结肠癌诊断标志物及其应用的制作方法

本发明属生物检测技术领域，具体涉及一种结肠癌诊断标志物及其应用。

背景技术：

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处，以40-50岁年龄阶段发病率最高，是西欧、北美等发达国家最常见的恶性肿瘤，也是我国九大常见恶性肿瘤之一。近30年来，我国结肠癌的发病率呈上升趋势。结肠癌的发病与社会环境、生活方式，尤其是高脂肪低纤维素饮食、体力活动缺乏等有一定的关系。在结肠癌的发生发展过程中，肿瘤细胞无限增殖，通过改变机体正常代谢获得大量原料以满足自身生长，从而导致机体代谢发生紊乱，严重者导致死亡。近年来研究发现，肿瘤细胞代谢异常主要表现在糖代谢、核苷代谢、氮基酸代谢及脂代谢等，其代谢产物可在体液中检测分析，因此，小分子代谢组学在结肠癌的早期诊断与治疗中，具有重要意义。

目前，结肠癌的最可靠的诊断方法仍为结肠镜取活组织检查，或依靠x线造影、ct扫描等，此类检查对患者创伤较大，对仪器设备的要求也较高。适用于结肠癌预测的标志物主要有血清癌胚抗原(cea)等，但经日渐广泛应用及进一步分析，发现在胃癌(49％～60％)、肺癌(52％～77％)、乳癌(30％～50％)，胰腺(64％)、甲状腺(60％)及膀胱等肿瘤亦存在cea，检测缺乏特异性。近年来，基因检测、核素诊断等方式也逐渐兴起，但仍有操作复杂、成本大、侵入性强、难以进行大规模人群筛选等缺点。因此，需要新适用于大规模筛选的非侵入性检测的结肠癌检测标志物。

目前，肿瘤代谢已经成为医药行业备受关注的临床研究课题。肿瘤作为一种系统性疾病，机体内代谢谱的改变可以反映在生物体液以及组织中。研究发现，癌细胞的代谢过程中，为了支持自身高增殖率，癌细胞需要额外的营养物质，并且最终将这些营养物质用于新生物质的合成，也会产生异常的代谢。肿瘤细胞代谢异常主要表现在糖代谢、核苷代谢、氮基酸代谢及脂代谢等，其代谢产物可在体液中检测分析。而代谢组学，作为系统生物学的一个重要研究领域，可通过鉴定一种或一组生物标志物而协助癌症早期检测和诊断的潜力。

目前，多数代谢组学研究样本为血清或组织样本水平的检测，样本获取难度较高，不适用于疾病的早期筛查。尿液作为机体多种生物流体物质中最方便、最快捷且完全无创，可大量获取的一种体液类型，无需专业人员指导协助，普通人即可自行获取样本。同时，它又是多种代谢反应最终产物的集合，在一定程度上能够反映人体的基础代谢水平。因此，尿液代谢组学的发展，为结肠癌在内的多种癌症的标志物的发现提供了可能性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种结肠癌诊断标志物及其应用，该结肠癌标志物存在于尿液中，适用于大规模筛查的非侵入性检测；而该标志物的检测试剂盒，便于结肠癌的大规模筛查，可大幅提高筛查的准确性与实用性，促进方法的标准化。

上述目的是通过以下技术方案得以实现的：本发明公开了结肠癌诊断标志物，所述标志物为尿液代谢物，包括假尿嘧啶核苷、n2,n2-二甲基鸟嘌呤核苷、犬尿氨酸、缬氨酸、n-乙酰基l-缬氨酸、n-乙酰基-l-谷氨酸、5-羟基色氨酸、α,β-双脱氢色氨酸、马尿酸、天冬氨酰基-苯丙氨酸、牛磺酸、泛酸、2,3吡啶二甲酸、4-吡哆酸、l-肉碱、黄嘌呤中的至少一种。

所述的结肠癌诊断标志物在制备结肠癌检测试剂中的应用。

一种检测结肠癌的试剂盒，该试剂盒含有检测尿液中结肠癌诊断标志物的试剂，所述标志物为尿液代谢物，包括假尿嘧啶核苷、n2,n2-二甲基鸟嘌呤核苷、犬尿氨酸、缬氨酸、n-乙酰基l-缬氨酸、n-乙酰基-l-谷氨酸、5-羟基色氨酸、α,β-双脱氢色氨酸、马尿酸、天冬氨酰基-苯丙氨酸、牛磺酸、泛酸、2,3吡啶二甲酸、4-吡哆酸、l-肉碱、黄嘌呤中的至少一种。

进一步地，该试剂盒含有检测尿液中结肠癌诊断标志物的试剂，所述标志物为尿液代谢物，包括假尿嘧啶核苷、n2,n2-二甲基鸟嘌呤核苷、犬尿氨酸、缬氨酸、n-乙酰基l-缬氨酸、n-乙酰基-l-谷氨酸、5-羟基色氨酸、α,β-双脱氢色氨酸、马尿酸、天冬氨酰基-苯丙氨酸、牛磺酸、泛酸、2,3吡啶二甲酸、4-吡哆酸、l-肉碱和黄嘌呤。

进一步地，该试剂盒中含有采用色谱法、质谱法或色谱-质谱联用法检测尿液中结肠癌诊断标志物的试剂。

进一步地，该试剂盒还含有被所述标志物的标准品，所述标准品为各标志物的化学单体或混合物。借助标准品可对尿液样本中的代谢标志物进行快速准确地定性、定量分析。试剂盒有助于实现检测标准化，提高检测准确性和重现性。

进一步地，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法、高效液相色谱法。

进一步地，所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法-质谱联用。

进一步地，所述试剂盒所适用的检测样本为受检者的尿液样本，优选为受试者空腹晨尿中段。

本发明的优点：

(1)本发明所述尿液代谢物组合作为结肠癌标志物，具有很好的灵敏度和特异性。roc曲线评价方法中，roc曲线下的面积值auc在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。auc在0.5～0.7时有较低准确性，auc在0.7～0.9时有一定准确性，auc在0.9以上时有较高准确性。经验证，本发明提供的代谢标志物单个用于区分结肠癌病人与正常人时，auc均在0.6以上；多个联合应用时，auc比单个更接近于1，区分效果更好；多个联合应用时，auc最接近于1，诊断效果最好。因此，本发明所述尿液代谢物组合具有很好的临床应用价值。

(2)本发明所采用检测样品为尿液，避免采用组织、血液样品时带给患者肉体痛苦。操作简单、耗时少。

(3)本发明提供的检测试剂盒可以用于结肠癌筛查，提高检测便利性，促进检测方法标准化。

附图说明

图1、16个标志物联合诊断模型区分结肠癌病人与正常人的诊断散点图。

图2、16个标志物联合诊断模型区分结肠癌病人与正常人的roc曲线图。

具体实施方式

结合具体实施例，进一步阐明本发明。下列实施例中使用的仪器或试剂未做详细说明的均为常规仪器和试剂；未具体描述的试验操作方法均为本领域普通技术人员公知的常规操作方法。

实施例1

结肠癌患者与健康人之间尿液差异代谢物的筛选

1、尿液样本的收集及分组：

由中国药科大学生物医学工程实验室按照预先的实验设计，采集32例结肠癌患者尿液与58例健康人尿液样本，依据规范、合理的操作流程采集，严格遵循相关科研伦理要求并对志愿者进行知情同意及告知。采集志愿者晨起中段尿10ml并立即分装(每管0.5ml)于-80℃冰箱冻存。

2、主要试剂及仪器

色谱纯试剂乙腈、甲酸、甲醇购自德国merck公司，假尿嘧啶核苷、n2,n2-二甲基鸟嘌呤核苷、犬尿氨酸、缬氨酸、n-乙酰基l-缬氨酸、n-乙酰基-l-谷氨酸、5-羟基色氨酸、α,β-双脱氢色氨酸、马尿酸、天冬氨酰基-苯丙氨酸、牛磺酸、泛酸、2,3吡啶二甲酸、4-吡哆酸、l-肉碱、黄嘌呤，购自美国sigmaaldrich公司。快速高分辨液相色谱仪(uplc，agilent1290，usa)；色谱柱：inertsilods-3c18柱(日本shimadzu公司)；四极杆/飞行时间质谱检测器(agilent6530q-tof/ms，usa)。

3、样品制备

实验前将尿液样本在4℃冰箱中解冻后，置于冷冻离心机中于13000rpm离心15min，移取上清液450μl进样分析。为了监测实验系统的稳定性及重现性，从所有样品中各取5μl制成混合尿液样品，并按照实际尿液样品的前处理方法制备成质量控制(qualitycontrol,qc)样品；同时，每个样品中加入10μl浓度为10μg/ml的2-氯-l-苯丙氨酸甲醇溶液，以此为内标来矫正仪器及其它系统误差。

4、仪器设定方法

快速高分辨液相色谱仪：配g1315ddad检测器、g1312a二元泵、g1322a真空脱气机、g1367b自动进样器、g1316a柱温箱，dad检测器检测波长为254nm、220nm；

色谱柱：inertsilods-3c18柱，其尺寸为250mm×4.6mm，i.d.5μm(日本shimadzu公司)；

流动相：a相为水，b相为乙腈(分别含0.1％甲酸)；

流速：1ml/min；

柱温：25℃；

进样体积：10μl。

线性梯度洗脱条件如下：

(2)四极杆/飞行时间质谱检测器：esi离子源，采用agilentmasshunterqualitative4.0软件进行数据在线采集，采用agilentmasshunterqualitative6.0软件进行离线数据处理。详细质谱条件如下：

干燥气：氮气，温度325℃，流速12l/min，雾化气压35psi；

毛细管电压：+4000v；

碎裂电压：100v；

分离器电压：60v；

质量采集范围：50-1000da。

5、数据处理及分析

采用多维变量统计分析，可在最大程度保留原始信息的基础上将高维复杂的数据进行“简化和降维”，建立可靠的数学模型对研究对象的代谢谱特点进行总结和归纳。将经xcms处理后获得的分子量/保留时间和峰面积信息二维数据矩阵导入simca-p软件中，首先对所有变量采用无监督的主成分分析(pca)，观察各组数据的聚类情况并去除离群值，最后采用正交偏最小二乘法判别分析(pls-da)模型进行有监督的数据分析，放大组间差异，以获得最显著的组间分离。

通过hmdb(http：//www.hmdb.ca/)和metline(http：//metlin.scripps.edu/)等数据库进行物质结构的检索，利用数据库中提供的精确分子量和质谱所得的ms/ms图谱初步鉴定上述差异代谢物的结构。最终通过购买标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级ms裂解谱比对，确证差异代谢物的结构，并配制已知浓度的系列标准品溶液，通过标准曲线进一步确定差异代谢物含量。

6、结果

按照上述思路，最终鉴定出16个区分肿瘤病人与健康对照组的差异代谢物，其中包括2个核苷类代谢物(假尿嘧啶核苷、n2,n2-二甲基鸟嘌呤核苷)，9个氨基酸代谢物(犬尿氨酸、缬氨酸、n-乙酰基l-缬氨酸、n-乙酰基-l-谷氨酸、5-羟基色氨酸、α,β-双脱氢色氨酸、马尿酸、天冬氨酰基-苯丙氨酸、牛磺酸)、1个维生素类代谢物(泛酸)、2个吡啶类代谢物(2,3吡啶二甲酸、4-吡哆酸)、1个肉碱类代谢物(l-肉碱)、1个嘌呤类代谢物(黄嘌呤)。

实施例2

构建roc曲线比较16个标志物区分结肠癌患者与健康人的能力

采用spss软件进行二元logistic回归，将各代谢标志物水平设为协变量，组别设为因变量，回归方法为直接进入。所有变量引入回归模型后，根据回归系数(b)得到疾病发生的logistic预测最优模型的回归方程。通过logistic回归公式得出各受试样本的肿瘤发生概率p值后，继续对概率p值进行受试者工作特征分析。选取0-1范围内不同值作为临界p值，将上述受试样本计算得出的p值与该临界p值进行比较，计算得出该临界值下对于肿瘤发生的预测灵敏度和特异性，并绘制受试者工作曲线(roc曲线)。根据roc曲线，评估上述回归模型对于疾病发生的预测效能，同时确定诊断的最佳临界值(0.350)。

受试者工作曲线(roc)法进行验证，通过结肠癌患者与健康人尿液中16个差异代谢产物的表达水平判断其用于诊断结肠癌的能力。结果表明，使用单个差异代谢物区分结肠癌与健康人样本时，最佳诊断模型中auc最高为0.81，而联合多种差异代谢物时，auc、特异性与灵敏度均有所提高，而联合本发明所述16个差异代谢物时，其最佳诊断模型中的auc达0.95，特异性和灵敏度分别为93.0％和87.5％，其诊断性能最佳。各代谢物单独用于区分结肠癌与健康人的auc如表1所示。联合任意3-15个以及16个代谢物时，其auc如表2所示。

联合16个差异代谢物区分结肠癌与正常人时，其散点图与roc曲线如图1和图2所示。

表1单个差异代谢产物用于区分结肠癌病人与正常人的auc

表2抽取任意差异代谢产物组合用于区分结肠癌病人与正常人的auc

实施例3

16种标志物在结肠癌筛查中的应用

另选取20例病理检测确诊为结肠癌的患者尿液与20例正常人的尿液样本，按照实施例1所述方法对样品进行制备，并通过lc-mc对尿液样本代谢物进行定性与定量测定。本实施案例中，选择诊断效能最佳的16种标志物组合。将16种标志物的定量数据带入由实施例2所得的logistic预测最优模型的回归方程中，根据算得的logit(p)值与截断值的大小判断样本的阴性与阳性，若logit(p)值高于截断值，则判断为阳性(结肠癌)，反之，则判断为阴性(正常人)。共计40例样本诊断结果如表3所示。

表316种标志物组合联合诊断结肠癌的结果

从表3可以看出，16种标志物组合对结肠癌具有较好的筛查性能，可对结肠癌进行较为准确的判断，其对40例样本的检测特异性为90.0％，灵敏度为80.0％，阳性预测值为88.9％，阴性预测值为81.8％。

实施例4

基于本发明的结肠癌标志物检测试剂盒的制备

基于本发明的16个与结肠癌相关的代谢标志物，设计了结肠癌检测试剂盒，该试剂盒包括如下成分

标志物的标准品：假尿嘧啶核苷、n2,n2-二甲基鸟嘌呤核苷、犬尿氨酸、缬氨酸、n-乙酰基l-缬氨酸、n-乙酰基-l-谷氨酸、5-羟基色氨酸、α,β-双脱氢色氨酸、马尿酸、天冬氨酰基-苯丙氨酸、牛磺酸、泛酸、2,3吡啶二甲酸、4-吡哆酸、l-肉碱、黄嘌呤中的至少一种，检测试剂盒可以包含其中一种、或者任意多种、或者16种标志物的标准品，可以根据需求进行组合。当涉及一种以上标志物的标准品时，可以将各个标志物的标准品单独封装，也可以将各个标志物的标准品混合制成混合物封装。

尿液代谢物提取溶剂：100％乙腈和20％乙腈水溶液(用于uplc-q/tof-ms样品制备)；比例为2.5∶1∶1的甲醇、氯仿和水的混合溶液、甲氧胺吡啶和n-甲基-n-三甲基硅基三氟乙酰胺(用于gc-q/ms样品制备)；uplc-q/tof-ms筛选表征中，20％乙腈水溶液可以用作溶解标准品的溶剂；gc-q/ms筛选表征中，用尿液代谢物提取溶剂按样品制备的方法制备标准品溶液；

内标：2-氯-l-苯丙氨酸。

应用过程：收集受试者晨起中段尿10ml并立即分装(每管0.5ml)于-80℃冰箱冻存。实验前将尿液样本在4℃冰箱中解冻后，置于冷冻离心机中于13000rpm离心15min，移取上清液450μl进样分析。为了监测实验系统的稳定性及重现性，从所有样品中各取5μl制成混合尿液样品，并按照实际尿液样品的前处理方法制备成质量控制(qualitycontrol,qc)样品；同时，每个样品中加入10μl浓度为10μg/ml的2-氯-l-苯丙氨酸甲醇溶液，以此为内标来矫正仪器及其它系统误差。

按照实施例1的lc-ms仪器设定方法对处理后的尿液样本进行分析，并参照实施例1数据处理方法对标志物进行定量与定性分析。

使用此结肠癌检测试剂盒时，建议同时检测16个标志物，以进一步提高检测效能。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的不足，且具高度产业利用价值。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。