一种用于胃肠道间质肿瘤迁移的标志物ACK1及其应用的制作方法

本发明涉及作用于gist肿瘤迁移的标志物，属于生物医学分析领域。

背景技术：

胃肠道间质瘤(gastrointestinalstromaltumors,gist)是最常见的胃肠道间质肿瘤，每年每百万人群中就有6.8个人被检查出患有gist，患者为中老年居多，还有不到1%的gists年龄在20岁以下。gist通常原发于胃部（68%）和小肠（25-30%）。受体酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase,rtk）kit与血小板源性生长因子受体α多肽（platelet—derivedgrowthfactorreceptoralpha，pdgfra）基因突变是gist发生与转移的主要因素。研究证明，gists有85%kit突变或10-15%pdgfra基因突变。还有10-15%不存在kit/pdgfra突变的gists，常称之为“wildtype”gist。目前，gist的主要诊断标志物包括kit（cd117）、pkcθ（prkcq）、dog1、caii四个。

gist在近几十年经历了单纯性的手术治疗→靶向治疗→综合治疗→个体化治疗这一系列的快速发展。手术切除治疗复发率高，放化疗更是弊大于利，因此酪氨酸激酶抑制剂tki是许多gist患者的最佳选择，伊马替尼（imatinib,im）是治疗gist的首选药物。由于kit与pdgfra基因在gist内高频率突变，im对于大多数gist患者治疗效果良好，但在用药2-3年后均不同程度地出现了耐药现象。

ack1（activatedcdc42-associatedkinase1）是一种非受体酪氨酸激酶，位于细胞质，主要传导跨膜蛋白(rtk)接收的胞外信号到下游通路。ack1基因位于3号染色体29，其编码蛋白含1091个氨基酸残基，分子量为145kda。ack1在胃癌、肺癌等常见肿瘤中的高表达以及对肿瘤生长、迁移和浸润等方面所起的重要作用。aim-100是ack1特异性靶向抑制剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于为gist诊断和抑制迁移寻找新的标志物。其方法目的是通过如下技术方案来完成的，一种用于胃肠道间质肿瘤迁移的标志物ack1及其应用，所述该标志物有以下两个特征：第一，它与癌旁正常组织相比，ack1在gist细胞中高表达且激活；第二：靶向抑制ack1能抑制gist细胞的迁移。

作为优选：检测ack1在gist细胞中高表达且激活的步骤为：

a.将肿瘤组织和癌旁组织破碎；细胞用预冷的pbs清洗一遍；加入蛋白裂解缓冲液收集裂解液转移至1.5mlep管中；放于4℃冰箱的转盘上旋转过夜；13,000rpm、4℃离心30min；将上清液移至新离心管中，记录体积。测量蛋白浓度，定量至2μg/μl并与loadingbuffer混匀。将蛋白样品放入100℃金属浴煮沸10min，离心，sds-page凝胶电泳;westernblot,ecl显色液a液和b液按1:1混合后滴到膜上，用超灵敏化学发光成像仪成像；

b.免疫共沉淀：裂解细胞，蛋白定量如步骤a；加入琼脂糖珠4℃混合30min，取上

清加入抗体4℃旋转混合2h，4℃离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用裂解缓冲液洗3次；加20μlloadingbuffer，沸水煮10分钟；sds-page，westernblot。

作为优选：靶向抑制ack1能抑制gist细胞的迁移的检测包括如下步骤：

a.伤口愈合实验：接种细胞至六孔板里，放置细胞培养箱中培养过夜；第二天用100

μl枪头垂直划三条竖线；用pbs漂洗2次，加入新鲜含药物的培养基培养；选取固定时间点进行拍照记录，直至对照组伤口愈合。

b.基质胶transwel细胞侵袭实验：预冷24孔板与小室，将无血清培养基稀释的基质胶铺于小室；待基质胶凝固接种细胞于小室，小室内为含药无血清培养基，孔内为含药正常培养基；48h后吸去小室内培养基，pbs清洗小室，加入甲醇固定细胞晾干；加入结晶紫将细胞染色，拍照。

ack1是一种非受体酪氨酸激酶，位于细胞质，主要传导跨膜蛋白接收的胞外信号到下游通路。ack1基因位于3号染色体29，其编码蛋白含1091个氨基酸残基，分子量为145kda。ack1在胃癌、肺癌等常见肿瘤中的高表达以及对肿瘤生长、迁移和浸润等方面所起的重要作用。aim-100是ack1特异性靶向抑制剂。

附图说明

图1是ack1在gist肿瘤细胞株的表达，

图2是ack1在gist肿瘤组织和癌旁组织中的表达，

图3是ack1与kit免疫共沉淀，py99染色结果，

图4是ack1靶向抑制对gist-t1细胞迁移的影响，

图5是ack1靶向抑制对gist430细胞迁移的影响，

图6是ack1靶向抑制对gist-t1细胞侵袭的影响，

图7是ack1靶向抑制对gist430细胞侵袭的影响，

图8是ack1靶向抑制对gist-t1、430细胞侵袭定量分析结果。

具体实施方式

下面将结合具体实施例以及附图对本发明作详细介绍，本发明在实施中选用的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一种用于gist肿瘤诊断与迁移的标志物，其特征在于所述两个方面的内容中，分别包含有如下步骤：

第（1）方面的内容中包括如下三个步骤：

a.将gist细胞裂解，westernblot；

b.将肿瘤组织和癌旁组织裂解，westernblot；

c.ack1与kit免疫共沉淀，py99染色；

第（2）方面的内容中包括如下两个步骤：

d.将gist细胞接种至六孔板中，第二天，用10μl枪头垂直划线，使用含不同浓度药物培养基培养，每天定点拍照，直至对照组伤口愈合；

e.将gist-t1、gist430基质胶transwell细胞侵袭实验。

本发明的要点是首先通过westernblot检测ack1在细胞株、肿瘤样本及癌旁组织中的表达，再通过ack1与kit免疫共沉淀检测ack1的激活，最后通过伤口愈合实验和基质胶细胞侵袭实验证明单靶向抑制ack1可以抑制gist细胞迁移；具体包括以下步骤：

a.肿瘤组织和癌旁组织破碎；细胞用预冷的pbs清洗一遍；加入蛋白裂解缓冲液；收

集裂解液转移至1.5mlep管中；放于4℃冰箱的转盘上旋转过夜；13,000rpm、4℃离心30min；将上清液移至新离心管中，记录体积。测量蛋白浓度，定量至2μg/μl并与loadingbuffer混匀。将蛋白样品放入100℃金属浴煮沸10min，离心，sds-page凝胶电泳;westernblot,ecl显色液a液和b液按1:1混合后滴到膜上，用超灵敏化学发光成像仪成像。细胞株显影结果如图1，gist细胞株包括gist-t1、gist882、gist48、gist430、gist62、gist522、gist48b、gist430b，其中，gist-t1、giat882为kit一次点突变，是im敏感型细胞株；gist48、gist430为kit两次点突变，是im耐药性细胞株；gist62、gist522、gist48b、gist430b为kit表达丢失细胞株，对im抗药。肿瘤组织和癌旁组织显影结果如图2，其中n为癌旁组织，t为肿瘤组织。本实验重复三次。

结果表明ack1在gist细胞株和肿瘤组织中高表达，在癌旁组织中不表达。

b.免疫共沉淀：裂解细胞，蛋白定量如步骤a；加入琼脂糖珠4℃混合30min，取上

清加入抗体4℃旋转混合2h，4℃离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用裂解缓冲液洗3次；加20μlloadingbuffer，沸水煮10分钟；sds-page，westernblot，结果如图3。本实验重复两次。

结果表明，ack1以gist细胞中磷酸化形式激活。

c.伤口愈合实验：接种细胞至六孔板里，放置细胞培养箱中培养过夜；第二天用100

μl枪头垂直划三条竖线；用pbs漂洗2次，加入新鲜含药物的培养基培养；选取固定时间点进行拍照记录，直至对照组伤口愈合，结果如图4、图5。本实验重复3次。

结果表明，在im敏感型细胞株gist-t1和im耐药性细胞株gist430中，靶向抑制ack1均能抑制gist细胞的迁移。

d.基质胶transwel细胞侵袭实验：预冷24孔板与小室，将无血清培养基稀释的基质

胶铺于小室；待基质胶凝固接种细胞于小室，小室内为含药无血清培养基，孔内为含药正常培养基；48h后吸去小室内培养基，pbs清洗小室，加入甲醇固定细胞晾干；加入结晶紫将细胞染色，拍照，结果如图6、图7；用醋酸将染色细胞洗脱下来测od值分析，结果如图8。本实验重复3次。

结果表明，单靶向抑制ack1能抑制gist细胞侵袭。