本发明专利涉及检测试剂
技术领域：
，具体涉及检测试剂领域，特别涉及一种抗缪勒氏管激素(amh)检测试剂。
背景技术：
：妇女生殖能力与年龄、基础卵泡刺激素、抑制素b(inhibinb，inhb)、抗缪勒氏管激素(antimμllerianhormone，amh)、雌二醇、窦卵泡数水平等多种因素相关，其中amh是最为重要的指标。amh是由二硫化物桥连接的两个72kd单链组成的糖蛋白二聚体，属于β-转化因子家族的一员；amh由睾丸未成熟的sertoli细胞及出生后卵巢生长卵泡的颗粒细胞分泌，具有调节细胞发育及分化，使雄性胚胎缪勒氏管退化的功能。对于女性，amh是在36周胎儿期的卵泡颗粒细胞生成，直至女性更年期，amh逐渐下降至无法检测水平。amh在临床上主要用于卵巢储备功能、预测卵巢反应性、男性生殖功能评估等。如上所述，amh在临床上主要用于评估女性的生殖功能，指导临床治疗。传统的amh检测试剂，都是基于双抗体夹心法所建立的各种免疫学方法，包括酶联免疫吸附法、化学发光法；但是，amh是具有独特结构的糖蛋白，其特异性高，灵敏度好的抗体非常难以获得；目前大部分的性能优异的amh抗体，均被国外几个企业垄断，显著限制了amh检测试剂的开发与技术的进步。为了解决存在的上述问题，需要提供一种技术，可灵敏、特异地检测amh，对生殖能力进行检测，使用方便。技术实现要素：本发明专利的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种抗缪勒氏管激素(amh)检测试剂，该抗缪勒氏管激素(amh)检测试剂通过amh抗体以及对糖蛋白有非特异性结合的麦胚凝集素(wga)形成夹心法，实现对样本中amh的检测，应用简便，成本低，并进一步提高生殖功能检测的准确性，检测结果为下一步准确治疗提供了有力依据，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，本发明专利的抗缪勒氏管激素(amh)检测试剂具有如下构成：一种抗缪勒氏管激素检测试剂，包括抗缪勒氏管激素抗体、麦胚凝集素和固相载体，将缪勒氏管激素抗体或麦胚凝集素二者之一包被在所述的固相载体上，另外一个则采用标记物进行标记。较优地，抗缪勒氏管激素抗体包被在固相载体上，并用标记物标记麦胚凝集素。较优地，麦胚凝集素包被在固相载体上，并用标记物标记抗缪勒氏管激素抗体。较优地，该抗体为缪勒氏管激素特异性的抗体，包括多克隆抗体与单克隆抗体。更优地，所述的缪勒氏管激素抗体为鼠抗缪勒氏管激素多克隆抗体、兔抗体缪勒氏管激素多克隆抗体、羊抗体缪勒氏管激素多克隆抗体、鸡抗体缪勒氏管激素多克隆抗体、鼠抗缪勒氏管激素单克隆抗体、兔抗体缪勒氏管激素单克隆抗体。较优地，抗缪勒氏管激素抗体的浓度为0.005ng/ml～1.5ng/ml。较优地，所述的麦胚凝集素为谷物的天然提取物，提取自裸麦麦胚、大麦麦胚、稻谷或小麦。更优地，所述的麦胚凝集素浓度为0.01ng/ml～5ng/ml。较优地，所述的固相载体为乳胶颗粒、硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯膜、微孔板或磁性颗粒中的一种或几种。较优地，所述的标记物为胶乳颗粒、胶体金、荧光、地高辛、生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯、吖啶酯衍生物、鲁米诺或其衍生物或三联吡啶钌中的一种或几种。本发明还提供一种抗缪勒氏管激素检测试剂，在制备检测抗缪勒氏管激素试剂盒中的应用。该抗缪勒氏管激素(amh)检测试剂，其特点是，包括amh抗体和麦胚凝集素(wga)形成的夹心法。在检测amh时，形成amh抗体-amh-wga的一个夹心结构。较优地，所述的检测标记物检测试剂为免疫层析法、免疫比浊法、elisa法、蛋白免疫印迹法、微流控法或化学发光法中的一种或几种。本发明还提供一种抗缪勒氏管激素(amh)检测试剂，该试剂应用了上述方法来检测抗缪勒氏管激素(amh)，用于辅助诊断生殖相关疾病。本发明的有益效果主要有：(1)原料来源充足：本发明专利的麦胚凝集素(wga)通过天然麦芽中可提取获得，成本低，产量高，且与amh的亲和力极强；(2)检测技术性能优异：麦胚凝集素(wga)的亲和力强，而amh抗体的特异性强；无需像传统方法(双抗体夹心法)，依赖特异性与亲和力均高的配对抗体；因此，该amh检测技术的性能优于大部分的双抗体夹心法的amh检测技术。因此，本发明专利可以通过amh抗体与wga配对形成夹心结构来检测amh，应用简便，并进一步提高生殖功能检测的准确性，检测结果为下一步准确治疗提供了有力依据，适于大规模推广应用。具体实施方式为了能够更清楚地理解本发明专利的技术内容，特结合具体实施例加以详细说明。本发明专利的amh检测技术的制备过程简述如下，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆技术实验室操作手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress，2005)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1荧光标记wga清洗：取荧光微球(购自bangslab，货号：11233)至离心管中，加0.1mmes(2-吗啉代乙磺酸)(ph5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1mmes(ph5.0)缓冲液重悬待用。活化并清洗：将活化剂edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)和荧光微球按照质量比比2:1:2的量进行活化，具体操作如下：称取edc、nhs加入0.1mmes(ph5.0)缓冲液中溶解，迅速取适量至清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1mmes(ph6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用。标记：将活化后的胶乳重悬至0.1mmes(ph6.5)缓冲液中，迅速分别加入wga(购自sigma-aldrich，货号：l9640，25mg)，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。封闭：取上述标记好的微球于13000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后13000rpm，20min，4℃离心，取上清待检。检测内容质量标准检测试剂包被量包被量≥160μgwga/mg微球bca蛋白浓度测定法清洗&重悬：加入重悬液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机13000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入重悬液，超声吹打重悬。重悬好的微球溶液做好标记，备用。实施例2荧光标记amh抗体清洗：取荧光微球(购自bangslab，货号：11233)至离心管中，加0.1mmes(ph5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1mmes(ph5.0)缓冲液重悬待用。活化并清洗：将活化剂edc、nhs和荧光微球按照质量比比2:1:2的量进行活化，具体操作如下：称取edc、nhs加入0.1mmes(ph5.0)缓冲液中溶解，迅速取适量至清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1mmes(ph6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用。标记：将活化后的胶乳重悬至0.1mmes(ph6.5)缓冲液中，迅速分别加入amh的抗体(鼠单抗，购自杭州博茵生物科技有限公司，货号：m050501，5mg)，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。封闭：取上述标记好的微球于10000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后10000rpm，20min，4℃离心，取上清待检。检测内容质量标准检测试剂包被量包被量≥110μg抗体/mg微球bca蛋白浓度测定法清洗&重悬：加入重悬液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机10000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入重悬液，超声吹打重悬。重悬好的微球溶液做好标记，备用。实施例3荧光标记羊抗兔igg抗体清洗：取荧光微球(购自bangslab，货号：11233)至离心管中，加0.1mmes(ph5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1mmes(ph5.0)缓冲液重悬待用。活化并清洗：将活化剂edc、nhs和荧光微球按照质量比比2:1:2的量进行活化，具体操作如下：称取edc、nhs加入0.1mmes(ph5.0)缓冲液中溶解，迅速取适量至清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1mmes(ph6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用。标记：将活化后的胶乳重悬至0.1mmes(ph6.5)缓冲液中，迅速分别加入羊抗兔igg(购自成都双龙生化，货号：j0711-6，1mg)，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。封闭：取上述标记好的微球于10000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后10000rpm，20min，4℃离心，取上清待检。检测内容质量标准检测试剂包被量包被量≥200μg抗体/mg微球bca蛋白浓度测定法清洗&重悬：加入重悬液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机10000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入重悬液，超声吹打重悬。重悬好的微球溶液做好标记，备用。实施例4结合垫的喷点wga结合垫的喷点方法如下：荧光标记溶液稀释：用荧光标记重悬液将上述制备的荧光标记wga结合物(来自实施例1)以及荧光标记羊抗兔igg结合物(来自实施例3)混合后稀释2倍；设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为8μl/cm；1号管道为喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于荧光标记重悬溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将结合垫按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“go”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的结合垫，喷点的荧光标记wga条带均匀、连续和贯通整个结合垫的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片结合垫，按一次控制面板上的“go”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的结合垫置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。实施例5结合垫的喷点抗amh的抗体结合垫的喷点方法如下：荧光标记溶液稀释：用荧光标记重悬液将上述制备的荧光标记抗体(来自实施例2)以及荧光标记羊抗兔igg结合物(来自实施例3)混合后稀释4倍；设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为8μl/cm；1号管道为喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于荧光标记重悬溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将结合垫按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“go”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的结合垫，喷点的荧光标记wga条带均匀、连续和贯通整个结合垫的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片结合垫，按一次控制面板上的“go”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的结合垫置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。实施例6硝酸纤维素膜的制备(amh抗体)amh的抗体(鼠单抗，购自杭州博茵生物科技有限公司，货号：m050501，5mg)硝酸纤维素膜制备方法如下：取鼠抗amh的单抗500μg，加到5ml刻度离心管中，抗体稀释液至1ml，容器标记t标志。取兔igg(购自杭州博茵生物科技有限公司，货号：p200201，规格：5mg/ml)25μl，加到5ml刻度离心管中，抗体稀释液至1ml，容器标记c标志。设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为1μl/cm；1号管道为检测带喷点通道，2号管道为对照带喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于检测带溶液中，将2号管道置于对照带溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将硝酸纤维素膜按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“go”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的硝酸纤维素膜，检测带和对照带为两条均匀、连续和贯通整个硝酸纤维素膜的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片硝酸纤维素膜，按一次控制面板上的“go”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的硝酸纤维素膜置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。实施例7硝酸纤维素膜的制备(wga)wga硝酸纤维素膜制备方法如下：取wga200μg(购自sigma-aldrich，货号：l9640，25mg)，加到5ml刻度离心管中，稀释至1ml，容器标记t标志。取兔igg(购自杭州博茵生物科技有限公司，货号：p200201，规格：5mg/ml)25μl，加到5ml刻度离心管中，抗体稀释液至1ml，容器标记c标志。设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为1μl/cm；1号管道为检测带喷点通道，2号管道为对照带喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于检测带溶液中，将2号管道置于对照带溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将硝酸纤维素膜按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“go”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的硝酸纤维素膜，检测带和对照带为两条均匀、连续和贯通整个硝酸纤维素膜的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片硝酸纤维素膜，按一次控制面板上的“go”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的硝酸纤维素膜置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。实施例8组装将底板上较宽部分的保护纸除去，沿上面保护纸的下边缘，将划好线的硝酸纤维素膜(来自实施例6)，以c线在上方的方式贴到底板板上；将结合垫(来自实施例4)贴在t线下方，与nc膜少许接触；将样品垫贴在结合垫下方，与结合垫少许接触；接着除去上方保护纸，将吸水纸贴在nc膜的上方，与nc膜少许接触；将保护纸及指示带纸逐一贴在组装好的试纸条外面，组装成大卡。实施例9组装将底板上较宽部分的保护纸除去，沿上面保护纸的下边缘，将划好线的硝酸纤维素膜(来自实施例7)，以c线在上方的方式贴到底板板上；将结合垫(来自实施例5)贴在t线下方，与nc膜少许接触；将样品垫贴在结合垫下方，与结合垫少许接触；接着除去上方保护纸，将吸水纸贴在nc膜的上方，与nc膜少许接触；将保护纸及指示带纸逐一贴在组装好的试纸条外面，组装成大卡。实施例10切条接通切割机电源，设定切膜程序，设定切割宽度为4mm；将大卡(来自实施例8或实施例9)平放入切割机平台轨道中，正面朝上，按操作面板上“go”键，开始切割；每放一片大卡合格品，按操作面板上“go”键一次，直至切割完所有大卡合格品；切割完成后，将试纸条并列黏贴于底板上，组成检测试纸条。实施例11试剂盒组装将上述的试纸条(来自实施例10)装入卡盒中，形成检测卡。取铝箔袋和干燥剂；打开热封机，预热；将待装袋的检测卡、1袋干燥剂装入铝箔袋中；按照规定的长度切断装有检测卡和干燥剂的铝箔袋；用热封机封好铝箔袋；贴上标签。实施例12hrp标记amh抗体将5mghrp(购自罗氏，货号：1464325，规格：25mg/瓶)溶于0.5ml0.1mnahco3溶液中；加0.5ml10mmnaio4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；加0.75ml0.1mna2co3混匀；加入0.75ml抗体(鼠单抗，购自杭州博茵生物科技有限公司，货号：m050501，5mg)，混匀。hrp抗体的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融。实施例13hrp标记wga将5mghrp(购自罗氏，货号：1464325，规格：25mg/瓶)溶于0.5ml0.1mnahco3溶液中；加0.5ml10mmnaio4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；加0.75ml0.1mna2co3混匀；加入0.75mlwga(购自sigma-aldrich，货号：l9640，25mg)，混匀。hrp标记wga结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融。实施例14amh抗体包被采用0.01m，ph10的cbs(碳酸盐缓冲液)将amh抗体(鼠单抗，购自杭州博茵生物科技有限公司，货号：m050501，5mg)稀释至1μg/ml；取96孔微孔板，每孔加入100μl上述包被抗体；37℃温育1h；甩掉包被液，加入200μl的封闭缓冲液(2％牛血清白蛋白，ph7.4)，37℃温育1h，甩掉封闭液；于室温自然干燥12h，放入干燥剂，封入铝箔袋，2～8℃备用。实施例15wga包被采用0.01m，ph10的cbs(碳酸盐缓冲液)将wga(购自sigma-aldrich，货号：l9640，25mg)稀释至0.2μg/ml；取96孔微孔板，每孔加入100μl上述包被wga；37℃温育1h；甩掉包被液，加入200μl的封闭缓冲液(2％牛血清白蛋白，ph7.4)，37℃温育1h，甩掉封闭液；于室温自然干燥12h，放入干燥剂，封入铝箔袋，2～8℃备用。实施例16elisa试剂盒组装将hrp标记amh抗体(来自实施例12)与wga包被板(来自实施例15)，组装成amh检测的elisa试剂盒。实施例17elisa试剂盒组装将hrp标记wga(来自实施例13)与amh抗体包被板(来自实施例14)，组装成amh检测的elisa试剂盒。实施例18试剂盒检测amh将上述的检测卡(来自实施例11)，用临床样本进行验证。将待测样本滴加到检测卡的样本孔中，然后置于荧光检测仪中进行读数。检测结果与amh检测的金标准(贝克曼化学发光法)如下：贝克曼化学发光法阳性贝克曼化学发光法阴性合计检测卡检测阳性76379检测卡检测阴性5134139合计81137218根据上表可得：该试纸条的检测灵敏度为：76/(76+5)×100％＝93.83％；该试纸条的检测特异性为：134/(134+3)＝97.81％。实施例19试剂盒检测amh将上述的包被板(来自实施例17)，用临床样本进行验证。将待测样本滴加到包被板的样本孔中，然后置于酶标分析仪中进行读数。检测结果与amh检测的金标准(贝克曼化学发光法)如下：贝克曼化学发光法阳性贝克曼化学发光法阴性合计包被板检测阳性80282包被板检测阴性1135136合计81137218根据上表可得：该试剂盒的检测灵敏度为：80/(80+1)×100％＝98.77％；该试剂盒的检测特异性为：135/(135+2)＝98.54％。上述实施例结果表明，本检测试剂盒检测amh的准确率非常高，能够满足临床应用的要求。本实施例制备的的试剂可以通过amh抗体与wga建立的夹心法amh检测技术，特异性、灵敏度均较高；可显著提高生殖功能检测的准确性，并可以根据amh的检测结果，进行针对性更强的治疗方案。因此，本发明提供的amh检测技术，应用简便，并进一步提高生殖功能检测的准确性，适于大规模推广应用。在此说明书中，本发明专利已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明专利的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。当前第1页12