番茄中海藻糖-6-磷酸含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法与流程

本发明属于在植物样品中海藻糖-6-磷酸的定量检测的领域，具体涉及一种番茄中海藻糖-6-磷酸含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术：
：番茄在世界范围广泛种植，是深受人们喜爱的一种果蔬。番茄生产是我国现代农业重要的组成部分，随着科技的不断进步，以及人们生活水平的提高，获得高产量、高品质的番茄已成为人们的生产目标。番茄品质和产量的提升与番茄光合产物的生产和分配密切相关。糖是光合产物的主要形式，它不仅为植物提供能量供应，还作为信号分子感应植物能量状态并向植物代谢网络传递，从而调控植物的生长发育。海藻糖-6-磷酸作为信号分子在胚胎发育、幼苗生长、成花诱导及叶片衰老等不同生长阶段影响植物的发育过程，参与了响应环境胁迫、生长发育、激素调控等多条代谢途径。海藻糖-6-磷酸能够反映植物体内碳的可用性，随植物体内蔗糖形式碳的上升而增加，进而通过增强adp-葡萄糖焦磷酸化酶的活性来促进淀粉积累。而淀粉是植物糖类物质的主要积累形式，对植物生长代谢，果实产量品质起到决定性作用。由于植物体内化合物种类繁多且结构复杂，而海藻糖-6-磷酸的含量极低，这使得植物中海藻糖-6-磷酸的提取及定量分析存在较大的难度，也因此阻碍了对植物海藻糖-6-磷酸的科学研究。目前对植物海藻糖-6-磷酸的提取采用固相萃取方法进行，这不仅处理繁琐，回收率低，而且实验成本较高，不利于样品批量快速处理。单独使用液相色谱得测定方法存在干扰多、灵敏度低的缺陷。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的是提供番茄中海藻糖-6-磷酸含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法。为了实现上述目的，本发明提供的一种番茄中海藻糖-6-磷酸含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：(1)准备标准工作溶液并进行超高效液相色谱串联质谱检测：称取海藻糖-6-磷酸标准品于容量瓶中，用体积分数为80％的乙腈溶解并定容，然后用体积分数为80％的乙腈逐级稀释配制多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行超高效液相色谱串联质谱检测并得到标准谱图；(2)根据步骤(1)获得的标准谱图制作标准工作溶液的浓度和色谱峰面积关系曲线图；(3)番茄样品的预处理：将番茄样品置于装有液氮的研钵中研磨成粉，称取定量研磨的番茄粉末样品加入离心管中，向离心管内加入蒸馏水，涡旋震荡，之后超声提取，进行离心，取上清液，通过滤膜过滤，得到待检测海藻糖-6-磷酸含量的样品溶液；(4)超高效液相色谱串联质谱检测：将步骤(3)制备的待检测的样品溶液进行超高效液相色谱串联质谱检测，得到样品谱图；(5)样品中海藻糖-6-磷酸的含量的确定：通过步骤(4)中获得的样品谱图的保留时间确定海藻糖-6-磷酸的色谱峰，并将海藻糖-6-磷酸的色谱峰面积与步骤(2)中的标准工作溶液的浓度和色谱峰面积关系曲线图进行比对，用插入法确定样品溶液中的海藻糖-6-磷酸含量。优选地，步骤(3)中番茄样品的预处理：将番茄样品置于装有液氮的研钵中研磨成粉，称取0.3-0.7g研磨的粉末样品加入2ml离心管中，加入0.7-1.3ml蒸馏水，涡旋震荡4-6min，超声提取8-15min，其中超声功率为100w，超声温度为15-25℃，3-5℃温度下在13000rpm进行离心15-30min，取上清液，上清液通过0.15-0.25μm滤膜过滤，得到待检测海藻糖-6-磷酸含量的样品溶液。优选地，步骤(3)中番茄样品的预处理：将番茄样品置于装有液氮的研钵中研磨成粉，称取0.5g研磨的粉末样品加入2ml离心管中，加入1ml蒸馏水，涡旋震荡5min，超声提取10min，其中超声功率为100w，超声温度为20℃，4℃温度下在13000rpm进行离心20min，取上清液，上清液通过0.2μm滤膜过滤，得到待检测海藻糖-6-磷酸含量的样品溶液。进一步地，采用的超高效液相色谱的参数条件为：(1)色谱柱：aquityuplcbehc181.7μm(2.1×50mm)；(2)流动相：乙腈/含0.1％氢氧化铵的水；(3)梯度洗脱程序为：0-4min，100％乙腈；4-4.5min，100％乙腈-60％乙腈；4.5-8min，60％乙腈；8-10min，60％乙腈-0乙腈；10-13min，0乙腈-100％乙腈；最后保持100％乙腈2min；(4)柱温：30℃；(5)进样量：5μl；(6)流速：0.2ml/min。进一步地，采用的质谱参数条件为：(1)电离模式：负离子(esi-)；(2)毛细管电压：2.5kv；(3)离子源温度：150℃；(4)脱溶剂气温度：350℃；(5)脱溶剂气流量：650l/h；(6)锥孔反吹气流量：0；(7)锥孔电压：58v；(8)扫描模式：多反应监测(mrm)模式；(9)离子对：421.1145/240.8659，421.1145/78.7361。本发明提供的番茄中海藻糖-6-磷酸含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法，具有如下有益效果：1、采用的试剂少，只使用乙腈溶解，节约成本；2、样品前处理只需要超声并且离心操作，步骤简单，减少繁琐前处理过程中待测物的损失；3、采用超高效液相色谱串联质谱检测，大大提高检测方法的灵敏度；准确度高、重复性好，检出限为0.39ppm，检测的特异性高；4、为蔬菜、水果中海藻糖-6-磷酸含量的检测提供了参考。附图说明图1为具体实施方式中浓度为25μg/ml的海藻糖-6-磷酸标准品的超高效液相色谱串联质谱图。图2为具体实施方式中海藻糖-6-磷酸标准品的浓度与色谱峰面积关系曲线图。图3为具体实施方式中番茄果实中海藻糖-6-磷酸的超高效液相色谱串联质谱图。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。一种番茄中海藻糖-6-磷酸含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：1、准备标准工作溶液并进行超高效液相色谱串联质谱检测：称取海藻糖-6-磷酸标准品0.5mg置于10ml容量瓶中，用体积分数为80％的乙腈溶解并定容作为标准储备液；将此标准储备液用体积分数为80％的乙腈逐级稀释，分别配成海藻糖-6-磷酸标准品浓度为25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.562.5μg/ml、0.78125μg/ml、0.390625μg/ml的标准溶液。超高效液相色谱串联质谱的实验条件如下：超高效液相色谱仪器参数条件为：(1)色谱柱：aquityuplcbehc181.7μm(2.1×50mm)；(2)流动相：乙腈/含0.1％氢氧化铵的水；(3)梯度洗脱程序为：0-4min，100％乙腈；4-4.5min，100％乙腈-60％乙腈；4.5-8min，60％乙腈；8-10min，60％乙腈-0乙腈；10-13min，0乙腈-100％乙腈；最后保持100％乙腈2min；(4)柱温：30℃；(5)进样量：5μl；(6)流速：0.2ml/min。采用的质谱参数条件为：(1)电离模式：负离子(esi-)(2)毛细管电压：2.5kv；(3)离子源温度：150℃；(4)脱溶剂气温度：350℃；(5)脱溶剂气流量：650l/h；(6)锥孔反吹气流量：0；(7)锥孔电压：58v；(8)扫描模式：多反应检测(mrm)模式；(9)离子对：421.1145/240.8659，421.1145/78.7361。表1海藻糖-6-磷酸的定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞气能量根据不同浓度的标准溶液进行超高效液相色谱串联质谱检测并得到标准谱图，即分别得到海藻糖-6-磷酸标准品浓度为25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.562.5μg/ml、0.78125μg/ml、0.390625μg/ml的标准溶液的保留时间与响应值之间对应的标准曲线图，由响应值确定的色谱峰面积与对应的海藻糖-6-磷酸浓度成函数关系，其中浓度为25μg/ml的标准溶液的超高效液相色谱串联质谱图如图1所示，其他未示。其中不同浓度的标准溶液对应的超高效液相色谱串联质谱图的色谱峰面积数值见表2所示。表2不同浓度的标准溶液对应的色谱峰面积数值2、将步骤1获得的不同浓度的标准溶液对应的超高效液相色谱串联质谱图的色谱峰面积数值制作浓度与色谱峰面积关系曲线图，图2为海藻糖-6-磷酸的浓度与色谱峰面积关系标准曲线图。海藻糖-6-磷酸的保留时间、标准曲线的线性情况和方法检出限如表3所示。表3海藻糖-6-磷酸的保留时间、标准曲线和方法检出限检测产物保留时间(min)标准曲线(μg/ml)方法检出限(ppm)海藻糖-6-磷酸5.15y＝9.9749x+14.739>0.393、番茄中海藻糖-6-磷酸样品的提取：将适量番茄样品在装有液氮的研钵中研磨成粉，称取0.5g研磨的番茄粉末样品加入2ml离心管中，加入1ml蒸馏水，涡旋震荡5min，超声提取10min，其中超声功率为100w，超声温度为20℃，4℃条件下13000rpm离心20min，取上清液，使上清液通过0.2μm滤膜过滤，得到待检测海藻糖-6-磷酸含量的样品溶液。4、超高效液相色谱串联质谱检测：将步骤3制备的待检测海藻糖-6-磷酸含量的样品溶液进行超高效液相色谱串联质谱检测，得番茄中海藻糖-6-磷酸的样品谱图。超高效液相色谱串联质谱的实验条件如下：超高效液相色谱仪器参数条件为：(1)色谱柱：aquityuplcbehc181.7μm(2.1×50mm)；(2)流动相：乙腈/含0.1％氢氧化铵的水；(3)梯度洗脱程序为：0-4min，100％乙腈；4-4.5min，100％乙腈-60％乙腈；4.5-8min，60％乙腈；8-10min，60％乙腈-0乙腈；10-13min，0乙腈-100％乙腈；最后保持100％乙腈2min；(4)柱温：30℃；(5)进样量：5μl；(6)流速：0.2ml/min。采用的质谱参数条件为：(1)电离模式：负离子(esi-)(2)毛细管电压：2.5kv；(3)离子源温度：150℃；(4)脱溶剂气温度：350℃；(5)脱溶剂气流量：650l/h；(6)锥孔反吹气流量：0；(7)锥孔电压：58v；(8)扫描模式：多反应检测(mrm)模式；(9)离子对：421.1145/240.8659，421.1145/78.7361。表1海藻糖-6-磷酸的定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞气能量5、番茄样品中海藻糖-6-磷酸的含量的确定：如图3所示，通过步骤4中获得的番茄果实中海藻糖-6-磷酸的样品谱图的保留时间确定海藻糖-6-磷酸，并将其色谱峰面积与步骤2对应的海藻糖-6-磷酸得标准曲线进行比对，用插入法确定样品中的海藻糖-6-磷酸浓度。由获得的浓度结果计算样品中海藻糖-6-磷酸的含量，公式如下：海藻糖-6-磷酸的含量(μg/g)＝(海藻糖-6-磷酸浓度×样品体积)/样品质量本发明检测了番茄叶片、花、果实三个器官的海藻糖-6-磷酸含量。每个器官均进行三次技术性重复实验，结果如表4所示。表4番茄叶片、花、果实三个器官的海藻糖-6-磷酸含量本发明公开的番茄中海藻糖-6-磷酸含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法，采用的试剂少，只使用乙腈溶解，节约成本；样品前处理只需要超声并且离心操作，步骤简单，减少繁琐前处理过程中待测物的损失；采用超高效液相色谱串联质谱检测，大大提高检测方法的灵敏度。同时，表4的结果显示，本方法具有重复性好、准确度高的优点，方法检出限为0.39ppm，检测的特异性高，为蔬菜、水果中海藻糖-6-磷酸含量的检测提供了参考。本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12