氧化型硫代辅酶I在均相酶免疫诊断试剂中的应用的制作方法

本发明涉及体外诊断检测
技术领域：
，尤其涉及氧化型硫代辅酶i在均相酶免疫诊断试剂中的应用。
背景技术：
：nadp是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadeninedinucleotidephosphate)的缩写，曾称为三磷酸吡啶核苷酸(tpn)或辅脱氢酶ⅱ或氧化型辅酶ⅱ。它是是烟酸酰胺腺嘌呤二核苷酸与一个磷酸分子以酯键结合的物质，广泛存在生物界。其化学性质、吸收光谱以及氧化还原形式等均类似于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)依赖型氧化还原酶具有重要生理功能，但难以选择性研究；同时，相应氧化还原反应需消耗化学计量的辅酶，成为大规模应用的瓶颈，侯淑华等(侯淑华.nadp+类似物的合成及作为辅酶的性质研究[j].中国科学院大连化学物理研究所,2011.)研究了nad类似物的物理化学和生物学性质表明，nad类似物保持了nad的氧化还原特性。均相酶免疫均相酶免疫诊断试剂(比如甘胆酸试剂)，整个反应发生在一个液相均相体系中，样本中游离的甘胆酸与葡萄糖六磷酸脱氢酶-甘胆酸偶联物竞争性结合抗甘胆酸特异性抗体位点。在抗体量固定时，样本中游离的甘胆酸越多，则竞争结合的抗体越多，而与抗体结合的酶标偶联物就越少。游离出来的甘胆酸酶标偶联物催化氧化型辅酶ii(nadp)转化为还原型辅酶ii(nadph)，样本中的甘胆酸浓度与nadph的生成量成正比，通过340nm吸光值的变化即可计算出甘胆酸的含量。甘胆酸(cholyglycine,cg)是由胆酸和甘氨酸结合型的胆酸之一，当肝细胞受损时，肝细胞摄取胆酸能力下降，致使血中含量增加。甘胆酸测定是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一，也是检测胆汁郁积和早期酒精肝损伤的重要指标。同时，甘胆酸的检测对于诊断妊娠期肝内胆汁淤积症也具有重要的临床意义(王微,虞留明,朱学源.甘胆酸检测在肝胆疾病临床诊断中的意义[j].中华临床医师杂志,2014,8(15):2861-2865.)。3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(cmpf)是一种内源性的呋喃脂肪酸代谢产物，是主要的尿毒症毒素之一，属于蛋白结合类毒素。与非糖尿病个体相比，cmpf在妊娠糖尿病和2型糖尿病患者的血液中显著增加。kaceyprentice等(prenticek,luul,allistere,etal.thefuranfattyacidmetabolitecmpfiselevatedindiabetesandinducesβcelldysfunction[j].cellmetabolism,2014,19(4):653-666.)实验研究表明cmpf可直接作用于β细胞，它通过有机阴离子转运蛋白3(oat3)进入β细胞，一旦进入细胞，就会引起线粒体功能受损，减少葡萄糖诱导的atp积累，并诱导氧化应激，导致关键转录因子失调，最终减少胰岛素的生物合成，继而造成糖尿病的产生。因此，cmpf水平的检测对于及早预防及检测糖尿病具有重要意义。目前，血清中甘胆酸的检测主要有：放射免疫分析法(ria)、化学发光免疫分析法(clia)、酶联免疫吸附法(elisa)等。而检测血清中cmpf含量所公开的方法较少，目前研究者大都采用高效液相色谱及质谱法来检测其含量，但该方法需用到高端精密仪器。近年来对这两种化合物也有使用均相酶免疫法，但是在均相酶免疫法均相酶免疫诊断试剂(比如甘胆酸试剂以及cmpf试剂)中，由于氧化型辅酶ii(nadp)的4℃和37℃稳定性较差，导致试剂稳定性也不好，试剂检测结果准确度和重复性较差；另外，在临床检测过程中发现，溶血的样本的值偏低，甚至有大量负值的出现，这是由于氧化型辅酶ii(nadp)抗血红蛋白干扰的能力较差导致的。技术实现要素：本发明是为了克服现有技术中的甘胆酸试剂以及cmpf试剂其中所含的氧化型辅酶ii(nadp)的稳定性较差，进而导致整体试剂在检测结果准确度和重复性方面较差，以及抗血红蛋白干扰的能力较差的缺陷。因此，本发明的第一个发明目的在于，通过将均相酶免疫诊断试剂中的氧化型辅酶ii(nadp)用氧化型硫代辅酶i(辅酶类似物)进行替代，有效解决均相酶免疫诊断试剂稳定性较差的问题，改善试剂检测结果的重复性，提高检测结果的准确度。本发明的第二个发明目的在于，提高试剂的抗血红蛋白干扰能力，减弱临床样本溶血现象对检测结果的影响。本发明的第三个发明目的在于，提升均相酶免疫诊断试剂的可检测性，使得测试试剂适用于常规酶标仪，会更加便捷，节约试剂和原料的用量。为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：氧化型硫代辅酶i在均相酶免疫诊断试剂中的应用，所述的均相酶免疫诊断试剂为甘胆酸检测试剂以及cmpf试剂。现有技术中的甘胆酸检测试剂以及cmpf试剂使用的通常含有nadp，但是在试验过程中发现，其在4℃和37℃稳定性较差，导致试剂稳定性不足，最终表现出检测结果准确性较低以及重复性较差的缺陷。而本发明中使用的氧化型硫代辅酶i(thio-nad)为辅酶类似物中的一种，通过将其替代氧化型辅酶ii(nadp)，借助于氧化型硫代辅酶i(thio-nad)具有良好的稳定性，将其加入到均相酶免疫诊断试剂中，能够有效改善原本nadp热稳定性不足的缺陷，进而提升整体均相酶免疫诊断试剂的热稳定性。同时由于氧化型硫代辅酶i(辅酶类似物)具有良好的抗血红蛋白干扰能力，减弱了临床样本溶血现象对检测结果的影响。本发明中的均相酶免疫诊断试剂的检测波长由340nm变为405nm，其检测波段更加常规，使用常规的酶标仪即可进行检测，无需使用昂贵的酶标仪进行检测，检测成本有效降低，检测更加便捷的同时更节约了试剂以及原料。作为优选，所述的甘胆酸试剂以及cmpf试剂中均包括试剂r1、试剂r2、校准品以及质控品，所述的试剂r1中含有氧化型硫代辅酶i。作为优选，所述的甘胆酸试剂中的试剂r1以及试剂r2的配制方法如下：(1-1)准确称量配制(30-70)mm的tris缓冲液1l，充分溶解混合均匀后，调节ph为6.0-7.0；(1-2)取步骤1-1中缓冲液800ml，依次加入(4-5)mm的g6p，0.05％的pc-300，(1.2-2.0)ku/l的甘胆酸单克隆抗体，充分溶解混合均匀后备用；(1-3)取步骤1-2中溶液400ml，加入(4-6)mm的氧化型硫代辅酶i(辅酶类似物)，混合均匀，4℃平衡放置过夜后备用，标记为r1；(1-4)取步骤1-1中缓冲液200ml，依次加入(0.15-0.2)％bsa，(1.5-2)％nacl，0.05％pc-300，(0.5-0.6)ku/l葡萄糖六磷酸脱氢酶-甘胆酸偶联物标记为r2。作为优选，所述的甘胆酸试剂中的校准品以及质控品的配制方法如下：(2-1)称量(0.7-0.9)％的nacl，(0.05-0.06)％的pc-300，用纯化水溶解，配制为甘胆酸校准品质控品专用稀释液备用；(2-2)准确称量甘胆酸钠，用稀释液准确稀释出甘胆酸校准品，标示值依次为(0，1.25，2.5，10，20，40)mg/l；以及甘胆酸质控品(1.5，10)mg/l。作为优选，所述的cmpf试剂中的试剂r1以及试剂r2的配制方法如下：(3-1)准确称量配制(30-70)mm的tris缓冲液1l，充分溶解混合均匀后，调节ph为6.0-7.0；(3-2)取步骤1-1中缓冲液800ml，依次加入(4-5)mm的g6p，0.05％的pc-300，(1.2-2.0)ku/l的cmpf抗体，充分溶解混合均匀后备用；(3-3)取步骤1-2中溶液400ml，加入(4-6)mm的氧化型硫代辅酶i(辅酶类似物)，混合均匀，4℃平衡放置过夜后备用，标记为r1；(3-4)取步骤1-1中缓冲液200ml，依次加入(0.15-0.2)％bsa，(1.5-2)％nacl，0.05％pc-300，(0.5-0.6)ku/l葡萄糖六磷酸脱氢酶-cmpf偶联物标记为r2。作为优选，所述的cmpf试剂中的校准品以及质控品的配制方法如下：(2-1)称量(0.7-0.9)％的nacl，(0.05-0.06)％的pc-300，用纯化水溶解，配制为cmpf校准品质控品专用稀释液备用；(2-2)准确称量cmpf，用稀释液准确稀释出cmpf校准品，标示值依次为(0，2，4，8，20，40)mg/l；以及cmpf质控品(4，20)mg/l。因此，本发明具有以下有益效果：(1)通过将均相酶免疫法均相酶免疫诊断试剂中的氧化型辅酶ii(nadp)用氧化型硫代辅酶i(辅酶类似物)进行替代，有效解决均相酶免疫诊断试剂稳定性较差的问题，改善试剂检测结果的重复性，提高检测结果的准确度。(2)提高试剂的抗血红蛋白干扰能力，减弱临床样本溶血现象对检测结果的影响。(3)提升均相酶免疫诊断试剂的可检测性，使得测试试剂适用于常规酶标仪，检测成本有效降低，同时节约试剂和原料的用量。附图说明图1为本发明实施例1的定标图。图2为对比例1的定标图。图3为本发明对比例2的定标图。图4为实施例2的定标图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明各实施例中的部分原料以及原料生产厂家如下表1所示，但其仅仅表示个例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。表1实施例1甘胆酸试剂的配制：(一)试剂r1以及试剂r2的配制(1-1)准确称量配制(30-70)mm的tris缓冲液1l，充分溶解混合均匀后，调节ph为6.0-7.0；(1-2)取步骤1-1中缓冲液800ml，依次加入(4-5)mm的g6p，0.05％的pc-300，(1.2-2.0)ku/l的甘胆酸单克隆抗体，充分溶解混合均匀后备用；(1-3)取步骤1-2中溶液400ml，加入(4-6)mm的氧化型硫代辅酶i，混合均匀，4℃平衡放置过夜后备用，标记为r1；(1-4)取步骤1-1中缓冲液200ml，依次加入(0.15-0.2)％bsa，(1.5-2)％nacl，0.05％pc-300，(0.5-0.6)ku/l葡萄糖六磷酸脱氢酶-甘胆酸偶联物标记为r2。(二)校准品以及质控品的配制(2-1)称量(0.7-0.9)％的nacl，(0.05-0.06)％的pc-300，用纯化水溶解，配制为甘胆酸校准品质控品专用稀释液备用；(2-2)准确称量甘胆酸钠，用稀释液准确稀释出甘胆酸校准品，标示值依次为(0，1.25，2.5，10，20，40)mg/l；以及甘胆酸质控品(1.5，10)mg/l。对比例1试剂r1以及试剂r2的配制(1-1)准确称量配制(30-70)mm的tris缓冲液1l，充分溶解混合均匀后，调节ph为6.0-7.0；(1-2)取步骤1-1中缓冲液800ml，依次加入(4-5)mm的g6p，0.05％的pc-300，(1.2-2.0)ku/l的甘胆酸单克隆抗体，充分溶解混合均匀后备用；(1-3)取步骤1-2中溶液400ml，加入(4-6)mm的nadp，混合均匀，4℃平衡放置过夜后备用，标记为r1；(1-4)取步骤1-1中缓冲液200ml，依次加入(0.15-0.2)％bsa，(1.5-2)％nacl，0.05％pc-300，(0.5-0.6)ku/l葡萄糖六磷酸脱氢酶-甘胆酸偶联物标记为r2。对比例1中的校准品以及质控品与实施例1中所制得的校准品以及质控品相同。将实施例1与对比例1进行如下实验，对比两者的性能：一.实验步骤(1)在生化分析仪(olympus-au640)上，用上述配制好的两批试剂(4℃)分别对校准品进行定标，测试质控品，比对cv值和准确度差异；(2)用(1)的定标通道测试20例血清样本(溶血)，以及对抗血红蛋白干扰实验的一系列样本进行检测；含有一系列血红蛋白浓度梯度的样本制备如下表2：表2血红蛋白浓度基础血清血红蛋白高值(20g/l)生理盐水0.0g/l0.900ml/0.100ml0.2g/l0.900ml0.010ml0.090ml0.4g/l0.900ml0.020ml0.080ml0.8g/l0.900ml0.040ml0.060ml1.2g/l0.900ml0.060ml0.040ml1.6g/l0.900ml0.080ml0.020ml2.0g/l0.900ml0.100ml/(3)将上述的两批试剂各自一分为二，分别放置在4℃和37℃条件下7天，在生化分析仪(olympus-au640)上分别对校准品定标，比对各批试剂4℃和37℃的差异；然后两批4℃试剂继续放置12个月，各自对比1年前后试剂的下降幅度。二.定标结果如图1以及图2所示，图1为本发明实施例1的定标图，图2为对比例1的定标图，通过比对两种试剂的定标图可知，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)替代氧化型辅酶ii(nadp)之后，两组结果没有明显的差异，表明氧化型硫代辅酶i(thio-nad)其性能与氧化型辅酶ii(nadp)基本没有差异，不影响最终测试的准确性。三.重复性和准确度检测结果表3两批甘胆酸试剂的质控测试结果如表3中所示，通过表中可知，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)替代氧化型辅酶ii(nadp)之后，甘胆酸试剂测试质控品的cv值变小，重复性变好；实测值相对靶值的相对偏差变小，试剂的准确度变高。四.抗血红蛋白干扰实验检测结果表4nadp试剂组表5thio-nad试剂组已知抗干扰率为85％-115％为正常范围，表4为nadp试剂组抗血红蛋白干扰实验结果，表5为thio-nad试剂组抗血红蛋白干扰实验结果，由两批甘胆酸试剂的抗血红蛋白干扰实验结果可知，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)(表5)替代氧化型辅酶ii(nadp)(表4)之后，抗血红蛋白干扰的最高浓度由0.4g/l变为了1.6g/l，抗血红蛋白干扰能力上升。五.临床样本检测结果表6由两批甘胆酸试剂的临床检测结果如上表6，从表中数据可知，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)替代氧化型辅酶ii(nadp)之后，负值出现概率由15％变为0％，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)的抗血红蛋白干扰能力较强，减弱了临床样本溶血现象对检测结果的影响。六.试剂稳定性结果表7表8由稳定性结果如上表7与表8所示，从表中数据可知，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)替代氧化型辅酶ii(nadp)之后，试剂37℃加速7天的下降幅度有明显降低，试剂4℃放置12个月后下降幅度也有明显的减小。由此可知，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)替代氧化型辅酶ii(nadp)之后，提高了甘胆酸试剂的4℃稳定性和37℃稳定性。实施例2cmpf试剂的配制：(一)试剂r1以及试剂r2的配制(1-1)准确称量配制(30-70)mm的tris缓冲液1l，充分溶解混合均匀后，调节ph为6.0-7.0；(1-2)取步骤1-1中缓冲液800ml，依次加入(4-5)mm的g6p，0.05％的pc-300，(1.2-2.0)ku/l的cmpf抗体，充分溶解混合均匀后备用；(1-3)取步骤1-2中溶液400ml，加入(4-6)mm的氧化型硫代辅酶i，混合均匀，4℃平衡放置过夜后备用，标记为r1；(1-4)取步骤1-1中缓冲液200ml，依次加入(0.15-0.2)％bsa，(1.5-2)％nacl，0.05％pc-300，(0.5-0.6)ku/l葡萄糖六磷酸脱氢酶-cmpf偶联物标记为r2。(二)校准品以及质控品的配制(4-1)称量(0.7-0.9)％的nacl，(0.05-0.06)％的pc-300，用纯化水溶解，配制为cmpf校准品质控品专用稀释液备用；(4-2)准确称量cmpf，用稀释液准确稀释出cmpf校准品，标示值依次为(0，2，4，8，20，40)mg/l；以及cmpf质控品(4，20)mg/l。对比例2试剂r1以及试剂r2的配制(1-1)准确称量配制(30-70)mm的tris缓冲液1l，充分溶解混合均匀后，调节ph为6.0-7.0；(1-2)取步骤1-1中缓冲液800ml，依次加入(4-5)mm的g6p，0.05％的pc-300，(1.2-2.0)ku/l的cmpf抗体，充分溶解混合均匀后备用；(1-3)取步骤1-2中溶液400ml，加入(4-6)mm的nadp，混合均匀，4℃平衡放置过夜后备用，标记为r1；(1-4)取步骤1-1中缓冲液200ml，依次加入(0.15-0.2)％bsa，(1.5-2)％nacl，0.05％pc-300，(0.5-0.6)ku/l葡萄糖六磷酸脱氢酶-cmpf偶联物标记为r2。对比例2中的校准品以及质控品与实施例2中所制得的校准品以及质控品相同。将实施例2与对比例2进行如下实验，对比两者的性能：一.实验步骤其实验操作步骤如下：(1)在生化分析仪(olympus-au640)上，用上述配制好的两批试剂(4℃)分别对校准品进行定标，测试质控品，比对cv值和准确度差异；(2)用(1)的定标通道测试20例血清样本(溶血)，以及对抗血红蛋白干扰实验的一系列样本进行检测。含有一系列血红蛋白浓度梯度的样本制备如下表9：表9血红蛋白浓度基础血清血红蛋白高值(20g/l)生理盐水0.0g/l0.900ml/0.100ml0.2g/l0.900ml0.010ml0.090ml0.4g/l0.900ml0.020ml0.080ml0.8g/l0.900ml0.040ml0.060ml1.2g/l0.900ml0.060ml0.040ml1.6g/l0.900ml0.080ml0.020ml2.0g/l0.900ml0.100ml/二.定标结果如图3以及图4所示，图3为本发明对比例2的定标图，图4为实施例2的定标图，通过比对两种试剂的定标图可知，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)替代氧化型辅酶ii(nadp)之后，两组结果没有明显的差异，表明氧化型硫代辅酶i(thio-nad)其性能与氧化型辅酶ii(nadp)基本没有差异，不影响最终测试的准确性。三.重复性和准确度检测结果表10两批cmpf试剂的质控测试结果如表10所示，从表中可知，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)替代氧化型辅酶ii(nadp)之后，cmpf试剂测试质控品的cv值变小，重复性变好；实测值相对靶值的相对偏差变小，cmpf试剂的准确度变高。四.抗血红蛋白干扰实验检测结果表11表12已知抗干扰率为85％-115％为正常范围，表10为nadp试剂组，表11为thio-nad试剂组，由两批cmpf试剂的抗血红蛋白干扰实验结果可知，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)替代氧化型辅酶ii(nadp)之后，抗血红蛋白干扰的最高浓度由0.8g/l变为了1.6g/l，抗血红蛋白干扰能力上升。五.临床样本检测结果表13两批cmpf试剂的临床检测结果如表13所示，从表中数据可知，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)替代氧化型辅酶ii(nadp)之后，负值出现概率由30％变为0％，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)的抗血红蛋白干扰能力较强，减弱了临床样本溶血现象对检测结果的影响。六.试剂稳定性结果表14表15。两批cmpf试剂稳定性结果如表14以及表15可知，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)替代氧化型辅酶ii(nadp)之后，试剂37℃加速7天的下降幅度有明显降低，试剂4℃放置12个月后下降幅度也有明显的减小。由此可知，氧化型硫代辅酶i(thio-nad)替代氧化型辅酶ii(nadp)之后，提高了cmpf试剂的4℃稳定性和37℃稳定性。当前第1页12