本发明属于食品中危害性成分检测方法领域，具体涉及一种同步检测液体或半固体调味品中游离态cml和5-hmf的方法。该方法有效简化操作流程，提高检测效率，可适用多种液体或半固体调味品的检测。
背景技术：
：：cml(羧甲赖氨酸)是美拉德反应的产物之一，广泛存在于各类常见食品中，可在人体内被吸收和蓄积，易与氨基酸、肽及蛋白质等发生共价交联，对人体具有潜在的危害性。5-hmf(5-羟甲基糠醛)是一种呋喃类化合物，同样可由美拉德反应产生，现有研究表明高浓度的5-hmf具有细胞毒性，对眼睛，上呼吸道，皮肤和粘膜有刺激性。饮食中的5-hmf主要通过尿液快速代谢和排泄，同时在肾脏，膀胱和肝脏中有少量共价结合，存在致癌风险。目前对于危害性小分子物质的检测，主要包括紫外光光度法(uv)、气相色谱法(gc)、气相色谱质谱联用法(gc-ms，gc-ms/ms)、液相色谱法(hplc)和液相色谱质谱联用法(hplc-ms，hplc-ms/ms)。其中糠醛等有紫外吸收的物质使用uv和hplc等方法较为广泛，而cml、丙烯酰胺以及咪唑类等无紫外吸收的物质则主要以气相或液相质谱联用法作为检测方法。质谱联用系统相对而言具有更高的准确性，且hplc-ms/ms无需对样品进行挥发性衍生化处理，减少操作环节，有利于提高检测准确率。食品样品在hplc-ms/ms检测前的常规处理过程包括除去大分子脂肪、蛋白质、淀粉等，此系列操作过程繁琐复杂，耗时较长。酱油中的主要成分包括水、氨基酸、肽、糖类等，且呈液态。目前针对酱油中的危害性成分检测，涉及cml的较少，而5-hmf多以紫外吸收检测为主，由于酱油本身的颜色较深，若脱色不完全对检测结果有一定的影响；且诸多研究已表明，酱油中游离态cml含量较结合态高出1-2个数量级，可知酱油中cml主要以游离态形式存在。目前还未有同步检测酱油中游离态cml和5-hmf的hplc-ms/ms检测方法，对于二者的前处理过程和检测条件的探索不多。技术实现要素：为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种同步检测液体或半固体调味品中游离态cml和5-hmf的方法。该方法只需一次前处理过程，即可同时高效率检测出液体或半固体调味品中两种常见危害性成分的含量；尤其是酱油样品中两种常见危害性成分的含量，同时可用于深入分析液体或半固体调味品中cml和5-hmf的生成过程，为调控液体或半固体调味品的生产和制备过程中cml和5-hmf的含量奠定研究基础，同时对于液体或半固体调味品生产过程中美拉德反应相关危害性成分具有指导意义，该方法尤其对酱油具有指导意义。本发明目的通过以下技术方案实现：一种同步检测液体或半固体调味品中游离态cml和5-hmf的方法，首先，进行液体或半固体调味品体系中游离态cml和5-hmf的检测前处理，然后将经过前处理的待测样品进行cml和5-hmf的同步检测；所述液体或半固体调味品体系中游离态cml和5-hmf的检测前处理，包括以下步骤：(1)向液体或半固体调味品中加水稀释，混合均匀，离心处理；(2)取离心处理后的上清液，使用polycleanx-mcx固相萃取柱净化，加水淋洗，然后加体积比为10：90的氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；每1-2ml上清液对应10-20ml水和10-20ml氨水-甲醇溶液；(3)将洗脱液干燥，然后复溶于甲醇-水溶液中，经微滤膜处理，制得待测样品。本申请所述甲醇和水均为色谱级。步骤(1)所述液体或半固体调味品优选为酱油。步骤(1)所述加水稀释优选为每1ml液体调味品或1g半固体调味品稀释至5-10ml。步骤(1)所述混合均匀优选为旋涡混匀。步骤(1)所述离心处理的离心力优选为7000g；离心时间优选为15min；离心温度优选为4℃。步骤(2)所述polycleanx-mcx固相萃取柱使用前经5-10ml甲醇活化，再加5-10ml纯水平衡。步骤(3)所述甲醇-水溶液用量优选为：每1ml步骤(2)所述的上清液对应5-10ml步骤(3)所述甲醇-水溶液，更优选为10ml。步骤(3)所述甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比优选为10：90。步骤(3)所述干燥方法优选为氮气吹干。步骤(3)所述微滤膜的孔径优选为0.22-0.45μm；更优选为0.22μm。所述检测方法优选为高效液相色谱-质谱(hplc-ms/ms)法。所述高效液相色谱采用agilent1260机型，检测条件如下：色谱柱型号：aceproshell120sb-c18色谱柱50×3.0mm，2.7μm；柱温：30℃；流动相：甲醇：0.1％甲酸水＝10：90；流速：0.5ml/min；进样量：10μl；质谱为三重四级杆质谱，采用agilent6460质谱仪，检测条件为：离子源：esi+；离子源温度：300℃；毛细管电压：3.5kv；锥孔气流量：9l/min；msi四级杆温度：100℃；ms2四级杆温度：100℃；脱溶剂温度：300℃；雾化器压力：15psi；检测方式：多离子反应检测(mrm)。所述mrm参数如表1：表1cml和hmf的质谱检测条件注：其中带“*”的离子为定量子离子与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：(1)本发明采用polycleanx-mcx固相萃取(spe)柱进行分离，可有效分离出检测目标物cml、5-hmf，从而达到同步检测酱油中游离态cml和5-hmf的目的。(2)本发明所述前处理方法简单、易操作，避免复杂前处理过程带来的实验误差；通过特定离子柱进行除杂，降低机制效应的干扰；同时可检测到游离态cml和5-hmf，提高检测效率，节约多种试剂及仪器损耗，降低检测成本。(3)本发明所述方法可广泛应用于多种液体及半固体调味品中游离态cml和5-hmf的定性及定量检测。(4)本发明所述方法操作准确、灵敏度高；其检测限以混合标准品检测过程中3倍信噪比(s/n＝3)为最低检测限(lod)、10倍信噪比(s/n＝3)为最低定量限(loq)。附图说明图1为cml的二级质谱检测所得离子碎片及丰度。图2为5-hmf的二级质谱检测所得离子碎片及丰度。图3为不同流动相下cml和hmf混合标准品的色谱图。图4为不同色谱柱对cml和hmf的色谱图影响。图5为cml浓度与质谱信号峰面积关系的标准曲线。图6为5-hmf浓度与质谱信号峰面积关系的标准曲线。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。1、本申请所述方法准确性的确立质谱和色谱参数的确定均采用标准品(cml,5μg/ml；5-hmf,5μg/ml，二者的混合溶液)进行验证检测。质谱参数及液相色谱条件的确立质谱模块为三重四级杆质谱仪；仪器模式为电喷雾电离正离子模(esi+)；监测模式：多反应监控模式(mrm)；离子源温度：300℃；雾化气压力：0.1mpa；毛细管电压：4kv；ms1四级杆温度：100℃；ms2四级杆温度：100℃。液相色谱参数：根据cml和hmf为中等极性分子，选用proshell120ec-c18(50mm×3.0mm，2.7μm)；proshell120sb-c18(50mm×3.0mm，2.7μm)；zorbaxeclipsexdb-c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)三个不同填料和类型的色谱柱进行分析，观察其峰型变化和保留时间。流动相a相为甲醇，b相为0.1％甲酸水溶液，分别使用100％；90％；80％；70％；50％；30％；20％；10％和5％不同比例的甲醇作为流动相，对比其峰型与出峰时间情况，考察等度洗脱的可行性和最优流动相配比；流速：0.5ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl。(1)质谱检测条件根据cml和hmf的化学结构式及相对分子质量，依次对标准品使用全扫(scan)；单通道(sim)；子离子扫描(productionscan)；多重反应监测(mrm)以及optimizer软件对cml和hmf进行定性检测和检测条件优化。根据cml和hmf的二级质谱检测所得离子碎片及丰度，推断二者结构断裂方式如图1、图2所示。以此确立待测物的定性与定量离子对，并优化响应的碰撞电压和碰撞能，使其响应最强。所得cml和hmf的定性母离子(q1mass)离子、定量子离子(q3mass)、最优破碎电压(fragmentorvolatage)和碰撞能(collisionenergy)如表1所示。表1cml和hmf的质谱检测条件注：其中带“*”的离子为定量子离子(2)色谱分离条件在优化后的质谱条件下对混合标准品(cml,5μg/ml；5-hmf,5μg/ml，二者的混合溶液)进行验证测定，在不同比例的流动相(甲醇-水)条件下检测二者的分离状况和保留时间，所得色谱图如图3所示，通过对比可知，在甲醇比例高于或等于30％的条件下，目标检测物cml和5-hmf无法达到较优的分离效果，流动相中甲醇比例应当低于30％。在流动相比例为20％时，虽然二者有一定的分离度，但考虑到检测实际样品过程中会有杂志的干扰，易与目标物质峰发生重叠，因而宜考虑更大的分离度。甲醇-水体积比为10:90时，两峰有较好的分离效果，且峰型响应均较高。当流动相甲醇比例为5％时，可见目标物5-hmf的响应峰变宽、变矮，此峰型不利于样品检测时的定量积分，易产生误差，降低检测过程的准确性。在流动相甲醇比例为10％的条件下，两物质出峰时间有一定距离，分别为0.53min和1.72min，二者1.2min的间隔时间，可提高区分二者分别检测的准确定，以此作为检测最优流动相比例。由于在检测过程中分离度和峰型与定量积分过程准确性密切相关，且与色谱柱的填料关系密切，因此选用了proshell120sb-c18(50mm×3.0mm，2.7μm)和proshell120ec-c18(50mm×3.0mm，2.7μm)；zorbaxeclipsexdb-c18三种不同的液相色谱柱检测5μg/mlcml和5-hmf混合标样，观察其峰型；响应强度和保留时间的变化，其结果如图4所示。由图4可知，ec-c18和sb-c18在5min之内即可出峰完毕，而xdb-c18则需20分钟，这是由于前两者其核壳结构的填料以及50mm的柱长导致二者的出峰效率要远高于250mm的xdb-c18柱。根据峰型和出峰时间计算不同色谱柱下cml和hmf的理论塔板数、理论塔板高度、分离度等参数，其结果如表2所示。表2不同色谱柱及对应目标物检测参数table2compareofdifferentchromatographiccolumnsforstandards因此，综合检测效率和检测准确度，最终选择proshell120sb-c18柱作为目标物的分离检测色谱柱，最终检测时间为3min。2、本申请实施例中所用到的标准曲线的配制方式如下：分别准确称取10mgcml和5-hmf标准品，用超纯水溶于100ml容量瓶中，精确值0.1mg，得100μg/mlcml标准品溶液和100μg/ml5-hmf标准品溶液。各取1ml100μg/mlcml和5-hmf标准品溶液于同一容量瓶，使用超纯水定容至50ml，得2μg/ml混合标准品溶液。再逐级稀释至0.01μg/ml；0.05μg/ml；0.1μg/ml；0.25μg/ml；0.5μg/ml；1μg/ml；2μg/ml7个不同浓度的cml和hmf混合标准品。用hplc-ms/ms分别测定0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml的cml和5-hmf混合标准品，以定量离子峰面积为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，所得标准曲线如图5和图6。其中，所述高效液相色谱采用agilent1260机型，检测条件如下：色谱柱型号：aceproshell120sb-c18色谱柱50×3.0mm，2.7μm；柱温：30℃；流动相：甲醇：0.1％甲酸水＝10：90；流速：0.5ml/min；进样量：10μl。质谱为三重四级杆质谱，采用agilent6460质谱仪，检测条件为：离子源：esi+；离子源温度：300℃；毛细管电压：3.5kv；锥孔气流量：9l/min；msi四级杆温度：100℃；ms2四级杆温度：100℃；脱溶剂温度：300℃；雾化器压力：15psi；检测方式：多离子反应检测(mrm)。所述mrm参数如表1。由图5和6可知在该检测条件下，cml和hmf在0.01-2μg/ml浓度范围内，其色谱响应强度和浓度具有良好的线性关系(r2>0.998)，进一步保证了实验结果的准确性。在该条件下，以s/n＝3为最低检测限(lod)，s/n＝10为最低定量限(loq)。得到cml的最低检测限(lod)为0.3ng/ml，最低定量限(loq)为1ng/ml；5-hmf的最低检测限(lod)为6ng/ml，最低定量限(loq)为20ng/ml，表明该方法具有较高的灵敏度。3、确定本申请所述方法中cml和5-hmf的回收率样品的制备：1ml液体酱油样品，加水稀释至5ml，漩涡震荡混匀后，以7000g的速度于4℃下离心15min。加标样品的制备：1ml液体酱油样品，添加1ml已知浓度的混合标准液，再加水稀释至5ml，漩涡震荡混匀后，以7000g的离心力于4℃下离心15min。分别取1ml上述制得的样品和加标样品的上清液，进行相同的前处理过程，具体是：过polycleanx-mcx固相萃取柱(经5ml甲醇活化、5ml纯水平衡后的)除杂，加10ml水淋洗，然后加入10ml10％(即体积比为10：90)氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液经氮吹干燥后，复溶于5ml体积比为10：90的甲醇-水溶液，经0.22μm微滤膜处理，即得两种待测样品。将上述两种待测样品分别进行hplc-ms/ms检测，根据加标量和检测结果计算其加标回收率。同时以标准品检测过程中3倍信噪比(s/n＝3)为最低检测限(lod)、10倍信噪比(s/n＝3)为最低定量限(loq)。通过上述实验过程，验证了本申请所述方法中cml和5-hmf的最低检测限(lod)、最低定量限(loq)和算得cml和5-hmf的回收率如表3：表3cml和5-hmf的检测限、定量限和回收率其中，所述高效液相色谱采用agilent1260机型，检测条件如下：色谱柱型号：aceproshell120sb-c18色谱柱50×3.0mm，2.7μm；柱温：30℃；流动相：甲醇：0.1％甲酸水＝10：90；流速：0.5ml/min；进样量：10μl；质谱为三重四级杆质谱，采用agilent6460质谱仪，检测条件为：离子源：esi+；离子源温度：300℃；毛细管电压：3.5kv；锥孔气流量：9l/min；msi四级杆温度：100℃；ms2四级杆温度：100℃；脱溶剂温度：300℃；雾化器压力：15psi；检测方式：多离子反应检测(mrm)。所述mrm参数如表1。4、固相萃取柱(spe柱)的对比实验取1ml液体酱油样品，加水稀释至5ml，漩涡震荡混匀后，以7000g的离心力于4℃下离心15min。取1ml上述上清液，分别过polycleanx-mcx、c18固相萃取柱(经5ml甲醇活化、5ml纯水平衡后的)除杂，加10ml水或甲醇淋洗收集洗脱液。洗脱液经氮吹干燥后，复溶于5ml体积比为10：90的甲醇-水溶液，经0.22μm微滤膜处理，即得所需待测样品。用hplc-ms/ms检测步骤2的待测样品中cml和5-hmf的含量，其中测试条件为上述确定的色谱、质谱检测条件。表4不同类型的spe柱对目标的保留注：-表示未检出；*表示检出量低于上样量10％；**表示检出量占上样量10-90％；***表示检出量高于上样量90％。由上表分析可知，只有polycleanx-mcx固相萃取柱对cml和5-hmf具有一致的吸附效果，对cml和5-hmf均有强吸附性，可达到100％保留，适用于前处理优化除杂。5、洗脱液的对比实验取1ml液体酱油样品，加水稀释至5ml，漩涡震荡混匀后，以7000g的离心力于4℃下离心15min。取1ml上述上清液，分别过polycleanx-mcx固相萃取柱(经5ml甲醇活化、5ml纯水平衡后的)除杂，加10ml水淋洗，然后分别加入5％氨水甲醇和10％氨水甲醇两种洗脱液浓度，分别以5或10ml洗脱液进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液经氮吹干燥后，复溶于5ml体积比为10：90的甲醇-水溶液，经0.22μm微滤膜处理，即得所需待测样品。用hplc-ms/ms检测步骤2的待测样品中cml和5-hmf的含量，其中测试条件为上述确定的色谱、质谱检测条件。上述氨水甲醇溶液的百分比均指体积百分数，如10％氨水甲醇中氨水和甲醇的体积比为10：90。表5不同洗脱液对目标物的洗脱效果经对比后，选用体积5ml的5％氨水甲醇进行洗脱时，cml的回收率远超过较低，而10ml5％的氨水甲醇进行洗脱时，hmf的洗脱率仍未达100％，说明其结果不准确；选用体积10ml的10％氨水甲醇进行洗脱时，cml和5-hmf洗脱效果最好，cml和5-hmf回收率为98-102％。因此本实验选用洗脱液浓度为10％氨水甲醇，洗脱液体积为10ml。实例1：1、材料与设备不同发酵生产环节的酱油原料，甲醇、水均为色谱级，德国sartoriusbs224s电子天平，agilent1260高效液相色谱-6460三重四级杆质谱联用系统(美国agilent公司)。2、样品前处理取1g半固体或1ml液体样品，加水稀释至5ml，漩涡震荡混匀后，以7000g的离心力于4℃下离心15min。取1ml上述上清液，过polycleanx-mcx固相萃取柱(经5ml甲醇活化、5ml纯水平衡后的)除杂，加10ml水淋洗，然后加入10ml10％(即体积比为10：90)氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液经氮吹干燥后，复溶于5ml体积比为10：90的甲醇-水溶液，经0.22μm微滤膜处理，即得所需待测样品。3、用hplc-ms/ms检测步骤2的待测样品中cml和5-hmf的含量。所述高效液相色谱采用agilent1260机型，检测条件如下：色谱柱型号：aceproshell120sb-c18色谱柱50×3.0mm，2.7μm；柱温：30℃；流动相：甲醇：0.1％甲酸水＝10：90；流速：0.5ml/min；进样量：10μl；质谱为三重四级杆质谱，采用agilent6460质谱仪，检测条件为：离子源：esi+；离子源温度：300℃；毛细管电压：3.5kv；锥孔气流量：9l/min；msi四级杆温度：100℃；ms2四级杆温度：100℃；脱溶剂温度：300℃；雾化器压力：15psi；检测方式：多离子反应检测(mrm)。所述mrm参数如表1。4、测定结果计算：以外标法进行定量分析，将步骤3中检测样品所得的目标物定量离子峰面积，带入标准曲线计算，即可求得样品中游离态cml和5-hmf的含量，结果见表6。表6中所述样品为同一条生产链上不同生产环节的酱油样品。表6不同生产环节酱油样品中游离态cml和5-hmf的含量实例2：1、材料与设备不同品牌的市售酱油，甲醇、水均为色谱级，德国sartoriusbs224s电子天平，agilent1260高效液相色谱-6460三重四级杆质谱联用系统(美国agilent公司)。2、样品前处理取1ml液体样品，加水稀释至5ml，漩涡震荡混匀后，以7000g的速度于4℃下离心15min。取1ml上述上清液，过polycleanx-mcx固相萃取柱(经5ml甲醇活化、5ml纯水平衡后的)除杂，加10ml水淋洗，然后加入10ml10％(即体积比为10：90)氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液经氮吹干燥后，复溶于5ml体积比为10：90的甲醇-水溶液，经0.22μm微滤膜处理，即得所需待测样品。3、用hplc-ms/ms检测步骤2的待测样品中cml和5-hmf的含量。所述高效液相色谱采用agilent1260机型，检测条件如下：色谱柱型号：aceproshell120sb-c18色谱柱50×3.0mm，2.7μm；柱温：30℃；流动相：甲醇：0.1％甲酸水＝10：90；流速：0.5ml/min；进样量：10μl；质谱为三重四级杆质谱，采用agilent6460质谱仪，检测条件为：离子源：esi+；离子源温度：300℃；毛细管电压：3.5kv；锥孔气流量：9l/min；msi四级杆温度：100℃；ms2四级杆温度：100℃；脱溶剂温度：300℃；雾化器压力：15psi；检测方式：多离子反应检测(mrm)。所述mrm参数如表1。4、测定结果计算：以外标法进行定量分析，将步骤3中检测样品所得的目标物定量离子峰面积，带入标准曲线计算，即可求得样品中游离态cml和5-hmf的含量，结果见表7。表7不同品牌酱油样品中游离态cml和5-hmf的含量上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12