一种快速鉴定蜂王浆功效的方法与流程

本发明涉及一种快速鉴定蜂王浆功效的方法，具体是利用突变体果蝇快速鉴定蜂王浆功效的生物学方法，属于生物
技术领域：
。技术背景蜂王浆(royaljelly)是工蜂咽下腺、上颚腺和脑后腺等组织分泌的供蜜蜂幼虫和蜂王食用的浆状物，对人体具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节等保健功能。蜂王浆作为营养保健品、药品、化妆品在国内外广泛应用。果蝇由于遗传背景清楚、操作方便、易于培养等特性，是评价蜂产品产品功效的良好模型。蜂王浆中的决定蜜蜂发育为蜂王的关键物质-royalactin在果蝇体内表现出重要的表型(参考文献1，masakikamakura,royalactininducesqueendifferentiationinhoneybees.nature,2011.26；473(7348):478-83.)。有研究表明蜂王浆可以增加果蝇体重、延长寿命等功效(参考文献2，supplementationwithmajorroyal-jellyproteinsincreaseslifespan,feeding,andfecundityindrosophila.journalofagriculturalandfoodchemistry,2016jul27；64(29):5803-12.)。但是通过检测蜂产品对果蝇寿命的影响操作时间较长、工作量大。技术实现要素：本发明针对上述现有技术的不足，提供一种快速鉴定蜂王浆功效的方法。本发明则充分利用突变体果蝇(nprl3)成活率低、抗氧化能力差和能量代谢有障碍的特性；利用新鲜蜂王浆处理突变体果蝇(nprl3)，使其上述缺陷得到明显改善的方法，来快速鉴定蜂王浆的功效。本发明的技术方案如下：一种快速鉴定蜂王浆功效的方法，其特征在于，使用突变果蝇评判蜂王浆生物学功效。优选地，使用torc1通路组成蛋白的突变体评判蜂王浆生物学功效。优选地，使用gator1复合体的组成蛋白的突变体评判蜂王浆生物学功效。优选地，使用nprl3突变果蝇进行评判蜂王浆生物学功效。优选地，在nprl3突变果蝇的培养基中添加质量百分比为10-20％的蜂王浆。tor(targetofrepemycin)通路是进化上十分保守的、广泛存在于各种生物细胞中，调节生长与代谢的关键通路。当营养充足时，tor通路被激活，促进蛋白、脂肪等物质的合成，从而促进细胞的生长；而当营养缺乏时，tor通路被抑制，细胞生长减缓并发生自噬反应，维持细胞的存活。tor的活化是细胞生长和代谢所必需的，但tor的过分活化会导致代谢加快，引起细胞损伤，促进细胞衰老。而机体衰老可能会导致机体内活性氧(ros)的堆积。研究表明tor通路的失调与肿瘤、神经退化疾病、糖尿病等衰老相关疾病密切相关(参考文献3，laplante,m.andd.m.sabatini,mtorsignalingingrowthcontrolanddisease.cell,2012.149(2):p.274-93.)。gator1是新发现的受氨基酸水平调节的、抑制tor活性的蛋白复合体，由nprl2、nprl3、iml1三个蛋白组成(参考文献4，bar-peled,l.,etal.,atumorsuppressorcomplexwithgapactivityfortheraggtpasesthatsignalaminoacidsufficiencytomtorc1.science,2013.340(6136):p.1100-1106)。通过研究发现，nprl3基因突变果蝇体内的tor活性增加；并且nprl3突变果蝇的成活率降低，只有约25％的果蝇卵能够发育为成虫(参考文献5，wei,y.,etal.thegator1complexregulatesmetabolichomeostasisandtheresponsetonutrientstressindrosophilamelanogaster.,g3(bethesda),2016.12.7,6(12):3859-3867.)本发明利用tor通路的抑制蛋白-nprl3的突变果蝇为对象，基于突变体果蝇成活率低，抗氧化能力差等特点，快速判断蜂王浆的功效。蜂王浆既是蜂王和幼虫的重要营养食料,也是决定蜜蜂级型分化的关键物质。蜂王浆中的活性物质成分及其功效是多年的研究热点。蜂王浆作为保健品在国内外受到了广泛的关注和使用，研究表明其具有很好的保健功能。而在如何快速鉴定蜂王浆功效方面则鲜有报导。传统的利用果蝇检测和鉴定蜂王浆功效的方法用时较长、工作量较大且不易操作。而本发明是一种利用nprl3突变体果蝇快速鉴定蜂王浆功效的生物学方法。利用新鲜蜂王浆对突变体果蝇成活率、体内氧化物水平、能量代谢等具有影响的特性进行快速分析，来检测蜂王浆功效。本发明可用于快速检测和鉴定蜂王浆的有效成分和生物学功效，评判蜂王浆质量。附图说明图1为突变体果蝇亲本杂交图；图2为在对照组培养基中添加2％、5％、10％、20％、40％的新鲜蜂王浆以及1.5％的酪蛋白作为对照，筛选出蜂王浆发挥效果的最适浓度；图3在最适浓度下蜂王浆对突变体果蝇体内丙二醛(mda)含量的影响；图4在最适浓度下蜂王浆对突变体果蝇体内过氧化氢酶(cat)活性的影响；图5在最适浓度下蜂王浆对突变体果蝇体内超氧化物歧化酶(sod)活性的影响；图6在最适浓度下蜂王浆对突变体果蝇体内甘油三酯(tg)含量的影响。具体实施方式1、实验条件和果蝇饲养(1)实验条件培养于人工气候箱25℃，60％相对湿度、12h光照12h黑暗。(2)果蝇培养基的配制对照组培养基配方为玉米粉50g、琼脂10g、酵母粉24g、白糖30g、丙酸3ml、去离子水1l。实验组培养基的配置：在对照组培养基中添加2％、5％、10％、20％、40％(质量百分比)的新鲜蜂王浆。对照组培养基配置过程：1)将称量好的蔗糖和琼脂一起倒入电磁炉中，加入适量水，加热充分搅拌；2)加热至沸腾；3)将已用水充分溶解好的玉米粉缓慢倒入锅中，持续搅拌；4)持续加热至沸腾；5)待混合物冷却至80℃左右，加入提前用温水溶解好的酵母，充分搅拌；6)加入适量丙酸溶液，充分搅拌；塞上棉花塞，保鲜膜封好放置4℃冰箱保存。实验组培养基制作过程：2％蜂王浆培养基：待对照组培养基冷却至40℃～50℃，取出100ml，向其中加入2g新鲜蜂王浆，充分混匀，分装保存。5％蜂王浆培养基：待对照组培养基冷却至40℃～50℃，取出100ml，向其中加入5g新鲜蜂王浆，充分混匀，分装保存。10％蜂王浆培养基：待对照组培养基冷却至40℃～50℃，取出100ml，向其中加入10g新鲜蜂王浆，充分混匀，分装保存。20％蜂王浆培养基：待对照组培养基冷却至40℃～50℃，取出100ml，向其中加入20g新鲜蜂王浆，充分混匀，分装保存。40％蜂王浆培养基：待对照组培养基冷却至40℃～50℃，取出100ml，向其中加入40g新鲜蜂王浆，充分混匀，分装保存。1.5％酪蛋白培养基：待对照组培养基冷却至40℃～50℃，取出100ml，向其中加入1.5g酪蛋白，充分混匀，分装保存。(3)亲本果蝇挑选将基因型为nprl3-/tm3sb品系果蝇和基因型为df/tm3gfp品系的两种果蝇利用co2麻痹后，在挑蝇板中进行雌雄挑选，亲本雌雄任意组合进行杂交；雌果蝇必须为未交配过的处女蝇。(4)果蝇传代将(3)挑选好的亲本果蝇放置于对照组培养基和实验组培养基使其产卵；每隔24h换一次培养基，连续更换十次。(5)突变体果蝇(nprl3)成活率计算nprl3-/tm3sb和df/tm3gfp果蝇产卵孵化，f1代有三种基因型分别为nprl3-/df、df/tm3、nprl3-/tm3。nprl3-/df为突变体果蝇，df/tm3和nprl3-/tm3为正常果蝇。根据孟德尔遗传定律，f1代中可存活的三种基因型羽化成虫的数量比例为1:1:1，但有研究表明突变体果蝇(nprl3-/df)与另外两种基因型的比例为0.25:1:1。说明本发明所需的突变体果蝇(nprl3)具有成活率低的特性。而本发明则利用这种突变体果蝇成活率低的特性，进行蜂王浆功效的快速鉴定。突变体果蝇(nprl3)的成活率计算方法为：nprl3-/df雌雄数量*2/(df/tm3雌雄数量+nprl3-/tm3雌雄数量)2、氧化指标检测(1)蛋白浓度本发明在检测各项氧化指标时，根据试剂盒说明书需要知道样本的蛋白浓度；本发明采用bca法测定样本蛋白浓度。测定原理：在碱性环境下蛋白质分子中的肽链结构能与cu2+络合生成络合物，同时将cu2+还原成cu+。bca试剂可敏感特异地与cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物。在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来测定蛋白质的含量。检测步骤：a、取实验组和对照组培养基中f1代中雄性突变体果蝇(nprl3)、野生型果蝇(yw)各20只，按1只10μlpbst的比例，加入200μl的pbst充分研磨，13000rpm离心10min，去上清带测定。b、取a中上清40倍稀释。c、按下表制备标准品，用于制作标准曲线管号稀释液用量bsa标准品用量(μl)bsa标准品最终浓度(μg/μl)a0102b20201c2020(从b管取出)0.5d2020(从c管取出)0.25e2020(从d管取出)0.125f2020(从e管取出)0.0625g2000d、bca工作液的制备1)bca工作液总量＝(7个bsa标准品样本+2个未知样本)×2个复孔×100μl/每个样本工作液体积；2)根据计算出的bca工作液需要总量，将bca-a和bca-b按照50:1的体积比，配制bca工作液，充分混匀。e、蛋白浓度测量1)按步骤c中表格，将稀释好的a-gbsa标准品和待测蛋白样品(稀释液)各10μl分别加到作好标记的96孔板微孔中。2)每孔加入100μlbca工作液，充分混匀，盖上96孔板盖，37℃孵育30分钟，冷却至室温，3-5分钟内完成检测。3)用酶标仪在562nm范围内，测定每个样品及bsa标准品的吸光值，同时做好记录。4)绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。(2)丙二醛(malondialdehyde,简称mda)机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物，而丙二醛(mda)是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤因此在抗氧化研究中mda含量是一个常用指标，可通过mda了解膜脂过氧化的程度，以间接测定机体的氧化程度。测定原理：本发明采用的是硫代巴比妥酸(tba)法。过氧化脂质降解产物丙二醛(mda)可与硫代巴比妥酸(tba)缩合形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。检测步骤：a、取实验组和对照组培养基中f1代中雄性突变体果蝇(nprl3)、野生型果蝇(yw)各20只，按1只10μlpbst的比例，加入200μl的pbst充分研磨，13000rpm离心10min，取上清带测定。b、按下表加入试剂：c、充分混匀后，将1.5mlep管用封口膜扎紧，并在封口膜上扎几个小孔，在95℃金属浴中加热1h。d、取出流水冷却，4000rpm，离心10min。e、取上清200μl加入至酶标板中，532nm处测量吸光值。f、根据公式：蛋白浓度为(1)中计算得出的蛋白浓度。(3)超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,简称sod)sod是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物、植物、微生物等。sod在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；sod的检测通常与mda相互配合，sod活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而mda的高低又反应了机体受自由基攻击的严重程度。测定原理：本发明测定sod的方法为水溶性四唑盐法(wst-1法)其原理是wst-1是一种类似于mtt的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒。检测步骤：a、取实验组和对照组培养基中f1代中雄性突变体果蝇(nprl3)、野生型果蝇(yw)各20只，按1只10μlpbst的比例，加入200μl的pbst充分研磨，13000rpm离心10min，取上清带测定。b、按下表加入试剂：对照孔对照空白孔测定管测定空白孔待测样品(μl)--1010双蒸水(μl)1010--酶工作液(μl)10-10酶稀释液(μl)-10-10底物应用液(μl)100100100100c、充分混匀后，37℃孵育20min。d、酶标仪450nm处测定吸光值。e、根据公式计算出sod的抑制率：f、根据公式计算出sod的活力：蛋白浓度为(1)中计算得出的蛋白浓度。(4)过氧化氢酶(catalase，简称cat)过氧化氢酶(cat)是一种酶类清除剂，它可促使h2o2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受h2o2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。测定原理：本发明测定cat的方法为：过氧化氢酶(cat)分解h2o2的反应可通过加入钼酸铵而迅速停止，剩余的h2o2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其变化量，可计算出cat的活力。检测步骤：a、取实验组和对照组培养基中f1代中雄性突变体果蝇(nprl3)、野生型果蝇(yw)各20只，按1只10μlpbst的比例，加入200μl的pbst充分研磨，13000rpm离心10min，取上清带测定。b、按下表加入试剂：对照管测定管组织匀浆(μl)-5试剂一(μl)100100试剂二(μl)1010c、充分混匀后，37℃准确反映1min。d、按下表继续加入试剂：对照管测定管试剂三(μl)100100试剂四(μl)1010组织匀浆(μl)5-e、充分混匀后，酶标仪405nm处测定吸光值。f、根据公式计算出cat的活力：*271为试剂盒中给出的标准曲线斜率的倒数；蛋白浓度为(1)中计算得出的蛋白浓度。(5)甘油三酯(triglyceride，简称tg)甘油三酯(tg)即脂肪是甘油的三个羟基分别被相同的或不同的脂肪酸酯化形成的酯，其酯酰键组成复杂，长度和把合度多种多样。甘油三酯(tg)是机体内提供能量的重要物质。测定原理：检测步骤：a、取实验组和对照组培养基中f1代中雄性突变体果蝇(nprl3)、野生型果蝇(yw)各20只，按1只10μlpbst的比例，加入200μl的pbst充分研磨，13000rpm离心10min，取上清带测定。b、按下表加入试剂：空白管标准孔测定孔蒸馏水(μl)3--2.26mmol/l标准品(μl)-3-样品(μl)--3工作液(μl)300300300c、充分混匀后37℃反应5mind、酶标仪546nm处，测定每孔吸光值。e、根据公式计算出tg含量蛋白浓度为(1)中计算得出的蛋白浓度。结果介绍(1)计算对照组和实验组培养基中f1代中突变体果蝇(nprl3)的成活率并根据成活率寻找蜂王浆添加的最适浓度，1.5％的酪蛋白作为对照。结果显示：在对照培养基中加入不同浓度的新鲜蜂王浆后nprl3的成活率增加，蜂王浆浓度在10％和20％时，nprl3突变果蝇成活率有显著增加，浓度达到20％时最为显著(***p＜0.005)，如图2。(2)以20％蜂王浆浓度的培养基作为实验组。以对照组培养基中培养的nprl3、yw为对照。取相同数量的对照组和实验组的羽化了1-3天的雄性nplr3、yw检测体内的超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)活力和丙二醛(mda)含量的改变情况。结果显示：丙二醛(mda)是机体活性氧过量堆积的产物，在含有20％新鲜蜂王浆的培养基中的nprl3果蝇体内的丙二醛(mda)含量比对照培养基中的nprl3果蝇体内的丙二醛含量显著降低(**p＜0.01)，如图3，说明蜂王浆可以降低机体体内的活性氧堆积达到抗氧化的功效。而另一方面在对照组培养基中nprl3果蝇的cat和sod活性显著高于野生型果蝇，而在含有20％蜂王浆的实验组培养基中，nprl3果蝇的sod和cat活性显著降(***p＜0.005,**p＜0.1)，如图4、图5。(3)以20％蜂王浆浓度的培养基作为实验组。以对照组培养基中培养的nprl3、yw为对照。取相同数量的对照组和实验组的羽化了1-3天的雄性nplr3、yw检测体内的能量代谢情况；也就是tg含量的变化情况。结果显示：甘油三酯(tg)是果蝇体内能量的主要来源；而经检测对照组中的nprl3果蝇体内的tg含量要比野生型果蝇(yw)显著降低(***p＜0.01)，如图6，说明突变体果蝇(nprl3)在能量代谢方面有一定的缺陷；而在含有20％蜂王浆的实验组培养基中羽化的突变体果蝇(nprl3)经检测体内tg的含量要显著高于对照组中的突变体果蝇(nprl3)(***p＜0.01)，如图6。综上所述，蜂王浆能够给机体提供能量来源并且具有良好的抗氧化功效，在本发明中利用果蝇杂交等方法制备出具成活率低特性的突变体果蝇为模型，先通过在对照组培养基中加入不同浓度的新鲜蜂王浆，通过计算突变体果蝇的成活率来确定加入的最适蜂王浆浓度。通过检测nprl3突变体果蝇的氧化水平和能量代谢情况，发现成活率蜂王浆果蝇体内的能量储存增加、氧化水平降低。表明nprl3突变体成活率增加这一表型反映了蜂王浆的抗氧化、调节代谢的生物学功效。因此可以用nprl3突变果蝇成活率改变这一方法快速鉴定蜂王浆的成分。当前第1页12