过以下所述的成像方法确定凝血时间。
用于逆转抗凝剂效果的试剂可以是任何合适的试剂。例如，钙离子可能被添加用于逆转edta的效果。该钙离子，最好是以cacl2的形式，可能被过量添加。实例中，钙离子可能被添加至此处所提供的凝血反应中，使钙离子在该反应中的最终浓度(ca2+)至少为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100mg/ml；不超过0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100mg/ml；或者在0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或75mg/ml和0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100mg/ml之间。
促进凝血反应的试剂(“凝血启动试剂”)可以根据需要测定的凝血参数不同而有所变化。如上所述，pt和(或)inr的测定涉及添加一种含有组织因子或脂质的凝血酶原试剂。aptt的检测使用磷脂和一只激活剂，例如硅胶硅藻土，高岭土或鞣花酸。
一些实例中，一种或多种试剂是以浓缩或干燥的形式存在。浓缩试剂可能减少样本稀释的容量。至于干燥试剂，将样本与干燥试剂混合可以使该试剂快速溶解并(或者)扩散到样本内。该干燥试剂可能通过反复抽吸或其他混合方法快速溶解并(或者)扩散到样本内。任何试剂都可能是浓缩或干燥的，以浓缩或干燥形式提供的试剂非常稳定。事实上，一些试剂在干燥形式下可能会提高稳定性，有效地避免了冷藏、防腐或类似处理的需要。特别是，pt试剂、aptt试剂以及(或者)cacl2可能会被浓缩和(或)干燥。所有试剂可以被结合形成一种干燥试剂。例如，该试剂可以被制成一种易蚀薄膜的形式，其配方包括蔗糖，海藻糖，聚乙二醇，白蛋白以及类似的用于快速溶解的物质。一种适合用于pt和(或)inr测定的干燥试剂配方可以在美国专利号5,164,598中找到。
一些实例中，与试剂混合后的样本通常在一个受控温度下进行孵育。一些实例中，该温度大约是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，以此类推。一些实例中，该温度在大约15℃到50℃之间、30℃到40℃之间，以此类推。一些情况下，该孵育步骤可能被省略。例如，aptt检测可能不需要孵育步骤。
稀释方法
一些实例中，该血液或血浆样本要进行稀释。稀释样本相比而言可能有至少三个潜在的优势。第一，稀释可能减少所需样本的容量。一些实例中，稀释后血浆的一个分装样本被保存用于凝血参数的测定，其余的样本可以用于其他检测。还有，例如将样本稀释10倍后允许该检测方法使用小于10被的样本容量。第二，稀释可能降低脂血症样本(样本中含有高浓度的脂肪，可能呈乳白色)的光散射。第三，稀释会延长凝血时间。这在减少检测的时间敏感性方面可能有好处。就是说，例如在执行混合样本与试剂或移动照相机的步骤时不需要太迅速。执行这种步骤时可以特别具有挑战性，因为使用小容量样本时其血流属于层流，照相机必须与一个很小的容量进行调准等等。
凝血时间可能是任何合适的时间，时间可选择性地足够长，以减少该操作的时间敏感性，而且使测定更精确和(或)准确；同时，该时间可选择性地足够短，以便在医疗服务地点实施，并提供近乎实时的结果。一些实例中，该凝血检测与其他生物标记物或治疗药物的测定平行进行(例如多元化模式)。这些实例中，对样本进行稀释可能是有优势且(或者)可实施的，这样凝血时间长短与该多元化检测中的其他测定时间相近似。可选择性地，该凝血时间与其他生物标记物或治疗药物检测所需的最长时间相近似，或短于后者。
一些实例中，该凝血时间，使用稀释后样本或未稀释样本时，大约为1分钟、大约为2分钟、大约为3分钟、大约为4分钟、大约为5分钟、大约为6分钟、大约为7分钟、大约为8分钟、大约为9分钟、大约为10分钟、大约为15分钟、大约为20分钟、大约为25分钟、大约为30分钟，以此类推。一些实例中，该凝血时间，使用稀释后样本或未稀释样本时，少于大约1分钟、少于大约2分钟、少于大约3分钟、少于大约4分钟、少于大约5分钟、少于大约6分钟、少于大约7分钟、少于大约8分钟、少于大约9分钟、少于大约10分钟、少于大约15分钟、少于大约20分钟、少于大约25分钟、少于大约30分钟，以此类推。一些实例中，该凝血时间，使用稀释后样本或未稀释样本时，大约在1分钟到2分钟之间、大约在1分钟到5分钟之间、大约在2分钟到10分钟之间、大约在5分钟到8分钟之间，以此类推。
该样本可能被稀释到一个适合的程度，可选择性地进行稀释以获得任何适合的凝血时间。一些实例中，该样本被稀释大约1.5倍、大约2倍、大约2倍、大约3倍、大约4倍、大约5倍、大约7.5倍、大约10倍、大约20倍、大约30倍、大约40倍、大约50倍或者大约100倍。一些实例中，该样本至少被稀释大约1.5倍、大约2倍、大约2倍、大约3倍、大约4倍、大约5倍、大约7.5倍、大约10倍、大约20倍、大约30倍、大约40倍、大约50倍或者大约100倍。一些实例中，该样本最多被稀释大约1.2倍、大约1.5倍、大约2倍、大约2倍、大约3倍、大约4倍、大约5倍、大约7.5倍、大约10倍、大约20倍、大约30倍、大约40倍、大约50倍或者大约100倍。一些实例中，该样本被稀释大约在1.2倍到2倍之间、大约在2倍到5倍之间、大约在5倍到20倍之间，或者大约在5倍到50倍之间。实例中，一个样本可能被稀释到所含有的原始样本浓度(按体积计算)为90％或以下、80％或以下、70％或以下、60％或以下、50％或以下、40％或以下、30％或以下、20％或以下、10％或以下、5％或以下、4％或以下、3％或以下、2％或以下、1％或以下、0.5％或以下、0.1％或以下、0.05％或以下、0.01％或以下、0.005％或以下，或者0.001％或以下(例如此处所使用的，一个稀释后样本所含原始样本浓度为80％或以下时，当稀释后样本总容量为100ul时，其原始(未稀释)样本含量不多余80ul；同样，一个稀释后样本所含原始样本浓度为2％或以下时，当稀释后样本总容量为100ul时，其原始(未稀释)样本含量不多余2ul)。该原始样本可能是诸如均匀的全血或血浆。实例中，一个凝血反应可能含有被稀释的样本，这样该反应液中所含有的原始样本浓度(按体积计算)为90％或以下、80％或以下、70％或以下、60％或以下、50％或以下、40％或以下、30％或以下、20％或以下、10％或以下、5％或以下、4％或以下、3％或以下、2％或以下、1％或以下、0.5％或以下、0.1％或以下、0.05％或以下、0.01％或以下、0.005％或以下，或者0.001％或以下(例如此处所使用的，一个稀释后样本所含原始样本浓度为80％或以下时，当稀释后样本总容量为100ul时，其原始(未稀释)样本含量不多余80ul；同样，一个稀释后样本所含原始样本浓度为2％或以下时，当稀释后样本总容量为100ul时，其原始(未稀释)样本含量不多余2ul)。
一些实例中，可能希望整个凝血检测在一个较短时间内完成，因为在医疗服务站点使用该检测时可能希望有一个较短的时间，以便获得近乎实时的结果。整个检测时间可能是从取血，可选择性地通过指尖采血方法，到向该血液中添加特定的试剂、到拍摄图像以进行图像分析、再到报告凝血参数所经历的整个时间。整个检测时间还可能延伸至使用该凝血报告参数计算并(或者)按需给予患者一个剂量的抗凝药为止。一些实例中，该总检测时间大约为1分钟、大约为3分钟、大约为5分钟、大约为10分钟、大约为15分钟、大约为20分钟、大约为30分钟，以此类推。一些实例中，该总检测时间大约少于1分钟、大约少于3分钟、大约少于5分钟、大约少于10分钟、大约少于15分钟、大约少于20分钟、大约少于30分钟，以此类推。
一些实例中，在特定条件下对样本进行稀释可能会降低血凝块的机械强度和(或)凝血时样本的浊度。在特定情况下，血凝块强度降低可能有不利影响，不太容易确定凝血发生时间。目前的发明包含了多种可选择的方法用来对样本的稀释进行补偿。
一些实例中，该方法可能在一个小容器内进行，且该容器具有较高的表面积/体积比。这可能有助于一个初期血凝块附着在该容器表面上。容器的大小和(或)表面积在通过如下所述的样本整体往复运动成像来确定凝血的实例中可能是一个考虑因素。该容器的容量以及(或者)表面积/容积比值可能是任何适合的数值，这样此处所描述的方法可以被确实地和准确地执行。
一些实例中，辅助性试剂可能被添加，例如小颗粒、纤维蛋白原、表面活性物质和(或)蛋白质。这些辅助性试剂可能支持形成一种比较强壮的血凝块，而且(或者)可能增加凝血时的样本浊度。
一些实例中。一些小颗粒可能被添加至该样本中，以便观察到样本粘滞度的改变。这些小颗粒运动幅度的降低可能与样本粘滞度的增加相关，并可能提供一个样本凝血的指标。
不用任何理论依据，我们相信当前方法的许多版本中，重力作用太弱不足以克服发生凝血时颗粒运动是所遇到的粘性阻力，甚至用于稀释后样本的凝血。对该颗粒的成像可能被用于确定凝血时间，如此处所述。
一些实例中，纤维蛋白原可能被添加到样本中。添加纤维蛋白原可以提供用于形成更牢固的血凝块，并(或者)提供用于血块形成时浊度的增加。该纤维蛋白原选择性地来自于动物，可以是牛纤维蛋白原。所添加的纤维蛋白原量可以是任何剂量，以便形成机械强度和(或)浊度适合的血凝块。不同实例中，该稀释后样本中补充纤维蛋白原含量大约为1mg/ml、大约为2mg/ml、大约为3mg/ml、大约为4mg/ml、大约为5mg/ml或者大约为10mg/ml。不同实例中，该稀释后样本中补充纤维蛋白原含量大约至少为1mg/ml、大约至少为2mg/ml、大约至少为3mg/ml、大约至少为4mg/ml、大约至少为5mg/ml或者大约至少为10mg/ml。实例中，外源性纤维蛋白原可能被添加至此处所提供的凝血反应中，使该外源性纤维蛋白原在反应中的最终浓度至少为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100mg/ml；不超过0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100mg/ml；或者在0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或75mg/ml和0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100mg/ml之间。
实例中，一个凝血反应可能含有被稀释的样本，这样该反应液中所含有的原始样本(例如均匀的血浆或全血)浓度为80％或以下、70％或以下、60％或以下、50％或以下、40％或以下、30％或以下、20％或以下、10％或以下、5％或以下、4％或以下、3％或以下、2％或以下、1％或以下、0.5％或以下、0.1％或以下、0.05％或以下、0.01％或以下、0.005％或以下，或者0.001％或以下；而且该凝血反应可能进一步含有外源性纤维蛋白原，这样使该外源性纤维蛋白原在反应中的最终浓度至少为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100mg/ml；不超过0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100mg/ml；或者在0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或75mg/ml和0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100mg/ml之间。
还有可能使用其他方法对样本稀释进行补充，或者将此处所描述的方法相互之间结合使用，或与其他方法结合使用。例如，可以添加纤维蛋白原和颗粒以帮助确定稀释后样本的凝血时间。正如在其他地方描述的，实例中凝血检测时使用稀释后样本可能会带来各种优势。因此，使用纤维蛋白原或其他试剂对一份样本的稀释进行补偿可能允许我们认识到这种在那些检测中使用稀释后样本所带来的优势，同时仍然会获得该稀释后样本有效的和可测定的凝血参数。
一些情况下，血液和(或)血浆样本的稀释可能会造成样本中凝血因子的丢失，例如通过诸如试管或移液管吸头表面的吸收。一些实例中，表面活性剂和(或)蛋白质可能被添加至样本中医防止和(或)减少凝血因子的丢失。一个典型的适用于此目的的表面活性剂是曲拉通x-100。一个典型的适用于此目的的蛋白质是牛血清蛋白(bsa)。表面活性剂和(或)蛋白的浓度可以是任何适合的浓度，以便将凝血因子的丢失减低到一个可接受的水平。
图像
此处所描述的设备和系统可能包括任何成像设备，例如一台照相机、含ccd传感器的设备、含cnos传感器的设备，或者其他任何带有成像功能的便携式、台式或较大设备。此处所描述的方法可能使用光学方法来测定一个凝血参数。一些实例中，样本凝血后会增加该样本的浊度和光散射。添加纤维蛋白原是一种增加血凝块浊度和光散射的方法，这样血凝块可以被探测到，如此处所述。
另一些实例中，样本初始即呈浑浊状态，或者通过添加悬浮颗粒而使样本变得浑浊，这些单独颗粒肉眼是看不到的，但是整体状态下会产生一种浑浊模糊的状态。一份初始呈浑浊状态的样本进过一段时间后其混住程度可能会减轻，因为颗粒从整个液体部分中沉淀下去；但是样本的凝血过程可能会中止或大至上减慢颗粒的沉淀，并降低浊度。一些实例中，凝血时间可以通过样本整体浊度降低速度的停止或减慢来进行确定。通过浊度确定凝血时间是一个光学技术(涉及光线)，而且可能涉及图像的拍摄，但图像的应用并不是必需的。例如实例中，浊度可能通过测定被样本吸收的光线或被样本散射的光线来进行测定，任意一种方法都可能被诸如一个光电倍增管或一个发光二极管感知。一些实例中，用此处方法获得的头像是光散射图像，且通常没有被像素化。具有一个较长的光线路径穿过样本，或者增加样本的路径长度是一种用来增加浊度变化测定敏感性的方法。
此处所描述的方法可能使用图像来测定一个凝血参数。该图像可以是视频图像或者是一组照片图像。该图像可能通过诸如照相机、反光镜、镜头i、显微镜或类似的光学设备进行拍摄。该图像可以是二维或三维图像。该图像可以是黑白照片、灰阶照片或彩色照片。该图像可以是数码照片或模拟照片，包括数字化模拟照片。该图像可以被像素化，意味着它含有大量的像素，其图像可能区别于包括不同光谱学形式在内的其他光学现象。通过将该图像分割为大量的行和列，一幅二维图像可能被像素化，其中每个元素(行和列的位置)被定义为像素。
该图像可以被像素化为任何一个适合的像素数量。一个实例中，该图像被分割为512行和512列，定义为262144位像素。一些实例中，该图像含有大约10000个像素、大约50000个像素、大约60000个像素、大约100000个像素、大约200000个像素、大约500000个像素、大约1000000个像素、大约5000000个像素、大约10000000个像素或大约50000000个像素。一些实例中，该图像至少含有大约10000个像素、大约50000个像素、大约60000个像素、大约100000个像素、大约200000个像素、大约500000个像素、大约1000000个像素、大约5000000个像素、大约10000000个像素或大约50000000个像素。一些实例中，像素的密度和(或)分辨率可能被报告，它是指一个给定面积内含有的一定数量的像素。
一方面，该方法描述了使用一系列图像测定一个凝血时间。图像可以以任何适合的速率进行拍摄。该速率可以是恒定的，或者可以随凝血过程的时间而变化，可选择性地在样本内血凝块形成前后的时间段内拍摄更多的图像。一些实例中，图像拍摄速率大约为每秒1帧、大约为每秒5帧、大约为每秒10帧、大约为每秒15帧、大约为每秒20帧、大约为每秒30帧、大约为每秒50帧、大约为每秒100帧、大约为每秒500帧，以此类推。一些实例中，图像拍摄速率至少大约为每秒1帧、大约为每秒5帧、大约为每秒10帧、大约为每秒15帧、大约为每秒20帧、大约为每秒30帧、大约为每秒50帧、大约为每秒100帧、大约为每秒500帧，以此类推。一些实例中，插入方法可以被用来估计落入拍摄帧幅之间的凝血时间。
该图像可以被存储到一台计算机的可读取介质内。该图像可以被实时处理或者在晚些时候进行处理。该图像可以被人工处理或者使用被一台计算机置入的方法进行处理。
凝血检测的光学设定
凝血分析可以使用一种光学设置来进行。该光学设置可以包括但不限于一个光源和一个光线探测器。通常，光源提供到达该凝血反应的光线，而探测器探测来自该反应的光线(例如被该反应散射的、反射的或透射的光线)。
该照明光源可以是，例如一个或多个白光光源、单色led、来自荧光灯或leds的宽频光、led阵列、红绿蓝混合光源、被led激活的磷光、荧光管、白炽灯以及诸如一个频闪管的弧形光源。
许多光线探测器可以与此处提供的方法和系统一起使用。实例中，诸如一个ccd传感器或cmos传感器的图像传感器可能被使用。一个图像传感器可能作为照相机的一部分被提供。一台照相机可能包括一个光圈或镜头。实例中，相机的镜头可能具有5-100mm之间，包括35mm，任意的聚焦距离。该镜头可能是带有一个标准物镜距离的玻璃，或者可能是一个网络相机镜头。实例中，光线探测器可能是一台之子计数仪或探测器，例如一个光电倍增管(pmt)或光电二极管(包括诸如雪崩光电二极管、宽范围的光电二极管、pin光电二极管以及单频光电二极管)。一些实例中，pin二极管可以与一个倍增器耦合在一起形成探测仪器，其敏感度与光电倍增管(pmt)相当。一个探测器还可以含有一个光源，例如一个灯泡或发光二极管(led)。该光源可以对一个检测过程照明，以获得探测结果。该探测器还可以含有将光源输送到检测部位的光学设备，例如一个透镜或光纤镜。
该光源和探测器可能具有许多使二者相互联系或与凝血反应支持装置相关的结构(例如容器、表面、试管、吸头等等)。例如，光源和探测器可能都与反应支持装置成直线排列；或者，其中之一或者二者都可能与该反应支持装置成一定角度，或者二者之间也可能成角度排列。一个示范中，该光源与凝血反应支持装置成直线排列，而探测器则与反应支持装置之间成一个90度角。在光源或反应支持装置与探测器之间可能会有一个光圈。当一个反应支持装置移入光学通路中时，一个反应图像可能会被拍摄，这样来自光源的光线到达该反应，而来自该反应的光线则到达探测器。实例中，一个反应支持装置可能沿任何一个方向或所有的x、y或z的方向移动，以移入该反应通路中或被从中移出。实例中，一个凝血反应支持装置可能被移入与一个光源和(或)探测器相交通的位置。实例中，一个光源和(或)探测器可能被移入到一个与凝血反应支持装置相交通的位置。一个实例中，一个、两个或全部三个凝血反应支持装置、光源和探测器，其中之一至少与其他三个之间可能是相对移动的。实例中，一个或多个光缆可能被连接到一个诸如ccd传感器或pmt的光学探测器上，以便将光线从一个至少在某种程度上与该光学检测器分开的位置导向该光学探测器。
该反应支持装置和(或)样本容器可以是背光、向光或侧光的。背光可以被用作探测光散射的目的(散射测浊法)。该光学安排可能会采取广泛的、后方背景被均匀照射的形式，以及一个被样本阻断的指定形式的光束。向光照明也可能被使用。
一些实例中，用于凝血成像的光学设置可能被设计测定散射的光线。一方面，用于测定散射光线的设置包括一个光源和一个探测器。该光源可能提供弥散光；该样本被盛装在一个诸如光学透明的吸头或其他支持装置的容器内。该容器可能由一种诸如聚苯乙烯或丙烯酸的透明材料制成。该容器的光线路径(内径)可能是，例如大约0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多毫米。该容器被置于一个探测器的前方，通常与该探测器的距离为大约20-50毫米(但是其他距离也可能被使用)。该探测器可以是任何本文其他地方所描述的探测器。
该探测器可能包括，也可能不包括诸如镜头和滤光器的光学成分。滤光器可能被用来通过消除来自周围环境的任何漫射光来减少背景杂光。该样本根据探测器的位置可能被直角照射(或者任何非零度角的照射光线)。该光源可能被放置在样本支持装置的侧方(从探测器角度大约为90度)、上方或其他位置。该光源可以是任何光源，弥散的或非弥散的；而且可以是任何波长或几种波长的联合。该光源的波长可以被选择与探测器的最大光谱敏感性相匹配。
在激发荧光时，样本可以从前方被照明以达到荧光照明的目的。该光源可能是一种单色光，例如一种led或激光。侧光也可以用于激发荧光。样本通常在一个角度时被激活，一般是90度角，从而将出现发散的光子。这种形式的光线不但能够使荧光发散物从侧面释出，还能够将散射光探测器直接放置在样本的后面(背光)。
一些实例中，荧光发散物在与激发光束成90度角时被成像。一些实例中，一个光子源，通常是一个高强度led经过一个光束弥散器和一个塑型镜头，产生一个被校准的或逐渐分离的激发光束。该激发光束通过一个带通滤光器后对样本进行照明，该样本由含有一种带荧光标记样本溶液的容器(试管、比色杯或移液管吸头)组成。同步发散荧光通过一个适合通过斯托克司频移荧光的长通或带通滤光器光谱性地与激发光线分离。光线通过一个数码相机或其他探测器上镜头被成像。通过图像分析，从所获得的图像中提取出荧光强度。
其他实例中，透射光线在经过光学过滤后被成像，以去除位于激发波长的光线。一些实例中，一个光子源，通常是一个高强度led经过一个光束弥散器和一个塑型镜头，产生一个逐渐分离的、椭圆形的激发光束。该激发光束通过一个带通滤光器后对样本进行照明，该样本以一个或多个样本容器(试管、比色杯或移液管吸头)形式存在，每个容器中都含有一种带有荧光标记物质的溶液。同步发散荧光通过一个适合通过斯托克司频移荧光的长通或带通滤光器光谱性地与激发光线分离。光线通过一个数码相机上的相机镜头被成像。通过图像分析，从所获得的图像中提取出荧光强度。该光学设置可以被用来同时生成多个试管的阵列图像。
一些实例中，可能使用荧光、暗视野照明或亮视野照明进行成像。
暗视野照明可能通过使用一个环形光(位于样本上方或下方)、一个暗视野阿贝氏聚光器、一个带有超环面镜的暗视野聚光器、一个安装在物镜镜头袖套内的落射暗视野聚光器，或者一个环形光与装有暗视野光阑的载物台聚光器的联合体来获得。根本上讲，这些光学组成部分产生一个光锥的数值孔径(na)比物镜使用的na大。照明方式的选择有赖于几个方面的考虑，例如所需要的放大率、机械设计方面的考虑、成像传感器的大小等等。一个基于环形光的照明方式通常为一个广阔的区域提供均一的暗视野照明，同时又为整个系统的机械设计方面提供了足够的灵活性。
亮视野照明可能通过使用沿载物台聚光器的白光光源来获得以产生koehler照明。
一些实例中，一个自动的滤光轮可能被使用。该自动滤光轮允许对光学成像通路进行控制，以便能够在同一个视野内对多个荧光团进行成像。
一些实例中，可能会发生基于图像的自动对焦。一种基于图像的规则可能被用来控制一个物镜(例如与样本之间的距离)z向位置(例如垂直位置)以获得自动对焦。简单说，使用诸如暗视野、亮视野或其他类型的照明，以一个很快的速率拍摄一幅小的图像(例如128x128像素)。该图像可能被分析用于自动对焦的功能，即对图像的清晰度进行测定。根据快速搜索原则，对紧邻物镜z位置的部分进行计算。物镜可能被移动到新的z位置，然后另一个小图像可能被拍摄。这种闭路式系统不需要使用任何其他用于对焦的硬件。该显微镜载物台可能与机控步进电机相连接，以允许在x和y方向上的转译(例如水平方向)。在每一个位置上，所需数量的图像被拍摄，然后该载物台被移动到下一个xy位置。
一个带有ccd、emccd、cmos或光电倍增管的相机可以被用来探测该信号。
光散射方法
一些实例中，凝血时间可以通过光散射来进行确定。该反应混合液可以在毛细作用或抽吸作用下吸入一个吸头内或毛细管内。该吸头或毛细管可以有任何可选择的透明材料制成，包括但不限于玻璃或一种透明塑料，例如聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯(亚克力)。一些实例中，该移液管吸头或毛细管是细长的。例如，如果1μl的反应混合液被吸入到直径为0.5mm的毛细管内，液柱的高度大约为5.1mm。
然后该吸头或毛细管可以被密封或加盖，选择性地防止检测过程中的样本挥发。一个适合的用于密封吸头或毛细管的方法是再抽吸一个小量的矿物油。该移液管吸头或毛细管还可以在油内进行涂层，通过减少吸头或毛细管表面的光散射来提高成像质量。
然后该移液管吸头或毛细管可以被悬吊在一个暗背景前并进行照明。一般情况下，照明方向是该光线对吸头或毛细管进行照明，但并不直接进入相机或其他光电探测器。例如，如果照相机位于该吸头或毛细管前方，那么光线可能从侧面进入。
该吸头或毛细管被选择性地监测。一个简单的光电探测器，例如一个光电二极管或pmt可以被使用。一台照相机也可以被使用，可选择地是一台录像机。照相机可能含有诸如ccd或cmos传感器。使用一台照相机在一些实例中可能是有优势的，它允许我们通过图像处理来确定样本的位置，从而使该方法对移液管误差以及样本的放置不太敏感。一些实例中，吸头或毛细管通过反射或吸收光谱进行监测。
当发生凝血时，纤维蛋白原多聚体会增加样本的浊度。额外的光线被反应混合液散射，这会作为一种散射到探测器的照明光线数量增加而被照相机或光电探测器记录到。图1显示了凝血前100和凝血后105的反应混合液。注意从100到105指示位置的浊度增加。还有，在图1中，吸头101的下半部分被覆油涂层，而吸头上半部分102并没有被覆油涂层。请注意，与非油涂层部分102相比，吸头油涂层部分101的光散射量较低。
图像分析允许我们只对穿透检测混合液的光线进行分析，这特别适用于相对小量的检测容量。例如，使用图像分析，来自容器壁的反射或散射光线可能从分析中被除外。另一个实例中，使用图像分析确定含有检测混合液的图像区域的大小，这接下来可能被用来确定容器中检测混合液的容量。这可能允许对透过不同容量检测混合液的信号进行标准化。另一个实例中，通过使用图像分析，含有检测混合液的容器位置，或者在一个容器内的检测混合液的位置可能被确定。这可能允许我们对来自检测混合液的光线进行准确的测定，尽管含有检测混合液的容器位置，或者一个容器内的检测混合液的位置在同一个光学设置下运行不同检测后有时可能会发生变异。一般情况下。图像分析可能允许对用于分析的图像中感兴趣区域(roi)进行识别。通常，图像中的roi是总图像中的一部分，其中含有检测混合物的图像。可选择地，一个roi可能在一幅图像中被识别，并且可能确定roi内光线和(或)信号的强度。对于一个获得很多图像的给定的检测混合液，同一个检测混合液多幅图像中roi的信号强度可能被测定和分析，而且被用来确定检测混合液的凝血时间。通常情况下，检测混合物凝血状态的变化会导致roi内信号的改变。
散射光线强度开始增加的时间即为稀释后样本的凝血时间，并且可能被适当地转化来提供正确的凝血参数。将稀释后的凝血时间转化为凝血参数可能是通过对含有独立特点样本的系统进行校准来完成。
光散射数据分析
在按上述方法测定光散射的实例中，图2中显示的类型数据可能被获得。图中所示是平均信号对时间的作图。该示例中，时间是水平轴向，从刚好少于50秒延伸至右侧的刚好大于300秒。平均信号强度在垂直轴向上作图，从反应开始时刚好小于0.2平均强度单位延伸到末端的刚好大于0.45单位。图3显示的是将图2中的数据拟合成的一个四参数对数-逻辑函数进展曲线。
一些实例中，该凝血时间可以从图2和(或)图3进展曲线作图数据的任何界定部分中进行估计。例如，凝血时间可以被定义为光散射达到最大光散射的大约10％、大约50％或大约80％，等等的位点。应用的曲线最佳点可以通过该结果与其他可接受的预测方法所得结果的相关性来决定，这些方法用于带有覆盖临床关注范围的凝血参数数值的临床样本。
一些实例中，散射光强度的数据可能被拟合为图19所示的曲线。图中所示是平均信号对时间的作图。这种情况下，时间是水平轴向，而平均信号强度被绘制在垂直轴向上。图19中的乙状曲线是平均光线强度数据，并被拟合为一个双线性曲线。一些实例中，该凝血时间可以从图19所示双线性拟合曲线的任何界定部分中进行估计。例如，凝血时间可以被定义为光散射信号至少达到光散射基线水平大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％以上时的位点。
实例中，涉及通过凝血反应分析光散射的方法可能能够测定透射穿过凝血反应的光线数量。当样本凝血时，它可能变得更不透明，散射的光线更多，且透射的光线更少。实例中，测定穿过凝血反应的透射光数量的凝血时间检测可以被定义为穿过凝血反应的透射光数量下降至少低于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％穿过样本的透射光基线水平是的位点。
颗粒滚珠沉淀法
一些实例中，凝血时间可以通过血凝块形成时样本内的显微颗粒或滚珠沉淀速度的停止或减慢来进行确定。滚珠可能在凝血前的任何时间点以任何浓度添加到样本中。一些实例中，滚珠是一种浓缩或干燥混合试剂的一个部分，在样本内进行混合、悬浮，以及溶解和再悬浮。
转向图5，该方法涉及将含有滚珠500的样本抽吸到一个透明容器内，诸如一个毛细管或移液管吸头505。该毛细管或移液管吸头可能具有一个狭窄的直径，可选择地大约为0.5mm。该毛细管通常呈垂直方向，这样滚珠在重力作用下沿吸头或毛细管的长轴进行沉淀。经过一段时间沉淀的滚珠通过一台照相机510进行成像。该照相机可能是一台录像机，或者与一台能够对颗粒成像的显微镜相耦合。一些实电视显微术例中，该显像法是电视显微术。一些实例中，该照相机是一台网络相机。一些实例中，该网络相机安装在距离该毛细管或吸头10mm的位置。
专用名词“滚珠”和“颗粒”可互相交换使用。滚珠可能是任何尺寸，这样它们会议一个适合的速度沉淀；在发生凝血时，该速度会减慢或停止。一些实例中，该滚珠的直径大约为5μm、大约为10μm、大约为20μm、大约为25μm、大约为30μm、大约为35μm、大约为40μm、大约为45μm、大约为50μm、大约为60μm或大约为100μm。一些实例中，该滚珠的直径大约最多为5μm、大约最多为10μm、大约最多为20μm、大约最多为25μm、大约最多为30μm、大约最多为35μm、大约最多为40μm、大约为最多45μm、大约最多为50μm、大约最多为60μm或大约最多为100μm。一些实例中，该滚珠的直径在大约5μm到大约100μm之间、在大约20μm到大约60μm之间，或者在大约25μm到大约40μm之间。滚珠可能有任何适合的材料制成，包括聚苯乙烯或乳胶；它们可能是任何形状包括球形，而且它们可能具有任何适合的密度。
不同大小、不同形状、不同密度、不同材料等等的滚珠可能以不同的速度沉淀，或者以不同的程度保留在血凝块中。一些实例中，具有一个尺寸分布的滚珠混合物可能被使用。一些实例中，具有多个不同尺寸的滚珠混合物可能被使用。图5所示，直径25μm515和直径45μm520的滚珠混合物可能被使用。具有不同形状、不同密度、不同材料等等的滚珠混合物也可能被使用。一方面，滚珠混合物可能被使用。滚珠混合物可能提供多种沉淀速度和(或)血凝块保留特性，以提高该方法的敏感性、可重复性、以及可测定的凝血时间范围等等。
随着时间的进行，该滚珠将在重力作用下沉淀，如图5所示，指示标识525。一些实例中，滚珠的运动可能是被任何适合的外力所驱动，例如对流、气流、磁场、布朗运动等等，可选择地与重力联合使用。如果其密度小于介质，该滚珠还可以在重力作用下在介质内浮动。不具被任何特定的理论，甚至在稀释后血浆中出现的极微弱的血凝块都足以克服这些诸如重力的微弱外力，防止滚珠运动。一些实例中，血凝块的强度可以通过添加外源性纤维蛋白原而得以增加，如上所述。一些实例中，与光散射法相比，滚珠沉淀法可能使用较少的外源性纤维蛋白原。凝血时间可能是在微弱外力作用下滚珠停止运动的时间，或者在微弱外力作用下运动速度大幅降低的时间。
一些实例中，该凝血时间可能通过图像分析确定滚珠运动停止时间来确定。一些实例中，该图像分析可能是自动的，可选择地在任何适合的原则指导下。例如，可能对一个差值参数，例如每帧每一个像素与录像最后帧幅之间的平均平方差进行计算。当发生凝血滚珠运动停止时，录像的最后一帧图像将大致类似于凝血和录像结束之间的所有帧幅的综合。在这个示范中，只要发生凝血，该差值参数即降至接近零。下降开始的时间代表凝血时间，它可以转换为一个适当的凝血参数。
另一个实例中，峰值信噪比(“psnr”)可以被用来确定凝血时间。psnr通过等式2中所定义的均方误差(“mse”)来评估图像“t”和“k”之间的差异。
其中psnr在等式3中进行定义。
maxi为图像中的最大强度；“m”和“n”为像素的图像尺寸(宽乘长)。
图4显示通过psnr法分析的一个代表性的反应时间进程。该psnr进展曲线显示为psnr数值沿垂直轴向从15延伸至上部的刚好大于35。时间显示在水平轴向从刚好低于50向右延伸至刚好大于300。一些实例中，该psnr数据适合一个简单的函数，例如一个线性或二次函数，而且其增加的中位点可以被确定并通过所描述的校准与一个凝血参数相关。
一些实例中，凝血时间可以通过显微技术来进行确定。一个实例中，全血的凝血可以通过在显微镜下观察红细胞的运动来确定。该全血样本可能被稀释。在含有红细胞的检测中，该红细胞所执行的功能与上面滚珠沉淀法中所描述的滚珠功能相似。
荧光显微法
一些实例中，凝血时间可以通过在显微镜下观察荧光滚珠的运动来确定。适合的荧光滚珠包括羧酸盐修饰荧光团。适合的羧酸盐修饰荧光团可能从加利福尼亚州卡尔斯巴德市的lifetechnologiesinc.公司获得，商品名为fluospheres，产品编号f-8816。荧光滚珠可以在任何适合的波长下发出荧光，包括光谱的深红色部分。该荧光滚珠哎可能是任何适合的尺寸。一些实例中，该滚珠具有一个尺寸其在重力作用下不发生沉淀或在反应介质中缓慢沉淀，而且当样本发生凝血是即停止运动。一个实例中，该荧光球的直径大约为1μm。
如在滚珠沉淀非中所述，荧光滚珠可能有任何适合的浓度，并与其他干燥试剂等一起添加。如图6所示，该样本600不是必须抽吸到一个毛细管或移液管吸头内，而可能将一滴样本放置在一张切片上605。含有荧光滚珠610的样本可能是任何适合的容量，包括大约为2μl。显微物镜615在一个聚焦平面620上为该样本成像。切片605相对于显微物镜615的位置可以发生变化，用以改变聚焦平面620的深度，或者对样本的不同区域进行成像。一些实例中，该切片可以相对于显微物镜进行系统性的移动，这样可以对该检测反应中的几个视野进行拍摄。切片和显微物镜之间的相对位置还可以保证只能看见样本，而无背景区域。
一些实例中，该样本可以放置在一个比色杯上。通过将该比色杯放置在于显微物镜615相关的位置，或者可能放置在一张切片605上对该比色杯进行成像。一个典型的比色杯被绘制在图7中，上方视图700和侧面视图705。该典型的比色杯具有两层结构。上层710可能是一种亚克力间隔材料，而下层715可以是一个标准的玻璃盖片。上层可能具有任何适合的厚度，包括大约为80μm。上层还可能具有接口720，选择性地直径大约为2mm，可选择性地由一个激光切割机生成。组成上层710的丙烯酸材料可能一侧有粘性，能够粘附在下层结构715上。将上层和下层组合在一起生成一个大约直径2mm、深度80μm的微型样本孔720，它能够盛装大约0.25μl的样本。
一些实例中，该比色杯由一种很薄的透光丙烯酸平板构成，并带有机械切割的接口用于盛接样本。一些实例中，该比色杯由一种注模塑料制成，带有电浆蚀刻表面以提供比色杯的亲水性。
荧光滚珠的运动通过气流(图6标识625)，对流和布朗运动的混合外力进行驱动。一些实例中，该样本在荧光滚珠激发波长下进行照明。一些实例中，该样本由一盏氙弧灯进行照明。荧光滚珠在发射波长下发处射线，这些射线可能被一台显微镜观察到。一些实例中，该显微镜可能是一台倒置的荧光显微镜，其显微物镜615位于样本600的下方。该显微镜可能具有任何适合的放大倍数，这样可以对荧光滚珠进行成像，并可以对其运动进行分析。一个实例中，一个20x的物镜被使用。滚珠的运动通过一台照相机进行记录。该照相机可能是一台制冷型ccd相机。该图像可能以任何适合的速度进行拍摄，包括一个大约为每秒5帧的拍摄速率。一些实例中，该图像在荧光滚珠激发波长下获得。
通过分析所记录的图像来确定荧光滚珠停止运动的时间，并可能通过此方法确定凝血时间。一些实例中，100-200幅图像被获取。该图像可以按此所述进行分析来确定凝血时间，它通过校准与此处所描述的一个凝血参数相关。
一个实例中，全血的凝血可以通过在显微镜下观察红细胞的运动来确定。该全血样本可能被稀释。一些实例中，红细胞可能被荧光标记。红细胞可能通过普通的显微镜进行观察，或者对于荧光标记的红细胞通过荧光显微镜进行观察。在含有红细胞的检测中，该红细胞所执行的功能与上面荧光显微法中所描述的滚珠功能相似。
液柱推动法
一些实例中，凝血时间可以通过对样本整体运动的成像来决定。在这种方法中，发生凝血的样本黏附在容器的内壁上，例如毛细管的内侧，并在凝血后停止运动。该样本可以通过任何方法包括气动方法进行移动。
该运动可以是任何方式，包括往复运动、圆周运动等等。该运动可以是规律性的或不规律的，而且可以穿过任何适合的距离。一些实例中，该整体运动大约有几毫米，例如大约为1mm、大约为2mm、大约为4mm、大约为6mm、大约为8mm、大约为10mm、大约为20mm或大约为30mm。一些实例中，该整体运动大约至少为1mm、大约至少为2mm、大约至少为4mm、大约至少为6mm、大约至少为8mm、大约至少为10mm、大约至少为20mm或大约至少为30mm。一些实例中，该整体运动大约最多为1mm、大约最多为2mm、大约最多为4mm、大约最多为6mm、大约最多为8mm、大约最多为10mm、大约最多为20mm或大约最多为30mm。
该运动可以是任何适合的频率，或者发生在任何适合的时间尺度。一些实例中，该整体运动大约为几秒钟，例如大约为0.5s、大约为1s、大约为2s、大约为4s、大约为6s、大约为8s或者大约为10s。一些实例中，该整体运动在时间标尺上大约最多为0.5s、大约最多为1s、大约最多为2s、大约最多为4s、大约最多为6s、大约最多为8s或者大约最多为10s。
该样本可能是血液或血浆。在液柱推动法中，显微成像可能不是必需的。有关的图像通常是整体液体样本位置与该毛细管容器之间的关系。该容器通常是透明的，这样在血液样本情况下，该样本可以通过其红颜色很容易地进行鉴别。血浆本质上通常是透明的，所以一些实例中对整体血浆样本的探测可能更为困难。一些实例中，在毛细管内，由于样本末端液-气半月面的光线折射，血浆样本可以被成像。如果在一个特殊实例中，通过图像描述很难对该半月面进行定位时，一种染料或其他适合的材料可能被加入到样本中以提高该半月面的可视性。另一个示范中，即使开始阶段看不到，一旦发生凝血，由于光的散射，该月状面也可能变得可见。
该样本可能被稀释或不被稀释。一些示范中，潜在地包括一些使用稀释后血浆的实例，在某些情况下可能不会形成强度适合的血凝块。但是，该血凝块强度可以通过添加外源性纤维蛋白原或一种高体积分数的中性浮力滚珠得以加强，从而形成适合的强度。不受理论的约束，该滚珠为初始血凝块提供了很大的结合表面积，这可以使试剂与样本混合宾得更加粘稠或者提高其液粘滞度增加的效果，并允许形成的血凝块黏附在毛细管壁上从而停止运动。该体积分数可以是任何适合的分数以便血凝块粘附在毛细管上。一些实例中，对一个检测进行准备，从而使该检测容量的大约20％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％或大约90％为滚珠。一些实例中，对该检测进行准备，这样使得该检测容量的至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％或至少大约90％是滚珠。在液柱推动法中，该滚珠可能比较大，例如直径大约为10μm。添加滚珠可能具有另一个有益的效果，就是它可以增加有效的样本容量，这样可能有助于观察小样本容量而不用对样本进行稀释。
图像处理和分析
图像可能通过此处所述的小容量凝血测定方法来获得。一般来说，经过一段时间后获得该图像，通常较凝血时间长。所拍摄的最后一幅图像通常是凝血后样本的图像。
图像的像素化，包括典型的像素值如上所述。一些实例中，每一幅图像中含有一个512乘512像素的阵列(总共262144像素)。每幅图像可能被分为16个512乘32像素(行乘列，或列乘行)的条形区域。每个条形区域可能被转换为其各自的傅里叶变换图像，并用该傅里叶变换条重组形成一个调整后的512乘512像素的图像。一些实例中，通过将获取的左后一幅图像按同样的方式进行转型来创建一幅参照图像。
一些实例中，例如颗粒滚珠沉淀法和荧光显微法(如上所述)的分析，这些方法均涉及计算转形后图像的每一列与其相应的转形后参照图像列之间的相关系数。该相关系数可能根据等式4进行计算。
其中xi和xiref分别是图像列和参照图像列的ith元素。相关因子值在0到1之间变化。最后图像的相关因子(与自身做对照)应该是1.0。
每一列都可能获得一个相关因子，两幅图像的整体相关性是所计算出的所有列的相关因子的中位值。因此，针对每一幅定量其与参照图像相关性的一个单一数值可能被计算。
一些实例中，将相关系数对时间作图，如图8中所示。这个示范是测定一份血浆样本的pt值，相关因子显示在垂直轴向上，其范围从0.0到最上端的1.0。时间显示在水平轴向上，其范围从0到最右侧的100秒。在小于凝血时间的范围内，图像与最后图像的相关性极差，可能是因为颗粒在对流和布朗弥散两种外力的作用下进行运动。凝血开始时，液体变形为凝胶状，颗粒位置被锁定。如图8所示，这个转型时相的标志是所计算出的相关因子显著增加，自凝血发生后，该颗粒位置不再发生明显变化，并与最终图像显著相关。在这个示范中，凝血出现时间看上去大约在40秒时。在自动设置时，一个乙状曲线可以拟合到数据中，用来估计指示凝血时间的拐点。
一些实例中，对稀释后样本所测定的凝血时间长于不使用稀释样本的其他方法所获的时间。通过使不同方法的结果相互联系，并应用一种数学相关性设计赋予稀释后样本一个与非稀释样本方法所测结果相等的结果，稀释后样本的测定结果可以与非稀释样本结果相一致。
视频成像考虑因素
一些实例中，视频图像被用来确定凝血时间。例如测定颗粒沉淀或光散射变化时，我们可能需要对一个反应容量的重要部分进行成像，而基本上除外所有的背景区域。这个目标可能通过使用结构识别软件来获得。
如图9，所示为检测比色杯900的图像。由于折射指数的不同905，对比色杯侧壁进行识别，并从图像910中排除。对反应容量的半月面也进行识别915，并从图像中排除920。最后切割成的图像920可能被用于图像分析。实例中，一幅切割后的图像可能是图像中的感兴趣区域(roi)。实例中，此处提供的图像切割操作哎可能用于静止图像。
凝血因子的测定
用于测定一种凝血因子浓度和(或)活性的方法、设备和系统也在此处提供。用于测定一种凝血因子浓度和(或)活性的方法可能以一个多元方式进行，或在一个能够进行多元化分析的设备或系统中进行，可选择地，这种多项检测通过一滴血来进行。一些方面，对来自研究对象的血液样本进行一个或多个凝血时间的检测，也可以针对凝血因子浓度和(或)功能进行一项或多项检测。一些方面，如果来自研究对象的血液样本的凝血时间超过了一个特定范围，那么来自研究对象的该血液样本还是会被进行凝血因子浓度和(或)功能的分析。该操作可以在一个系统或设备内进行，该系统或设备被程序化，如果一份血液样本有一个特定凝血时间时，即对一种凝血因子进行检测。该系统或设备的程序化还可能被遥控，例如通过云端计算设施。
特定的凝血参数可能通过依稀额方法来测定，而并非凝血时间。例如此处所描述的用于测定任何一种凝血因子和(或)调节因子浓度和(或)功能的方法、设备和系统。典型的凝血因子和(或)调节因子包括vonwillebrand因子、因子i(纤维蛋白原)、因子ia(纤维蛋白)、因子ii(凝血酶原)、因子iia(凝血酶)、因子v、因子va、因子vii、因子viia、因子viii、因子viiia、因子ix、因子ixa、因子x、因子xa、因子xi、因子xia、因子xii、因子xiia、因子xiii、因子xiiia、胶原、血小板、血小板激活因子、血小板因子4、血栓素a2、蛋白激酶c、磷脂酶a2、组织因子、高分子量激肽原、前激肽释放酶、激肽释放酶、c蛋白、血栓调节素、钙、维生素k、s蛋白、抗凝血酶、组织因子途径抑制剂(tfpi)、纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂(t-pa)、前列环素等等。在凝血因子专业术语中，小写字母“a”标识激活形式。例如因子xiia是因子xii的激活形式。一些实例中，此处所描述的方法可以鉴别凝血因子的激活和非激活形式。
一些实例中，内需额银子的浓度和(或)活性可能通过酶联免疫法(elisa)进行测定。实施elisa检测至少设计一种对特殊抗原有特异性的抗体(例如一个凝血因子)。含有未知数量抗原的样本被固定在一个固体支持物上，可以是非特异性的(通过吸收到表面上)也可以是特异性的(通过被同一个抗原的另一种特异性抗体所捕获,即“三明治”elisa)。抗原被固定后，向其中添加探测抗体，与该抗原形成一种复合物。该探测抗体可以与一种酶共价链接，或者通过共轭连接到一种酶上，第二抗体对自身进行探测。每一步操作之间，该固定物质都被一种温和的清洁剂进行洗涤以去除任何为特性结合的蛋白或抗体。在最后一次洗涤后，通过向该反应板中添加一种酶作用底物来产生一种可见信号，指示出样本中的抗原数量。使用小容量样本执行elisa反应的方法在诸如美国8,088,593中有所描述，并已按引用形式完全纳入本文中用于各种目的。如此处所述，使用小样本容量进行检测时，诸如elisa的比色法可能会从彩色成像和多条光通路中得到益处。
彩色成像和多条光通路
此处所描述的一个方面通过基于图像的分析提供凝血分析。该系统可以包括一个照相机，使用一个或多个探测光谱区域对一个光学信号进行测定。例如，一个照相机可以使用红色、绿色和蓝色探测光谱区域对一个光学信号进行测定。所测定的信号可以包括三个测定到的数值，可以通过一个或多个此处描述的法则对其进行解释。与使用单一探测光谱区域相比，使用多个探测光谱区域可以增加检测的动态范围，并增加测定值的准确性。
而且，此处所提供的是对样本和检测反应产物进行光学测定的系统、设备和方法，这些样本和检测反应产物位于一个反应室内，每一个都带有多个确切的路径长度。该反应室可以有多个确切的路径长度，这样可以观察或多或少的光吸收量。多个确切的路径长度允许提高所选检测常规的动态范围。反应室的图像可以按此处所述方法进行分析以获得样本或检测反应产物的信息。在一个单一反应室内使用多个有效的路径长度和三条通路探测光谱区域联合使用极大地提高了一个给定检测的动态范围。
计算机的启用
此处所描述的方法、设备和系统可能在一台程序化计算机的辅助下执行功能。例如，图像像素化、光散射数据的分析、图像处理和分析、视频图像处理方法等等都可能被编排到计算机内，并且(或者)由一台程序化的计算机实施。计算机辅助可能被首选同来获得一个快速、自动的方法、设备或系统。
例如，用于描述一种怀疑在一份样本中存在的反应底物的一种计算机辅助方法可能被使用。该计算机辅助方法可能包括获得一份样本的数字图像，其中该数字图像至少含有一个二维像素阵列，而且每一个像素含有多个密度值，每个密度值与一个明确的探测光谱区域相对应；在程序化设备的辅助下，将所获得的密度值与一个预先确定的定义每个探测光谱区域动态范围的数据组相联系；根据所获得的密度值与一个预先确定的数据组之间的相关性，预测样本中反应底物的表达并进行定量分析。
附加检测
此处所描述的方法、设备和系统可能用来对导致样本粘滞性或固态/液态状态发生变化的任何检测进行分析。例如此处所描述的，滚珠可能被添加到任何一个检测中从而导致样本的粘滞度或固态/液态状态发生改变；而对于该滚珠运动状态的图像分析可能被用来确定样本粘滞度或固态/液态状态发生改变的时间。此处所描述的其他示范中，一份样本浊度的改变可能通过光散射进行测定。任何导致样本的粘滞度或固态/液态状态发生改变，以及(或者)光散射发生改变的检测都可能通过此处所提供的方法进行测定。此处所描述的其他示范中，样本粘滞度或固态/液态状态的改变可能通过样本经过柱形的运动成像进行测定。可能通过此处所提供的方法进行分析的检测包括不涉及血液凝血因子，只要导致样本的粘滞度或固态/液态状态发生改变的检测。例如一些实例中，凝集检测可能通过此处所提供的方法进行分析。其他可能通过此处所提供的方法进行分析的检测包括：(1)血小板凝集检测；(2)浊度免疫检测；(3)颗粒增强的浊度免疫检测；(4)浊度分析免疫检测；(4)乳胶凝集免疫检测；以及(5)鲎变形细胞溶解物(lal)检测(例如用于探测细菌内毒素和细菌性疾病)。
示范
示范1-通过光散射测定pt值
通过光散射对pt凝血参数的测定使用以下材料进行：
·血浆样本：quikcoagtmcontrollevel1(正常血浆凝血对照)；quikcoagtmcontrollevel2(低度血浆凝血异常对照)；andquikcoagtmcontrollevel3(高度血浆凝血异常对照)(均来自加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)
·牛纤维蛋白原(sigma-aldrich)10mg/ml贮存在hepes缓冲盐水(hbs)中，ph7.4。
·重组pt试剂(quikcoagtm加钙pt，加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)
·1xhepes缓冲盐水(hbs)
·0.02mcacl2
这些物质用于以下操作，通过光散射测定pt凝血参数。所有步骤均在室温下进行，并使用一种自动液体处理机。
1)将纤维蛋白原在pbs内溶解为2.5mg/ml(溶液a)
2)将每一份0.2体积的血浆样本与0.8体积的溶液a相混合(例如每份血浆样本被稀释5倍)
3)t＝0点，将1体积的稀释后血浆与1体积的pt试剂混合，并用吸头抽吸2μl该混合液。
4)抽吸1μl矿物油，将吸头浸入矿物油中足够以覆盖观察区域。
5)移动相机/光学探测器，并开始视频录像。
6)凝血发生后停止录像(通常<10分钟)
7)重复步骤3-6四次
典型的结果显示在图10中。这里，凝血时间显示在垂直轴向，从0延伸至120秒。水平轴向的1、2、和3水平各自是quikcoagtmcontrollevel1、2和3的样本。每个水平中的5个不同点显示的是每个level1、2和3血浆样本复制检测的不同结果。显示在图形上的平均值表示以秒为单位的每个level1、2和3血浆样本5此复制检测的平均凝血时间。pt凝血参数通过光散射进行确定。简单地讲，为了确定凝血参数，来自录像的图像被进行自动处理，其中只含有反应混合液的感兴趣区域(roi)被界定。每个吸头内的感兴趣区域被界定为吸头侧壁之间以及吸头内反应混合液月状面之间的区域。上方的月状面是空气/反应混合液的交界面，而下方的月状面是反应混合液/矿物油的交界面。感兴趣区域界定完毕后，对决定录像中每一帧中roi内的平均光密度的分析法则进行确定。凝血时间被定义为roi内平均光密度开始上升超过进出水平时的时间。
示范2-通过光散射测定appt值
通过光散射对appt凝血参数的测定使用以下材料进行：
·quikcoagtmcontrollevel1(正常血浆凝血对照)；quikcoagtmcontrollevel3(高度血浆凝血异常对照)(均来自加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)
·牛纤维蛋白原(sigma-aldrich)10mg/ml贮存在hepes缓冲盐水(hbs)中，ph7.4。
·重组appt试剂(quikcoagtm加钙appt，加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)
·1xhepes缓冲盐水(hbs)
·0.02mcacl2
这些物质用于以下操作，通过光散射测定appt凝血参数。所有步骤均在室温下进行，并使用一种自动液体处理机。
1)将纤维蛋白原在pbs内溶解为5mg/ml(溶液a)
2)将每一份0.2体积的血浆样本与0.8体积的溶液a相混合(例如每份血浆样本被稀释5倍)
3)将1体积稀释后血浆和1体积appt试剂混合，并孵育3分钟。
4)t＝0时间点，将1μl混合液与1μl0.2mcacl2混合，并抽吸至吸头内。
5)抽吸1μl矿物油，将吸头浸入矿物油中足够以覆盖观察区域。
6)移动相机/光学探测器，并开始视频录像。
7)凝血发生后停止录像(通常<10分钟)
8)重复步骤3-7两次(水平3的样本)，或四次(水平1的样本)。
典型的结果显示在图11中。这里，凝血时间显示在垂直轴向，从0延伸至6:29。水平轴向的1和3水平各自是quikcoagtm对照水平1和3的样本。每个水平中的不同点显示的是1和3每个水平血浆样本复制检测的不同结果。appt凝血参数通过光散射进行确定，如示范1中所示。
示范3-通过滚珠沉淀测定pt值
通过滚珠沉淀对pt凝血参数的测定使用以下材料进行：
·血浆样本：quikcoagtmcontrollevel1(正常血浆凝血对照)；quikcoagtmcontrollevel2(低度血浆凝血异常对照)；andquikcoagtmcontrollevel3(高度血浆凝血异常对照)(均来自加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)
·重组pt试剂(quikcoagtm加钙pt，加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)
·滚珠均浆(例如直径25um和45um的滚珠混合物，多滚珠微球，polysciences，pa)，在hbs中洗涤、离心并去除过量的液体。
·1xhbs(hepes缓冲盐水，ph7.4)
·0.02mcacl2
这些物质用于以下操作，通过滚珠沉淀测定pt凝血参数。所有步骤均在室温下进行，并使用一种自动液体处理机。
1)每一份血浆样本用hbs稀释5倍。
2)将滚珠与pt试剂按1：4混合(例如10μl滚珠+40μlpt试剂)
3)t＝0时间点，将1μl稀释后的血浆与1.25μ滚珠/pt试剂混合液混合，并抽吸至吸头内。
4)抽吸1μl矿物油，将吸头浸入矿物油中足够以覆盖观察区域。
5)移动相机并开始视频录像。
6)凝血发生后停止录像(通常<10分钟)
7)重复步骤3-6一次以上(水平1的样本)，三次以上(水平2的样本)，或两次以上(水平3的样本)。
典型的结果显示在图12中。这里，凝血时间显示在垂直轴向，从0延伸至120秒。水平轴向的1、2、和3水平各自是quikcoagtmcontrollevel1、2和3的样本。每个水平中的不同点显示的是1和3每个水平血浆样本复制检测的不同结果。显示在图形上的平均值表示以秒为单位的每个level1、2和3血浆样本复制检测的平均凝血时间。通过滚珠沉淀检测对pt凝血参数进行确定，如此文其他地方所述。
示范4-通过滚珠沉淀测定aptt值
通过滚珠沉淀对aptt凝血参数的测定使用以下材料进行：
·血浆样本：quikcoagtmcontrollevel1(正常血浆凝血对照)；quikcoagtmcontrollevel2(低度血浆凝血异常对照)(均来自加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)
·重组appt试剂(quikcoagtm加钙appt，加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)
·滚珠均浆(例如直径25um和45um的滚珠混合物，多滚珠微球，polysciences，pa)，在hbs中洗涤、离心并去除过量的液体。
·1xhbs(hepes缓冲盐水，ph7.4)
·0.02mcacl2
这些物质用于以下操作，通过滚珠沉淀测定aptt凝血参数。所有步骤均在室温下进行，并使用一种自动液体处理机。
1)每一份血浆样本用hbs稀释5倍。
2)将滚珠与0.2mcacl2以1：1混合(例如10μl滚珠+10μl0.2mcacl2)
3)将1μl稀释后血浆和1μlappt试剂混合，并孵育3分钟。
4)t＝0时间点，将1μl混合液与1μl滚珠/0.2mcacl2混合，并抽吸至吸头内。
5)抽吸1μl矿物油，将吸头浸入矿物油中足够以覆盖观察区域。
6)移动相机并开始视频录像。
7)凝血发生后停止录像(通常<10分钟)
8)重复步骤3-7三次以上。
典型的结果显示在图13中。这里，凝血时间显示在垂直轴向，从0延伸至顶端的300秒。水平轴向的1和2水平各自是quikcoagtm对照水平1和2的样本。每个水平中的不同点显示的是1和2每个水平血浆样本复制检测的不同结果。通过滚珠沉淀检测对appt凝血参数进行确定，如此文其他地方所述。
示范5-通过荧光显微法测定aptt值
通过荧光显微法对aptt凝血参数的测定使用以下材料进行：
·血浆样本：quikcoagtmcontrollevel1(正常血浆凝血对照)；quikcoagtmcontrollevel2(低度血浆凝血异常对照)；andquikcoagtmcontrollevel3(高度血浆凝血异常对照)(均来自加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)
·重组appt试剂(例如quikcoagtm加钙appt，加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)
·1xhbs(hepes缓冲盐水，ph7.4)
·0.02mcacl2+体积浓度0.3％荧光滚珠(例如羧酸盐修饰后的荧光微球10μm，深红色荧光(625/645)lifetechnologies#f-8816)
这些物质用于以下操作，通过荧光显法测定aptt凝血参数。所有步骤均在室温下进行，使用自动化液体处理机。
·稀释血浆5倍(用hbs)
·向切片上添加1μl带荧光滚珠的cacl2
·聚焦物镜观察反应滴内切片表面上～20％
·将1μl稀释后血浆和1μlappt试剂混合，并孵育3分钟。
·在t＝0时间点向切片上cacl2/滚珠混合液滴内添加1μl该混合液，充分混匀并开始记录图像。
·凝血发生后停止录像(通常<10分钟)
示范6-通过荧光显微法测定pt值
通过荧光显微法对pt凝血参数的测定使用以下材料进行：
·血浆样本：quikcoagtmcontrollevel1(正常血浆凝血对照)；quikcoagtmcontrollevel2(低度血浆凝血异常对照)；andquikcoagtmcontrollevel3(高度血浆凝血异常对照)(均来自加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)
·重组pt试剂(加钙quikcoagtmpt，加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)+0.2％体积的荧光滚珠(例如羧酸盐修饰后的荧光微球10μm，深红色荧光(625/645)lifetechnologies#f-8816)
·1xhbs(hepes缓冲盐水，ph7.4)
·0.02mcacl2+体积浓度0.3％荧光滚珠(例如羧酸盐修饰后的荧光微球10μm，深红色荧光(625/645)lifetechnologies#f-8816)
这些物质用于以下操作，通过荧光显法测定pt凝血参数。所有步骤均在室温下，使用自动化液体处理机。
1)每一份血浆样本用hbs稀释5倍或10倍。
2)向切片上添加1.5μl带荧光滚珠的pt试剂
3)聚焦物镜观察反应滴内切片表面上～20％景深
4)t＝0时间点，将1.5μl稀释后血浆与滚珠/pt试剂在切片上混合，并开始记录视频图像
5)凝血发生后停止录像(通常<10分钟)
6)重复步骤4-5两次以上(水平1的样本)，三次以上(水平2的样本)，或四次以上(水平3的样本)。
典型的显微显像结果显示在图14中。这里，将带有血浆(10x稀释后)和pt激活因子的样本加注在样本孔内以后，进行样本图像的获取。在5秒1400、25秒1405、50秒1410和100秒1415时拍摄样本图像。50秒和100秒时的图像几乎是一样的，标识在50秒和100秒之间颗粒运动有限。这暗示出颗粒运动在50秒时或在50秒以前已被抑制。使用上述方法，图像分析被用来确定凝血时间
图15显示的通过荧光显微法对1：5稀释的血浆样本进行pt测定的典型结果。这里，凝血时间显示在垂直轴向，采用对数标尺，范围从10到1000秒。水平轴向的1、2、和3水平各自是quikcoagtm控制水平1、2和3的样本。每个水平中的不同点显示的是1、2和3每个水平血浆样本单独检测的不同结果。显示在图形上的平均值表示以秒为单位的每个水平1、2和3血浆样本复制检测的平均凝血时间。
示范7-通过光散射测定appt值
通过光散射对appt凝血参数的测定使用以下材料进行：
·含有肝素的人血浆
·牛纤维蛋白原(sigma-aldrich)10mg/ml贮存在hepes缓冲盐水(hbs)中，ph7.4。
·重组appt试剂(quikcoagtm加钙appt，加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)
·1xhepes缓冲盐水(hbs)
·0.02mcacl2
·猪肝素(源自猪肠道粘膜的肝素锂盐，sigmah0878)
这些物质用于以下操作，通过光散射测定appt凝血参数。所有步骤均在室温下进行，并使用一种自动液体处理机。
1)将纤维蛋白原在pbs内溶解为5mg/ml(溶液a)
2)已制备的含有不同肝素浓度的不同人血浆样本为制备这些样本，将肝素加入不同的人血浆分装样本中，以制成含有肝素浓度在0-1u/ml范围内的样本。
3)将每一份0.2体积的血浆样本与0.8体积的溶液a相混合(例如每份血浆样本被稀释5倍)
4)将5μl稀释后血浆和5μlappt试剂混合，并孵育3分钟。
5)t＝0时间点，将每份稀释后血浆/aptt试剂的混合液1μl与1μl0.2mcacl2混合，并抽吸至吸头内。
6)抽吸1μl矿物油到每个吸头内，将吸头浸入矿物油中足够以覆盖观察区域。
7)移动相机/光学探测器，并开始视频录像。
·凝血发生后停止录像(通常<10分钟)
典型的结果显示在图16中。这里，凝血时间按秒显示在垂直轴向上。不同血浆样本中的肝素浓度按u/ml显示在水平轴向上。经过一段时间后，通过对浊度的测定来确定凝血参数(浊度开始时间)，如示范1中所描述。
图16中级的检测剂量-反应曲线被校准仪提供肝素浓度的估计值。显示在图17中的结果进一步确认了该检测可以提供极好的，涵盖临床兴趣范围的肝素浓度结果。
处执行上述检测外，还可以通过helenacascadeaptt系统(helenalaboratories,beaumont,tx)，根据供应商提供的操作规程对该血浆样本实施的aptt检测。来自图16的数据进过校准后提供一个aptt的估计值，将该结果与helenacascadeaptt系统对同一份血浆样本所测定的结果相比较，将会获得以下相关性：aptt(目前方法)＝1.00*helenaaptt；r2＝0.82表明两种方法之间有很好的一致性。
通过helena法确定的凝血参数还与已知的肝素浓度有对应关系。以下是观察到的结果：y(helenaaptt)＝x(肝素浓度)*341+13.9；r2＝0.73与通过上述方法所测定的结果相比，其相关性较差。
示范8-通过光散射测定pt值
通过光散射对pt凝血参数的测定使用以下材料进行：
·含有edta的不同人血浆样本，包括接受华法林治疗的研究对象样本和未接受华法林治疗的研究对象样本。
·牛纤维蛋白原(sigma-aldrich)10mg/ml贮存在hepes缓冲盐水(hbs)中，ph7.4。
·1xhepes缓冲盐水(hbs)
·重组pt试剂(quikcoagtm加钙pt，加拿大新斯科舍省biomedicadiagnosticsinc.公司)(用于此处所示的检测)
·0.02mcacl2
这些物质用于以下操作，通过光散射测定pt凝血参数。所有步骤均在室温下进行，并使用一种自动液体处理机。
1)将纤维蛋白原在pbs内溶解为2.5mg/ml(溶液a)
2)将0.2体积的不同血浆样本与0.8体积的溶液a相混合(例如每份血浆样本被稀释5倍)
3)准备5μl稀释后血浆的分装样本
4)t＝0时间点，将每一份稀释后血浆5μl与5μlhelenalaboratories凝血酶原试剂(作为参照检测方法)或quikcoagtmpt加钙pt试剂(作为此处所述检测方法))相混合，抽吸2μl该混合液到吸头内。
4)抽吸1μl矿物油，将吸头浸入矿物油中足够以覆盖观察区域。
5)移动相机/光学探测器，并开始录像。
6)凝血发生后停止录像(通常<10分钟)
除执行上述检测外，还可以通过helenacascadept系统，根据供应商提供的操作规程对该血浆样本实施的pt检测。典型的结果比较显示在图18中。图中的每一点代表一个不同的样本。这里，pt(quikcoagtmpt加钙pt试剂)＝1.00(pthelenacascade)；r2＝0.92。
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