一种便携式AHL分子印迹丝网印刷电化学检测仪的制作方法

本发明涉及一种便携式ahl分子印迹丝网印刷电化学检测仪，属于快速检测技术领域。

背景技术：

群体感应是细菌生长到一定密度时相互感应，并进行基因表达及调控产生的独特、多样的群体行为现象。n-酰基高丝氨酸内酯(ahl)类化合物是革兰阴性菌群体感应中最重要的一类信号分子，调控许多生理特性基因的表达。快速、简便、有效地检测细菌能否产生ahl，成为深入研究和了解细菌群体感应的重要手段。

ahl分子的各种检测方法原理各不相同，每种方法均由自己的优点和缺点，但因现代化食品工业对检测方法灵敏度及准确度要求的提高，有很多方法已不适合检测的需要。因此建立一种灵敏、快速、简便、特异性高且经济的检测方法是生产经营企业、质控人员、进出口检商、政府管理部门的迫切需要和食品、环境安全的有力保障。

目前，检测信号分子ahl的方法通常有3种:①理化手段，主要通过高效液相色谱(hplc)气质联用(gc-ms)技术检测纯化来自液体培养基的标本，该方法除能定量外，还能鉴定ahl的性质；②利用传感菌的生物学方法，即群体感应系统控制的色素或荧光如绿色荧光蛋白1的产生来检测ahl的存在；③结合物理、化学手段和生物发光的薄层层析。然而上述方法操作复杂、成本高且灵敏度和检测限较低，因此，开发一种便捷、灵敏的检测方法非常必要的。

分子印迹又称“人造抗体”，对环境的要求不高，不需要特别的保存方式，分子印迹检测方法是一种便捷、灵敏的检测途径。然而，现有报道中报道的分子印迹检测方法均是基于一次性分子印迹膜进行检测，虽然便携但是资源浪费严重，检测是消耗的分子印迹膜数量较大；同时，不同检测对象在不同方法制备得到的分子印迹膜下进行电化学检测，表现注不同的数据预测规律，构建的数据模型也各异。因此，开发一种非一次性的、可灵敏检测ahl的便携式ahl分子印迹丝网印刷电化学检测仪是有重要的市场意义的。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供了一种用于快速检测ahl的分子印迹丝网印刷电化学检测仪。本发明通过在工作电极表面滴涂金纳米十字，然后以ahl分子类似物为模板，采用表面印迹技术将含金电极置于含有单体、交联剂、模板、引发剂的电聚合液中进行电聚合，洗脱模板分子，得到ahl分子印迹丝网印电极，基于该电极，配合特定的电化学检测条件，取得吸附前后的峰电流差值，利用待测物质的浓度与峰电流差值得到标准曲线，计算出ahl含量。本发明检测仪对ahl分子的直接检测，具有灵敏、快速、循环多次使用、特异性高等优点，并且价格低廉，适用于基层或现场检测ahl分子。

本发明的第一个目的是提供一种检测n-酰基高丝氨酸内酯的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)制备n-酰基高丝氨酸内酯分子印迹丝网印刷电极：在丝网印刷电极的工作电极表面滴涂金纳米十字，通过金巯键修饰对巯基苯胺，然后浸于模板分子溶液中，再置于电聚合液中电镀聚合，洗脱模板分子，使工作电极表面电镀了分子印迹聚合物膜，即得到分子印迹丝网印刷电极；

(2)将电导液25μl～50μl滴加到n-酰基高丝氨酸内酯分子印迹丝网印刷电极表面，然后将n-酰基高丝氨酸内酯分子印迹丝网印刷电极水平插入电化学检测器中进行检测，测得吸附前电流值；

(3)将含有待测样品的电导液25μl～50μl加到n-酰基高丝氨酸内酯分子印迹丝网印刷电极表面进行静置吸附，然后将n-酰基高丝氨酸内酯分子印迹丝网印刷电极水平插入电化学检测器中进行检测，测得吸附后电流值；

(4)根据步骤(2)、(3)计算得到峰电流差值，根据待测样品中待测物质的浓度与峰电流差值的标准曲线，计算得到待测样品中n-酰基高丝氨酸内酯的浓度。

在本发明的一种实施方式中，所述峰电流差值＝吸附后电流值-吸附前电流值。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中吸附的时间为180s。

在本发明的一种实施方式中，所述模板分子为呋喃酮。

在本发明的一种实施方式中，所述标准曲线的获得方法是：制备含有不同已知浓度的n-酰基高丝氨酸内酯电导液和单纯电导液，滴加到n-酰基高丝氨酸内酯分子印迹丝网印刷电极表面，并插入到电化学检测器中，检测电子从对电极，经过电导液，再从工作电极流回工作站时形成的电流峰值，得到不同n-酰基高丝氨酸内酯浓度下的峰电流差值，以n-酰基高丝氨酸内浓度为横坐标，峰电流差值为纵坐标，即得到标准曲线。

在本发明的一种实施方式中，电导液中n-酰基高丝氨酸浓度范围为1×10^-13～1×10^-9mol·l^-1。

在本发明的一种实施方式中，电化学检测器的电压设置范围为-0.2v～0.4v。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)或步骤(3)中电导液的用量优选40μl。

本发明的第二个目的是提供一种可应用于上述检测方法的便携式n-酰基高丝氨酸内酯分子印迹丝网印刷电化学检测仪，包括外插型n-酰基高丝氨酸内酯分子印迹丝网印刷电极和电化学检测器，其运行方式是将含有待测样品的电导液25μl～50μl滴加到n-酰基高丝氨酸内酯分子印迹丝网印刷电极表面，静置吸附180s，然后将电极插入电化学检测器的卡槽内，检测读取峰电流值，得到峰电流差值；所述n-酰基高丝氨酸内酯分子印迹丝网印刷电极的制备方法包括如下步骤：在丝网印刷电极的工作电极表面滴涂金纳米十字，通过金巯键修饰对巯基苯胺，然后浸于模板分子溶液中，再置于电聚合液中电镀聚合，洗脱模板分子，使工作电极表面电镀了分子印迹聚合物膜，即得n-酰基高丝氨酸内酯分子印迹丝网印刷电极。

在本发明的一种实施方式中，所述电化学检测器的电压设置范围：-0.2v～0.4v。

在本发明的一种实施方式中，所述分子印迹丝网印刷电极，包括电极基片、接线端子、电极连线、工作电极、对电极、绝缘层；所述工作电极表面电镀了分子印迹聚合物膜。

在本发明的一种实施方式中，所述分子印迹丝网印刷电极的制备方法具体包括：在普通丝网印刷电极的工作电极表面滴涂金纳米十字溶液(金纳米层可以增强而后电聚合的分子印迹聚合膜的接触比表面积，增加电子传递速率，从而增大灵敏度)，烘干；再通过金巯键修饰对巯基苯胺，其浸置1mmol·l-1呋喃酮溶液中，室温孵育4h，再置于电聚合液中，电镀聚合，模板分子洗脱，使工作电极表面电镀了分子印迹聚合物膜，即得到分子印迹丝网印刷电极。

在本发明的一种实施方式中，所述金纳米十字溶液是利用5ml的0.5mmol·l-1haucl4与5ml的0.2mol·l-1ctab混合，加入400μl超纯水，再加入0.6ml的0.01mol·l-1nabh4，搅拌2min，静置30min后得到金种；将0.9gctab与0.08g水杨酸钠用25ml超纯水50℃加热溶解，冷却至30℃，加入0.6ml的4mmol·l-1agno3、1028.8μl的24.28mmol·l-1和23.9712ml超纯水，搅拌15min，加入700μl的0.1mol·l-1的vc，剧烈搅拌30s，直至溶液无色。最后将金种加入上述溶液，搅拌30s，30℃静置生长12h。

在本发明的一种实施方式中，所述电聚合液包括5-15mmol/l对巯基苯胺、30-80mol/l四丁基高氯酸铵、5-15mol/l4,4’-联吡啶，0.2-0.6g/l高氯酸。

在本发明的一种经优化的实施方式中，所述电聚合液含有10mmol·l^-1对巯基苯胺，50mmol·l-1四丁基高氯酸铵，1mmol·l-1呋喃酮和0.4g/l高氯酸。

在本发明的一种经优化的实施方式中，所述电镀聚合的具体条件是：电聚合电压为-0.3v-1.2v，扫描速率为50mv/s，最佳扫描圈数为10圈。

在本发明的一种实施方式中，所述模板分子洗脱是将电极在含有乙醇水溶液(4：1，v/v)中浸泡10min，然后将工作电极用超纯水淋洗。

在本发明的一种实施方式中，所述分子印迹丝网印刷电极，电极基片可多次使用，工作电极，对电极与参比电极由电极连线导出，形成凸型三线式插口，可插入便携式电化学检测器，检测读数。

在本发明的一种实施方式中，所述分子印迹丝网印刷电极，其电极基片印制了接线端子、电极连线与工作电极连成一体的一条电极基体和接线端子、电极连线与对电极连成一体的另一条电极基体，两条电极连线相互平行，电极连线在电极基体的中间部分，其表面涂覆一层pvc绝缘体。

在本发明的一种实施方式中，所述分子印迹丝网印刷电极，工作电极的形状为圆形块状，对电极的形状为与工作电极同心相离的半圆环形块状，工作电极表面电镀聚合ahl分子印迹膜。

在本发明的一种实施方式中，所述电化学检测器包括简易式电化学工作站，配备led显示屏，展青霉素浓度与电流峰值差值的标准曲线已内置于便携式电化学检测器程序中，待测样品中目标物质浓度能显示于led显示屏上。

本发明的第三个目的是提供一种所述检测仪的应用，所述应用是：先插入标准品分子印迹丝网印刷电极(吸附前标准品和吸附后标准品)，根据峰电流差值与ahl样品浓度的标准曲线来校正便携式检测器的检测结果，然后再插入完成待测样品吸附的分子印迹丝网印刷电极测试。

所述的应用，在本发明的一种实施方式中，是插入两种浓度以上的标准品分子印迹丝网印刷电极(每种浓度对应的电极包括吸附前标准品和吸附后标准品)对检测器进行校正。

所述标准曲线的制备方法，在本发明的一种实施方式中，是：在洗脱后的分子印迹丝网印刷电极上滴加电导液，测峰电流值，配置含有不同已知浓度的被测物质的水溶液(超纯水)，滴加到该被测物质的分子印迹丝网印刷电极中(该标准浓度的被检测物用于标准曲线的设置)，吸附一定时间后冲洗，再滴上电导液，由便携式检测器检测，记录数据计算被测物质溶液溶液中物质浓度与峰电流差值(吸附前电流值减去吸附后电流值)之间的标准曲线。根据标准曲线进行校正，用于实际样品检测分析时，系统内部的技术参照。

所述应用，在本发明的一种实施方式中，是用于检测ahl。所述分子印迹丝网印刷电极为ahl分子印迹丝网印刷电极，所述标准曲线为y＝0.56439lgx+8.57752(r²＝0.94637)，检测限为10^-11mol·l^-1。

本发明的第四个目的是将上述的检测方法或上述的检测仪应用于细菌群体感应方面。

本发明有如下的有益效果：

(1)本发明便携式检测器小巧、快速，180s吸附后进行检测得准确数据；同时，本发明检测器灵敏度高，检测限可达10^-11mol·l^-1，循环使用5次，数据准确性仍较高，真实值与测定值之间的差异不超过8％。本发明检测仪具有灵敏、快速、多次循环使用、特异性高等优点，并且价格低廉，适用于基层或现场检测ahl分子。

(2)本发明的丝网印刷电极表面滴涂金纳米十字，增强了电镀聚合的分子印迹聚合膜的接触比表面积，同时增加电子传递速率，增大灵敏度，使得电极的响应信号增强，所测得的测定值与真实值之间的差异不超过10％，数据准确度高。

(4)本发明检测方法采用分子印迹聚合膜来作为识别靶点，检测特异性强，同时分子印迹电化学传感器兼具有可以实现现场检测，不受样品颜色、浊度的影响，样品可以不经复杂处理、无需分离的优点。结合能够快速灵敏检测的电化学分析方法，加上丝网印刷电极的低成本、高性能，使得能够快速(在获得待测样品提取液之后，可以在几分钟内完成检测，吸附前的峰电流值可以提前检测并记录，这样只需要再获得吸附后的峰电流值即可)、便捷的检测样品中的ahl分子。

(5)本发明检测仪是一种能够真正的解决市场需要，能够满足工商部门，质检机构，科研高校等机构的检测需要的快速检测产品，可用于生产经营企业、质控人员、进出口检商、政府管理部门、医院甚至个人家庭的使用，适用于食品工业、饲料行业、环境保护、医学药筛和生物化学等领域。

附图说明

图1：ahl分子印迹丝网印刷电极片的制备示意图；

图2：便携式ahl分子印迹电化学检测仪结构图；

图3：便携式ahl分子印迹电化学检测仪标准曲线检测；

图4：滴加金纳米十字前后电极的循环伏安曲线图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1ahl分子印迹丝网印刷电极的制备

ahl分子印迹丝网印刷电极片的制备示意图如图1所示。具体制备方法如下：

(1)在工作丝网印刷电极表面滴加金纳米十字，滴涂方法：将配置好的金纳米十字溶液滴涂在工作电极表面，置于红外灯下烘干，以完成金纳米十字的滴加。通过滴涂金纳米十字可以使电极在cv图上峰电流值增高，即增大电极的灵敏度，如图3所示。

(2)通过金巯键修饰对巯基苯胺，修饰方法：将滴涂金纳米粒子的丝网印刷电极浸置于50mmol·l-1对巯基苯胺乙醇溶液中，室温浸泡24h，之后用乙醇和水彻底清洗去除未吸附的对巯基苯胺，氮气吹干备用；

(4)再将修饰了对巯基苯胺的丝网印刷电极浸置1mmol·l-1呋喃酮溶液中，室温孵育4h，乙醇和超纯水洗涤后，氮气吹干备用；再将静电吸附后的丝网印刷电极浸入10ml含有10mmol·l-1对巯基苯胺，50mmol·l-1四丁基高氯酸铵，1mmol·l-1呋喃酮和0.4g·l-1高氯酸，采用循环伏安法扫描，电聚合电压为：-0.3v-1.2v，扫描速率为：50mv/s，扫描圈数为：10；

(5)最后洗脱模板分子，将电聚合ahl分子印迹膜的丝网印刷电极浸置于乙醇水溶液(4：1，v/v)中浸泡10min，然后将丝网印刷电极用超纯水淋洗，已完成ahl分子印迹膜的丝网印刷电极的制备。

实施例2便携式ahl分子印迹丝网印刷电化学检测仪

便携式ahl分子印迹电化学检测仪结构图如图2所示，构造如下：

实施例1所得的分子印迹丝网印刷电极包括电极基片、接线端子、电极连线、工作电极、对电极、绝缘层；所述工作电极表面电镀了分子印迹聚合物膜；电极基片为一次性消费基片，工作电极，对电极与参比电极由电极连线导出，形成凸型三线式插口，可插入便携式电化学检测器，检测读数。其电极基片印制了接线端子、电极连线与工作电极连成一体的一条电极基体和接线端子、电极连线与对电极连成一体的另一条电极基体，两条电极连线相互平行，电极连线在电极基体的中间部分，其表面涂覆一层pvc绝缘体。工作电极的形状为圆形块状，对电极的形状为与工作电极同心相离的半圆环形块状，工作电极表面电镀聚合ahl分子印迹膜。

便携式电化学检测仪为已设定电压的简易式电化学工作站，配备由led显示屏，用于记录由对电极流出的电子，流经样品或电导液，再从工作电极流回工作站时形成的电流值。该电流会被电化学检测器记录，通过与标准浓度的ahl分子印迹丝网印刷电极制备得到的标准曲线计算，以浓度的形式显示在led显示屏上。

样品测试步骤如下：

首先用标准(已知浓度的ahl)分子印迹丝网印刷电极插入到便携式检测器，校正便携式检测器的检测结果。然后将提纯后的ahl样品制成水溶液(超纯水)，滴加ahl样品水溶液40μl在制备好的ahl分子印迹膜的丝网印刷电极表面，静置吸附时间为：180s，吸附完成后冲洗，再滴加电导液，电导液的配置：2.5mmol·l^-1[fe(cn)6]^3/4和0.1mol·l^-1kcl溶液，电压设置范围：-0.2v～0.4v，记录扫描中的电流峰值，根据内置于ahl专用便携式检测器内的ahl浓度与电流峰差值之间的标准曲线进行计算，最后将测得的样品中ahl的浓度显示在led屏上。

实施例3标准曲线

在本发明的一种便携式检测器中，为ahl专用便携式检测器，ahl浓度与峰电流差值之间的标准曲线已内置于检测器程序。

该标准曲线的绘制方法：制备不同已知浓度(浓度范围：1×10^-13～1×10^-9mol·l^-1)的ahl分子印迹丝网印刷电极插入到检测器中，检测电子从对电极，经过电导液，再从工作电极流回工作站时形成的电流峰值，以ahl浓度为横坐标，峰电流值为纵坐标，即得到标准曲线，如图3所示。得到的标准曲线方程为:y＝0.56439lgx+8.57752(r²＝0.94799)，检测限为10^-11mol·l^-1。

将得到的标准曲线通过计算机程序内置于检测器，即得到ahl专用便携式检测器。

检测待测样品时，先使用2个以上ahl标准品分子印迹丝网印刷电极进行校正，然后在检测待测样品溶液。便携式检测器可以根据内部设定的标准曲线，最终直接将待测样品中ahl的浓度显示在检测器的led显示屏上。

实施例4标准曲线

在本发明的一种便携式检测器中，标准曲线并不是内置于检测器程序中。

对于不同的被测物质，制备不同已知浓度的被测物质的分子印迹丝网印刷电极(包括吸附前的电极和吸附后的电极)插入到检测器中并在检测器的操作界面上分别将浓度输入到检测器中，检测器系统可以根据测得的电流值差值大小和收到的浓度信息，计算得到电流值差值大小与物质浓度的标准曲线，然后操作者进行待测样品的检测，系统内部可以根据测得的电流差值与计算得到的标准曲线，最终直接显示待测样品中目标物质的浓度。

得到的标准曲线方程为:y＝0.56439lgx+8.57752(r²＝0.94799)，检测限为10^-11mol·l^-1。

实施例5检测条件的优化

1)静置吸附时间的优化：

参照实施例2，将静置吸附时间替换为80s、280s，其他条件不变，得到检测结果，制得标准曲线。结果发现：吸附时间为80s时，各浓度标准样本对应的峰电流值普遍偏低，说明吸附不充分，不利于最终读数；而当吸附时间为280s时，各浓度标准样本对应的峰电流值与吸附时间为180s时基本无差，但是可以观察到所滴加的标准样品溶液明显减少，说明溶液有所挥发，所以综上，本发明适宜选取的静置吸附时间为180s。

2)ahl样品溶液的用量的优化：

参照实施例2的测试方法，将ahl样品溶液的用量替换为20μl、25μl、50μl、60μl，其他条件不变，得到检测结果，制得标准曲线。结果发现：当用量为20μl时，可以观察到ahl样品溶液因挥发而明显减少，ahl分子具有一定的挥发性，这使得一部分ahl分子可能无法被吸附，这会使峰电流检测值低于其真实值的10％，数据准确性较差；逐渐增加到25、40，准确性提高，真实值与测定值的差异不超过真实值的5％，尤其是40μl时的差异值不到1％；进一步增加用量，50μl时的差异值增大到3.5％左右。而当检测的用量增加至60μl时，ahl样品溶液在滴加时很容易从工作电极表面流走，吸附不充分，这也会使峰电流检测值低于其真实值，差异在15％左右。

3)检测电压的优化：

参照实施例2的测试方法，将电压范围扩大为-0.6v-0.6v，其他条件不变，得到检测结果，制得标准曲线。结果发现：在-0.6v～-0.2v和0.4v～0.6v的电压范围内，电极的dpv曲线杂峰较多，数据意义不大，在-0.2v～0.4v范围内，电极的dpv曲线平滑，峰电流值读数准确，并且节省了检测时间。所以综上，我们选取检测电压范围为-0.2v～0.4v。

(4)循环使用次数：

参照实施例2的测试方法，对吸附后测试使用过电极进行洗脱，然后继续作为电极，对待测物进行测试，结果发现，本发明电极稳定性好，可以循环使用5次，其中前4次的数据差异均不超过5％，检测数据的准确性较高，第5次的数据差异为10％，开始出现下降。由此可知，本发明电极克服了一次性使用的缺陷，可以循环使用多次且数据准确性较好。

对照例1：

参照实施例1，将步骤(1)中的滴涂方法替换为下述的电镀方法，其他条件不变，制备得到ahl分子印迹丝网印刷电极。

电镀方法：在工作丝网印刷电极表面电镀沉积金纳米粒子，电镀方法：工作电极置于金纳米溶液中，在电位-0.2v电压下，电镀时间为120s，以完成电镀；

利用上述方法得到的ahl分子印迹丝网印刷电极，参照实施例2进行样品测试，结果发现：所得电极数据的差异为5％，但是在循环利用第2次时，其数据差异增加到12％，准确性较差，无法用于ahl的准确检测。因此，该电极是一次性使用电极。

对照例2：

参照实施例2，利用实施例1的电极进行电化学测定，仅仅将标准曲线构建使用的纵坐标由峰电流差值替换为吸附后的峰电流值，读取检测数据，结果发现：以吸附后的峰电流值为纵坐标的曲线，吸附后的峰电流值与所测样品的浓度之间没有良好的线性关系，难用于检测。而以峰电流差值为纵坐标的曲线能够更好地体现所测样品浓度和电信号之间的关系，拟合后相关系数可以达到0.94799。由此说明，不同分子印迹电极都匹配各自适合的的数据模型，不同分子印迹电极之间无法直接共用相同的的预测模型，需要针对特定分子特性的印迹电极作具体的研究分析。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。