一种评价邻苯二甲酸酯植物毒性的方法与流程

本发明涉及环境质量评价
技术领域：
，尤其涉及一种有机污染物对植物毒性的评价技术，更具体地，涉及一种评价邻苯二甲酸酯植物毒性的方法。
背景技术：
：邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类重要的人工合成有机化合物，广泛应用于塑料增塑剂(俗称塑化剂)，以及汽车、服装、化妆品、润滑剂和农药等行业，大量进入环境中，并具有半挥发性和远距离迁移性，成为全球性环境污染物。PAEs具有致癌、致畸、致突变等毒性，尤以造成人体生殖功能异常最受关注，是典型的内分泌干扰物，被人们称为“第二个全球性PCB污染物”。目前，包括我国在内的许多国家和环保组织将其列入优先控制污染物，并采取相应措施防止PAEs对人类健康的危害。以植物实验进行对PAEs的毒理研究，是对微生物和动物实验评价邻苯二甲酸酯潜在风险的重要补充。PAEs是一种难溶于水的化合物，要将其溶解于水中首先要加助溶剂。以往的研究并没有评估助溶剂对植物的毒性，而是直接加适量的助溶剂溶解PAEs，最终无法解释是PAEs对植物的毒性还是助溶剂对植物的毒性。此外，以前的研究往往需要测试大量的生理生化指标以评估毒物对植物的影响，而忽略了对生物量变化的评价，生物量是反映污染物毒性最为敏感且测试成本最低的参数之一，也是测试成本最低，测试难度最小的参数。以往的研究未充分讨论污染物对植物的剂量-效应关系，也未能很好的模拟出植物剂量效应曲线方程。因而我们在前期实验基础上，提出了评价PAEs毒性的方法，以期填补PAEs植物毒性评价的空白。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有邻苯二甲酸酯植物毒性评价中存在的缺陷和不足，提供一种改进的、低成本的评价邻苯二甲酸酯(PAEs)植物毒性的方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种评价邻苯二甲酸酯植物毒性的方法，包括如下步骤：S1.准备植物幼苗；S2.配置不同浓度的邻苯二甲酸酯标准液及不同浓度的用于溶解邻苯二甲酸酯的助溶剂；S3.筛选出大小一致的植物幼苗，并称重，记M1；然后将植物幼苗放入S2不同浓度的助溶剂中进行暴露实验，结束后对植物幼苗称重，记M2；S4.计算植物相对生长率，计算公式如下：其中，M1和M2分别是植物暴露前后的重量；S5.计算植物生长相对抑制率，计算公式如下：其中，C是邻苯二甲酸酯或助溶剂的浓度，t是测试时间，μ是步骤S4所测试得的植物相对生长率，i是样品重复数1,2,...,n，j是对照组1,2,...,m；S6.计算效应浓度，通过植物生物量在急性毒性终点的浓度进行计算，采用非线性方程拟合进行计算；＜EC10所对应的浓度定义为对植物生长几乎没有影响的浓度，在EC20～EC50之间的浓度定义为对植物生长有影响的浓度，＞EC50的浓度定义为对植物生长有极大影响的浓度；S7.选取＜EC10的助溶剂浓度作为溶解DBP的浓度，将助溶剂和不同浓度的邻苯二甲酸酯标准液混匀，按照步骤S3～S6进行暴露试验并计算植物相对生长率、植物生长相对抑制率及效应浓度。PAEs是一种难溶解于水中的化合物，往往需要添加一定的助溶剂进行溶解，以往的研究忽略了助溶剂对植物的毒性的影响，在评价植物毒性时具有一定的漏洞。本发明通过选择生物量作为反映污染物毒性的参数，先将植物在助溶剂中进行暴露试验，评价助溶剂对植物的毒性，再根据效应浓度选择对植物无影响浓度的助溶剂去溶解邻苯二甲酸酯，然后进一步将植物在含有上述浓度助溶剂的邻苯二甲酸酯中进行暴露试验，评价邻苯二甲酸酯对植物的毒性。优选地，所述助溶剂为单一纯溶剂或不同溶剂的混合物。优选地，当所述助溶剂为不同溶剂的混合物时，先分别配置不同浓度的各溶剂组分，计算各溶剂组分对植物幼苗的相对生长抑制率和效应浓度，再将各溶剂混合，计算混合溶剂对植物幼苗的相对生长抑制率和效应浓度。优选地，步骤S6中非线性方程拟合时，需评价所选参数的拟合度计算均方根误差，计算公式如下：其中，IRi是所测试的IR值，iri是由模拟曲线得到的对应IR的估计值，n是处理组重复数。优选地，所述植物为菜心。本发明的上述评价方法可以筛选到对植物毒性无影响的助溶剂浓度，因此上述方法可运用在筛选邻苯二甲酸酯助溶剂中的应用，以避免后续相关试验时，助溶剂毒性的干扰。优选地，所述溶剂为吐温80和甲醇的混合溶剂。优选地，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的评价邻苯二甲酸酯植物毒性的方法运用最为简单、方便、低成本的参数分析植物毒性，填补了PAEs植物毒性评价的空白，有效避免了以往植物毒性评价方法中忽略助溶剂植物毒性的缺陷，使评价结果更加准确，同时为选择无植物毒性的助溶剂浓度提供了依据。附图说明图1为吐温80胁迫下菜心幼苗的相对抑制率曲线(曲线方程y＝18.93-34.82x+9.80x2-0.65x3,R2＝0.773,RSME＝8.35)。图2为甲醇胁迫下菜心幼苗的相对抑制率曲线(曲线方程y＝35.47-46.79x+12.39x2-0.87x3,R2＝0.626,RSME＝5.91)。图3为DBP效应浓度曲线(y＝4.00-13.68x+11.53x2-1.17x3,R2＝0.991,RSME＝1.83)。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1一、方法1、菜心幼苗的准备将菜心种子放在5～8倍于种子重量的55℃～60℃的热水中浸泡10～15分钟，边浸边搅(朝一个方向旋转)，等烫种时间到了以后，把水温降到30℃左右，开始转入浸种。将石英砂洗干净后，转入一次性纸杯后，种子放入一次性纸杯中进行培养，种植密度约20颗/杯。培养在人工气候箱中进行，温度为25℃，湿度为65％，光照强度7000勒克斯。每天浇灌改良后的ISO8692营养液，其配方如表1所示：表1ISO8692营养液No.ReagentConc.No.ReagentConc.1KNO357.04g/L8MnCl20.83g/L2MgCl2·6H2O12.00g/L9Fe-EDTA4.38g/L3CaCl218.00g/L10NaMoO435.00mg/L4MgSO415.00g/L11CuSO462.50mg/L5KH2PO433.46g/L12ZnSO414.95mg/L6NaHCO330.00g/L13CoCl215.00mg/L7H3BO30.371g/L水稻和菜心生长到16d后，将其根部的沙粒洗干净，备用。2、暴露实验(1)浓度设置前期实验发现，吐温80，二甲基甲酰胺，二甲基亚砜、纯溶剂可将邻苯二甲酸二丁酯(DBP)溶解，但加入水后会出现白色胶体，不符合实验现象。之后，我们将以上三种溶剂分别与少量的甲醇混合，加入DBP，发现仅吐温80不会出现白色胶体，因此最终我们选择吐温和甲醇的混合物溶解DBP。为了了解不同浓度吐温80和甲醇，及其混合物对植物的毒性，我们分别设置了不同梯度浓度的吐温80和甲醇，如下：吐温80：0，0.3‰，0.6‰，0.8‰，1.2‰，2‰，3‰，4‰；甲醇：0，0.2‰，0.4‰，0.8‰，1.2‰；DBP：0，10mg/L，30mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L；(2)菜心暴露实验①将备用的菜心(绿宝70)进行人工筛选，筛选大小一致的菜心，共4组平行样，每组3株菜心幼苗，每组菜心幼苗质量控制在1.5g左右。暴露实验前将每菜心幼苗进行称重(称重前用吸水纸将植物根表面的水分吸干)，记M1。②将菜心幼苗放入不同浓度的吐温80和甲醇溶液50mL离心管中进行暴露实验，暴露时间为4d。暴露期间，用锡箔纸将离心管包裹住，并且将离心管的口也用锡箔纸封住。暴露4d后，将每组菜心幼苗进行称重(称重前用吸水纸将植物根表面的水分吸干)，记M2。3、计算统计(1)相对生长率测定植物相对生长率计算公式如下：其中，M1和M2分别是植物暴露前后的重量。(2)抑制率计算植物生长相对抑制率计算公式如下：其中，C是测试化合物(吐温80，甲醇，DBP)的浓度，t是测试时间，μ是步骤(1)所测植物相对生长率，i是样品重复数1,2,...,n，j是对照组1,2,...,m.(3)效应浓度计算效应浓度(EC)通过植物生物量在急性毒性终点的浓度进行计算。EC值的计算采用非线性方程拟合进行计算(Origin8.5)。为了评价所选参数的拟合度，需要计算均方根误差，计算公式如下：其中，IRi是所测试的IR值，iri是由模拟曲线得到的对应IR的估计值，n是处理组重复数。二、计算结果分析1、吐温80和甲醇胁迫下效应浓度的计算(1)相对生长量吐温80、甲醇胁迫下菜心幼苗的相对增产量分别如表2、表3所示，其相对相对抑制率曲线如图1、图2所示，表2吐温80胁迫下菜心幼苗的相对生长量浓度0‰0.3‰0.6‰0.8‰1.2‰2‰3‰4‰相对生长率0.9381.2540.1050.9510.8720.7430.6610.572抑制率IR0-33.689-7.1432.8787.03620.78930.59739.019iri0-16.8-14.41-4.379.523.4733.7436.55表3甲醇胁迫下菜心幼苗的相对生长量浓度0‰0.2‰0.4‰0.8‰1.2‰1.6‰2.4‰相对生长率0.9121.0231.1560.9210.8870.8570.765抑制率0-12.171-26.754-0.9872.7416.03116.118iri0-15.78-17.08-9.291.611.4914.15(2)抑制率及效应浓度计算根据毒理学理论基础，我们将＜EC10所对应的浓度定义为对植物生长几乎没有影响的浓度，在EC20～EC50之间的浓度定义为对植物生长有影响的浓度，＞EC50的浓度定义为对植物生长有极大影响的浓度。从图2和图3我们可以看出，其在低浓度时，吐温和甲醇对植物的生长抑制率为负值，表明低浓度的吐温和甲醇对植物生长有刺激作用，该作用称为hormesis效应。本发明中，我们选取＜EC10的浓度，但不选择hormesis区间的浓度，因为过低的浓度会影响DBP的溶解。拟合结果显示，吐温胁迫下菜心的相对抑制率(图1)的0～EC10的浓度的范围为约在1～1.2‰之间，甲醇胁迫下菜心的相对抑制率(图2)的0～EC10的浓度的范围为约在1.13～1.2‰。最终我们选取吐温和甲醇的浓度均为1.2‰。2、吐温80和甲醇共同效应浓度计算为了验证吐温80和甲醇混合后，其效应浓度＜EC10，我们又计算了其生长率，其数据如表4所示。提供过计算可知吐温和甲醇混合后对植物的相对生长抑制率为(0.938-0.928)/0.938×100％＝1.066％＜EC10，因此可选择吐温和甲醇的浓度均为1.2‰作为溶解DBP的浓度。表4吐温80与甲醇混合后效应计算3、吐温80和甲醇混合后溶解DBP效应浓度计算(1)暴露前菜心重量暴露前菜心生物量如表5所示：表5DBP胁迫前菜心重量1234averageSDCK1.681.761.391.51.5830.168101.771.771.811.71.7630.046301.51.941.611.861.7280.207502.11.541.61.821.7650.2541001.61.61.462.11.6900.2812001.531.41.621.551.5250.092(2)暴露4d后菜心重量暴露后菜心生物量如表6所示：表6DBP胁迫4d后菜心重量1234averageSDCK2.742.682.182.482.5200.252102.312.852.472.62.5580.2283022.732.272.372.3430.302502.391.752.092.482.1780.3301001.491.811.642.581.8800.4852001.641.581.711.841.6930.112(3)相对生长量与效应浓度计算相对生长量、抑制率与iri的值如表7所示：表7DBP胁迫下菜心相对生长量1234averageSD抑制率iriCK1.060.920.790.980.9380.11400100.541.080.660.90.7950.24215.2413.56300.50.790.660.510.6150.13834.4335.5500.290.210.490.660.4130.20356.0259.22100-0.110.210.180.480.1900.24179.7477.432000.110.180.090.290.1680.09082.1483.01(4)效应浓度曲线DBP效应浓度曲线如图3所示，可以看出，DBP对植物的毒性评价结果为：EC10＝8.08mg/L，EC20＝16.16mg/L，EC50＝44.44mg/L。本发明通过前期实验筛选了吐温和甲醇混合能够作为DBP的助溶剂，并且明确了吐温、甲醇及其混合物对植物的毒性效应，通过建立非线性方程，得到其对植物无影响的浓度均为1.2‰，且其混合物对植物的无影响浓度也为1.2‰，说明两种物质混合不存在叠加或者拮抗效应。通过筛选后的助溶剂浓度最多能够溶解200mg/L的DBP，因此最大浓度设置为200mg/L。通过曲线拟合最后得到DBP对植物的毒性评价结果为：EC10＝8.08mg/L，EC20＝16.16mg/L，EC50＝44.44mg/L。本发明提出运用最为简单、方便、低成本的参数分析植物毒性，填补了PAEs植物毒性评价的空白。当前第1页1 2 3