庆大霉素普鲁卡因维B12颗粒/胶囊中维生素B12含量的HPLC检测方法与流程

本发明属于化学检测领域，具体涉及一种庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法。

背景技术：

庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒（曾用名胃炎颗粒，以下简称为“颗粒”）、庆大霉素普鲁卡因维b12胶囊（曾用名胃炎胶囊，又名庆大霉素普鲁卡因胶囊，以下简称为“胶囊”））均是由硫酸庆大霉素、盐酸普鲁卡因、维生素b12及适量辅料组成的复方口服制剂。其中，硫酸庆大霉素为氨基糖苷类抗生素，对各种革兰阴性细菌、革兰阳性细菌及幽门螺旋杆菌均有抗菌作用，可抑制幽门螺旋杆菌，在胃中较长时间发挥局部杀菌作用；盐酸普鲁卡因为局麻药，可对损伤黏膜表面的神经末梢起封闭作用，阻断病灶对中枢神经系统的刺激，从而迅速缓解疼痛；维生素b12是形成消化道正常上皮细胞必需的物质。三者配合可起到抗菌、止痛和促进胃粘膜修复的作用，在临床上用于缓解急、慢性胃炎症状及消炎、止痛、促进胃黏膜修复。

庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒的现行标准为《国家药品标准》化学药品地方标准上升国家标准第六册，庆大霉素普鲁卡因维b12胶囊的现行标准有《国家药品标准》化学药品地方标准上升国家标准第六册、国家食品药品监督管理局标准ybh15222004和ybh20972006,除国家食品药品监督管理局标准ybh20972006收录了维生素b12的紫外鉴别方法外，其他三个标准均未收录与维生素b12相关的鉴别、检查及含量测定等项目。维生素b12是庆大霉素普鲁卡因维b12的主成分之一，应进行质量控制。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术存在的不足而提供的一种庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法，采用该方法对庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12的含量进行测定，操作简单，检测效率高，误差小，专属性强，检验方法较稳定，适用性广，不同企业样品的辅料对主成分的测定均无干扰，受影响的因素较少，能有效的控制庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊的质量。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法，包括以下步骤：

（1）色谱条件与系统适用性试验：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：watersxbridgeshieldrp18，4.6×250mm，5μm，以甲醇-0.028mol/l磷酸氢二钠溶液为流动相，按下表1梯度洗脱，流速1ml/min；进样量：100μl，柱温：30℃，检测波长：362nm，理论板数按维生素b12峰计算不低于2000，维生素b12峰与降解产物峰（相对保留时间约0.9）的分离度大于3.0；

（2）溶液制备：

①对照品溶液的制备：精密称取维生素b12对照品10.19mg置于100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得维生素b12对照品储备液，浓度为101.9μg/ml；精密量取1ml置于100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得维生素b12对照品溶液，浓度为1.019μg/ml；

②供试品溶液的制备：

庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒：称取本品适量，相当于维生素b1220μg，精密称定，置于棕色样品瓶中，精密加入20ml水，超声5min，振摇使其混匀，用0.45μm的滤膜过滤，即得；

庆大霉素普鲁卡因维b12胶囊：称取本品适量，相当于维生素b1210μg，精密称定，置于10ml量瓶中，加约5ml水，超声5min，用水定容至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，即得；

（3）测定:精密量取供试品溶液和对照品溶液各100ul注入液相色谱仪，照上述的色谱条件测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

上述的庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法，步骤（1）色谱条件与系统适用性试验中，所述的0.028mol/l磷酸氢二钠溶液用磷酸调节其ph至3.2。

上述的庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法，步骤（1）色谱条件与系统适用性试验中，系统适用性溶液的制备方法为：取维生素b12对照品10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入质量分数为1%的亚硫酸钠溶液5ml使其溶解，加水稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。

本发明的有益效果为：

本发明提供的庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法，该方法操作简单，检测效率高，误差小，专属性强，检验方法较稳定，适用性广，不同企业样品的辅料对主成分的测定均无干扰，受影响的因素较少；本发明方法的准确度、精密度、专属性、定量限、耐用性等均符合方法学验证要求，具有很强的实用性，能有效的控制庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊的质量。

附图说明

图1为庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒空白辅料的液相色谱图；

图2为庆大霉素普鲁卡因维b12胶囊空白辅料的液相色谱图；

图3为庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒供试品溶液的液相色谱图；

图4为庆大霉素普鲁卡因维b12胶囊供试品溶液的液相色谱图；

图5为维生素b12对照品溶液的液相色谱图；

图6为本发明制备的标准曲线溶液中维生素b12的浓度x（μg/ml）与峰面积y的线性关系图；

图7为采用本发明庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法对132批庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒样品进行测定得出的维生素b12的含量区间分布图；

图8为采用本发明庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法对47批庆大霉素普鲁卡因维b12胶囊样品进行测定得出的维生素b12的含量区间分布图；

图9为采用本发明庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法对15家企业生产的庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒样品进行测定得出的维生素b12的含量比较图；

图10为采用本发明庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法对9家企业生产的庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒样品进行测定得出的维生素b12的含量比较图；

图11为采用本发明庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法对4家企业生产的47批庆大霉素普鲁卡因维b12胶囊样品进行测定得出的维生素b12的含量比较图。

具体实施方式

实施例1

一、一种庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法，包括以下步骤：

（1）色谱条件与系统适用性试验：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：watersxbridgeshieldrp18，4.6×250mm，5μm，以甲醇-0.028mol/l磷酸氢二钠溶液（用磷酸调节ph值至3.2）为流动相，按下表1梯度洗脱，流速1ml/min；进样量：100μl，柱温：30℃，检测波长：362nm，理论板数按维生素b12峰计算不低于2000，维生素b12峰与降解产物峰（相对保留时间约0.9）的分离度大于3.0；系统适用性溶液的制备方法为：取维生素b12对照品10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入质量分数为1%的亚硫酸钠溶液5ml使其溶解，加水稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液；

（2）溶液制备：

①对照品溶液的制备：精密称取维生素b12对照品10.19mg置于100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得维生素b12对照品储备液，浓度为101.9μg/ml；精密量取1ml置于100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得维生素b12对照品溶液，浓度为1.019μg/ml；

②供试品溶液的制备：

庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒：称取本品适量，相当于维生素b1220μg，精密称定，置于棕色样品瓶中，精密加入20ml水，超声5min，振摇使其混匀，用0.45μm的滤膜过滤，即得；

庆大霉素普鲁卡因维b12胶囊：称取本品适量，相当于维生素b1210μg，精密称定，置于10ml量瓶中，加约5ml水，超声5min，用水定容至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，即得；

（3）测定:精密量取供试品溶液和对照品溶液各100ul注入液相色谱仪，照上述的色谱条件测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

二、本发明庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法的方法学验证情况如下：

1、专属性试验

通过问卷调查，了解到庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊各个厂家的处方工艺，综合各个厂家的处方情况，制备空白辅料（按各厂家提供的最大处方量称取）。分别称取庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊空白辅料，按照本发明检测方法中供试品溶液的制备方法制备空白辅料溶液，进样测定，同时取庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊样品按前述测定法中供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，进样测定；记录色谱图，结果空白辅料对测定无干扰（见图1-4），方法专属性好。

2、线性关系考察

分别精密量取前述庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法中制备得到的维生素b12对照品储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5ml置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得系列标准曲线溶液，进样测定，结果维生素b12在0.2038μg/ml～1.529μg/ml范围内线性关系良好，线性方程为y=93.873x+1.0652，相关系数r为1（见图6）。

3、溶液稳定性考察

取前述检测方法中制备得到的维生素b12对照品溶液，分别在放置0、2、4、6、8、10、12、16小时后进样测定，测定维生素b12的峰面积，结果表明溶液在16小时内稳定，维生素b12峰面积的rsd为0.6%（见表2）。

4、进样精密度试验

取前述检测方法中制备得到的维生素b12对照品溶液连续进样6针，结果维生素b12峰面积的rsd为1.2%（见表3），表明仪器精密度良好。

5、重复性试验

取江西红星药业有限公司的庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒样品（批号k171265）、回音必集团浙江齐齐制药有限公司样品（批号17011501），按照本发明检测方法中供试品溶液的制备方法制备成6份供试品溶液，进样测定，计算其平均含量及rsd，结果见表4。

结果表明该方法重复性良好。

6、加样回收率试验

精密量取前述检测方法中制备得到的维生素b12对照品储备液2ml置于100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液1，浓度为2.038μg/ml。取江西红星药业有限公司的庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒样品（批号k171265）约0.25g共9份，精密称定，置于棕色样品瓶中，平均分为三组，分别精密加入3、5、7ml对照品溶液1，按照本发明检测方法中供试品溶液的制备方法分别制备颗粒回收率溶液。取回音必集团浙江齐齐制药有限公司样品（批号17011501）约0.1g共9份，精密称定，置于10ml量瓶中，平均分为三组，分别精密加入3、5、7ml对照品溶液1，按照本发明检测方法中供试品溶液的制备方法分别制备胶囊回收率溶液。精密量取续滤液100μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算回收率，结果见表5-6，表明拟定方法具有良好的准确度。

7、定量限

当维生素b12进样量为20.38ng时，维生素b12色谱峰高与基线噪音比值为16.5:1，则方法的定量限为12.35ng。

三、应用效果

1、采用本发明庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法对不同企业生产的179批庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊样品进行检测，测定庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的情况，仪器与试药：仪器：agilent1200高效液相色谱仪；标准品：维生素b12标准品（批号100248-200201，中检院提供提供，含量：100.0%），水为超纯水。测定结果见表7-表8。

2、样品测定结果的分析

2.1含量总体分布情况

132批颗粒样品维生素b12含量区间分布见图7。132批颗粒样品维生素b12含量在0%～119.0%范围，含量差距较大。经统计分析，所有样品含量均值为77.2%，标准偏差为23.0%。

47批胶囊样品维生素b12含量区间分布见图8。47批胶囊样品维生素b12含量在55.4%～137.0%范围，含量差距较大。经统计分析，所有样品含量均值为108.5%，标准偏差为13.6%。

2.2各企业间维生素b12含量比较

对15家颗粒样品生产企业的132样品中维生素b12的含量进行分析（见图9），部分厂家不同批号的维生素b12的含量存在差异，其中浙江天瑞、海南亚洲的偏差较大，葵花药业未检出维生素b12。上海华源的大部分样品也偏低。

对含6批以上的9家企业含量进行单因素方差分析，其结果存在极显著性差异（p＜0.05），维生素b12含量除葵花药业外，以海南制药二厂的样品批间离散程度最小，变异系数为2.8%；海南亚洲的样品批间离散程度最大，变异系数为13.1%。海南亚洲维生素b12含量平均值最大，平均含量为98.3%，葵花药业平均值最小，平均含量为0%，结果见图10和表9。

对4家胶囊样品生产企业的47样品中维生素b12的含量进行分析（见图8），除海口奇力外其他三个厂家均只抽到3批，统计意义不大，海口奇力不同批号的维生素b12的含量存在差异。结果见图11和表10。

2.3综合分析

综合分析：①葵花药业未检出维生素b12，经分析，与该企业的配方中使用了无水亚硫酸钠有关，该辅料使维生素b12降解或与维生素b12反应。②由实验结果可知，颗粒的含量较胶囊含量低，可能与颗粒剂辅料较多，生产时易混不匀有关，也有可能与使用的糖的质量有关。③部分厂家批间含量相差较远，估计与生产工艺有关。

由实验结果统计，各限度范围内不合格批次见表11。因样品中维生素b12的标示含量分别为20μg/包，10μg/粒，含量较低，且样品为复方制剂，故暂定限度为80.0%～120.0%。按上述限度对132批颗粒样品进行判定，发现有56批样品不符合规定，占本次抽样量的42%，涉及厂家有葵花药业，上海华源，江西红星，杭州华东，浙江天瑞，海南天煌等厂家。对47批胶囊样品进行判定，发现有9批批样品不符合规定，占本次抽样量的19%，涉及厂家有海口奇力。

上述可见，采用本发明庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊中维生素b12含量的hplc检测方法，操作简单，检测效率高，误差小，适用性广；采用该方法对各个企业生产的庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊进行检测，能够快速准确的检测出维生素b12的含量，从而有利于对各个企业生产的庆大霉素普鲁卡因维b12颗粒/胶囊样品的质量进行判定。