一种β链变异的血红蛋白糖化率的测定方法与流程

本发明涉及医用临床检测技术领域。更具体地，涉及一种β链变异的血红蛋白糖化率的测定方法。

背景技术：

糖化血红蛋白(hba1c)是血液中的葡萄糖与血红蛋白β链n末端缬氨酸残基以共价键结合的稳定化合物。血糖通过弥散方式进入细胞内，无需胰岛素参与。血糖与血红蛋白结合过程缓慢且不可逆，在红细胞死亡之前一直存在。每个红细胞内都有血红蛋白，而红细胞的寿命为120天，所以糖化血红蛋白比例能反应测定前1-2个月的平均血糖水平。在国内各大医院，已经将hba1c作为监测糖尿病的一个金指标，早在2010年，美国糖尿病协会就将hba1c作为糖尿病的诊断标准。

当血红蛋白β链存在变异时，对于hba1c的测定有一定的影响。目前，对于hba1c的测定，按照其测定理论分为两大类，第一类方法是基于糖化血红蛋白所带电荷与非糖化血红蛋白所带电荷不同而测定，包括电泳法和离子交换高效液相色谱法。对于毛细管电泳法来说，从理论上是可以检测到常见的变异体，正常和异常的血红蛋白hba2、hbe、hbs、hbd、hbf、hba0、hbg、hba1c、hbh等从阴极到阳极依次被检测到，常见的血红蛋白变异体与hba1c完全分离，hba1c检测不受影响，并且可以提示变异体的存在，但整个实验耗费时间长，外界对其干扰因素多，对操作人员技术要求高。离子交换高效液相色谱法能否提示变异体的存在受仪器分辨率的影响，高分辨的设备能够清晰显示出峰时间以及面积，可能提示变异体的存在。第二类方法是糖化血红蛋白的结构与非糖化血红蛋白的结构不同而测定，包括酶法、亲和层析法和免疫法。这三种方法同样不能提示血红蛋白变异体的存在。

因此，需要提供一种新的方法，当血红蛋白的β链存在变异时，仍然可以定量血红蛋白的糖化率。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种β链变异的血红蛋白糖化率的测定方法，该方法可准确对β链变异的血红蛋白糖化率进行定量测定。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种β链变异的血红蛋白糖化率的测定方法，包括以下步骤：

利用飞行时间质谱仪对若干含有正常血红蛋白的全血样本进行质谱检测，得到样品的αhb的质谱峰面积a(αhb)、αghb的质谱峰面积a(αghb)、βhb的质谱峰面积a(βhb)、βghb的质谱峰面积a(βghb)，计算每个样本的比例常数r2/r1的数值，其中r1＝a(αghb)/(a(αhb)+a(αghb))，r2＝a(βghb)/(a(βhb)+a(βghb))，求得所有样本的比例常数平均值c；

利用飞行时间质谱仪对若干人血红蛋白溶液中糖化血红蛋白标准物质进行质谱检测，得到标准曲线y＝[a*a(βghb)/(a(βhb)+a(βghb))+b]×100％，其中，y为血红蛋白的糖化率；

利用飞行时间质谱仪对含有β链变异的待测血液样品进行质谱检测，得到样品的质谱图、αhb的质谱峰面积a(αhb)以及αghb的质谱峰面积a(αghb)；

对质谱图进行分析判断，若βghb蛋白峰受到β链变异体的影响，则利用血红蛋白糖化率的计算公式y＝[a*c*a(αghb)/(a(αhb)+a(αghb))+b]×100％，得出β链变异的血红蛋白糖化率y。

优选地，利用飞行时间质谱仪对50例含有正常血红蛋白的全血样本进行质谱检测，求得所有样本的比例常数平均值c为1.62。

优选地，利用飞行时间质谱仪对购于卫生部临床检验中心的标准品gbw09181a、gbw09182a和gbw09183a进行质谱检测，得到a＝0.0089，b＝–0.0126，标准曲线为y＝[0.0089*a(βghb)/(a(βhb)+a(βghb))–0.0126]×100％。

优选地，含有β链变异的待测血液样品中血红蛋白糖化率的计算公式为y＝[0.0144*a(αghb)/(a(αhb)+a(αghb))–0.0126]×100％。

优选地，所述质谱图的数据采集范围为5000～20000da，采集频率为5000hz。

优选地，所述飞行时间质谱仪是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱maldi-tof-ms。

优选地，对待测血液样品进行质谱检测前，所述测定方法还包括待测血液样本处理步骤和靶板制备步骤。

优选地，所述待测血液样本处理步骤包括：利用纯水稀释含有正常血红蛋白的全血样本，将稀释后的全血样本与sa基质按照1:10混合，得待测样本溶液。

优选地，所述靶板制备步骤包括：将待测样本溶液滴加到飞行时间质谱仪的配套靶板上，40℃环境下静置使稀释后的全血样本与sa基质形成结晶。

优选地，所述sa基质为芥子酸溶液，溶质为芥子酸，溶剂为0.1％三氟乙酸与乙腈的混合液。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的β链变异的血红蛋白糖化率的测定方法，是基于maldi-tof-ms蛋白质组学技术对β链变异珠蛋白的糖化率进行定量测定，而且从质谱图中可以清晰明了的观察到变异体的出峰位置。本发明的测定方法重现性好，灵敏度和准确性高，样本前处理简单快速，所需样本少，通量高，相比其他的方法大大缩短了样本前处理的时间，有望应用于临床检验中。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出实施例3中待测样品1的蛋白质谱图。

图2示出实施例4中待测样品2的蛋白质谱图。

图3示出实施例4中待测样品2与正常样品对照组的蛋白质谱图。

具体实施方式

首先，需对αhb与βhb以及αghb、βghb做解释。αhb为α链携带精氨酸的血红蛋白，βhb为β链携带缬氨酸的血红蛋白，αghb为α链携带精氨酸被糖基化的糖化蛋白，βghb为β链携带缬氨酸被糖基化的糖化蛋白。

本发明提供一种β链变异的血红蛋白糖化率的测定方法，包括以下步骤：

利用飞行时间质谱仪对若干含有正常血红蛋白的全血样本进行质谱检测，得到样品的αhb的质谱峰面积a(αhb)、αghb的质谱峰面积a(αghb)、βhb的质谱峰面积a(βhb)、βghb的质谱峰面积a(βghb)，计算每个样本的比例常数r2/r1的数值，其中r1＝a(αghb)/(a(αhb)+a(αghb))，r2＝a(βghb)/(a(βhb)+a(βghb))，求得所有样本的比例常数平均值c；需要说明的是，上述全血样本中不存在血红蛋白变异体。

利用飞行时间质谱仪对若干人血红蛋白溶液中糖化血红蛋白标准物质进行质谱检测，得到标准曲线y＝[a*a(βghb)/(a(βhb)+a(βghb))+b]×100％，其中，y为血红蛋白的糖化率；

利用飞行时间质谱仪对含有β链变异的待测血液样品进行质谱检测，得到样品的质谱图、αhb的质谱峰面积a(αhb)以及αghb的质谱峰面积a(αghb)；

对质谱图进行分析判断，若βghb蛋白峰受到β链变异体的影响，则利用血红蛋白糖化率的计算公式y＝[a*c*a(αghb)/(a(αhb)+a(αghb))+b]×100％，得出β链变异的血红蛋白糖化率y。

在本发明的优选实施方式中，利用飞行时间质谱仪对50例含有正常血红蛋白的全血样本进行质谱检测，最终求得所有样本的比例常数平均值c为1.62，即r2/r1平均值为1.62，r2与r1之间存在特定的关系，即r2＝1.62*r1。

为了得到血红蛋白糖化率与βghb和βhb含量之间的关系，本发明优选的实施方式中，利用飞行时间质谱仪对购于卫生部临床检验中心的标准品gbw09181a、gbw09182a和gbw09183a进行质谱检测，得到a＝0.0089，b＝–0.0126，标准曲线为y＝[0.0089*a(βghb)/(a(βhb)+a(βghb))–0.0126]×100％r²＝0.998。

通过将r2＝1.62*r1带入y＝[0.0089*a(βghb)/(a(βhb)+a(βghb))–0.0126]×100％，得到含有β链变异的待测血液样品中血红蛋白糖化率的计算公式：y＝[0.0144*a(αghb)/(a(αhb)+a(αghb))–0.0126]×100％，其中y即为血红蛋白糖化率。

优选地，所述质谱图的数据采集范围为5000～20000da，采集频率为5000hz，可以在质谱图上得到本实验所需的蛋白质谱峰。

进一步，所述飞行时间质谱仪是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱maldi-tof-ms。

优选地，对待测血液样品进行质谱检测前，所述测定方法还包括待测血液样本处理步骤和靶板制备步骤。

进一步，所述待测血液样本处理步骤包括：利用纯水稀释含有正常血红蛋白的全血样本，将稀释后的全血样本与sa基质按照1:10混合，得待测样本溶液。

进一步，所述靶板制备步骤包括：将待测样本溶液滴加到飞行时间质谱仪的配套靶板上，40℃环境下静置使稀释后的全血样本与sa基质形成结晶。

进一步，所述sa基质为芥子酸溶液，溶质为芥子酸，溶剂为0.1％三氟乙酸与乙腈的混合液。

需要说明的是，测定方法中的待测血液样本处理步骤和靶板制备步骤属于本领域常见的方法步骤，本领域技术人员可以根据实际需要调整相应的参数和实验细节，能完成全血样本的质谱检测实验即可，本领域对此不做进一步限制。

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1比例常数c的获得

(1)制备样本：含有正常血红蛋白的全血样本50例，50例样本来自于深圳某医院检验科。将这50例样本与超纯水体积比为1:200混合，得到一级稀释液，然后用sa基质溶液与一级稀释液按照体积比为1:10混合，得到待测样本溶液。

(2)制备靶板：用移液器将上述50例待测样本溶液滴加到maldi-tof-ms飞行时间质谱配套的靶板上，每个样本平行点6个靶孔，滴加待测液时，靶板置于40℃的加热板上，目的是加速一级稀释液与芥子酸基质液形成结晶。将上述形成结晶的靶板置于飞行时间质谱上扫描，得到包含αhb与βhb以及αghb、βghb等的质谱图。扫描条件，数据采集范围为5000-20000da，采集频率为5000hz。

(3)通过飞行时间质谱软件包配套软件，即糖化血红蛋白定量软件，得,50个样本的比值r1＝a(αghb)/(a(αhb)+a(αghb))，r2＝a(βghb)/(a(βhb)+a(βghb))。r2/r1得到一个比例常数，平均值为c＝1.62，如表1所示。因此，r2＝1.62*r1，即a(βghb)/(a(βhb)+a(βghb))＝1.62*a(αghb)/(a(αhb)+a(αghb))。

表1含有正常血红蛋白的全血样本的比例常数

实施例2标准曲线的获得

标准曲线的制备，于卫生部临床检验中心购买3个人血红蛋白溶液中糖化血红蛋白标准品gbw09181a、gbw09182a、gbw09183a，标准品的浓度范围为gbw09181a(5.02±0.15)、gbw09182a(6.86±0.15)、gbw09183a(9.34±0.21)。将3个标准品根据实施例1中的样品前处理方法进行处理，经maldi-tof-ms飞行时间质谱仪进行质谱检测后，根据糖化血红蛋白定量软件，得出标准工作曲线：y＝[0.0089x-0.0126]*100％r²＝0.998，其中y代表血红蛋白糖化率，x代表a(βghb)/(a(βhb)+a(βghb))。

实施例3β链变异的血红蛋白糖化率的测定

(1)制备样本：血红蛋白1号样本，来自于深圳某医院检验科。将1号样本与纯水按照体积比为1:200混合，得到一级稀释液。再将一级稀释液与sa基质按体积比1:10混合，涡旋10s，得待测样本溶液。

(2)制备靶板：用移液器将上述1号待测样本溶液滴加到maldi-tof-ms飞行时间质谱配套的靶板上，每个样本平行点3个靶孔，滴加待测液时，靶板置于40℃的加热板上，目的是加速一级稀释液与芥子酸基质液形成结晶。

(3)将上述形成结晶的靶板置于飞行时间质谱上扫描，得到包含αhb与βhb以及αghb、βghb等的质谱图。如图1，扫描条件为，数据采集范围为5000～20000da，采集频率为5000hz。

(4)如图1所示，可得1号样本信息，αhb质谱峰为15127da，表示α链携带精氨酸的血红蛋白；βhb质谱峰为15868da，表示β链携带缬氨酸的血红蛋白；glycatedβhb(βghb)质谱峰为16030da，表示β链携带缬氨酸被糖基化的糖化蛋白；*βhb＝βhb(val->glu)质谱峰为15896.8da，βhb的变异体，表示β链携带缬氨酸的血红蛋白变异为β链携带谷氨酸的血红蛋白。

在该样本中，βghb蛋白峰没有受到β链变异体的影响，由糖化血红蛋白定量软件可知1号样本的a(βghb)/(a(βhb)+a(βghb))为11.30，然后再代入实施例2中的标准工作曲线y＝[0.0089x-0.0126]*100％r²＝0.998，计算出1号样本的血红蛋白糖化率为8.8％。

实施例4β链变异的血红蛋白糖化率的测定

(1)制备样本：血红蛋白2号样本，来自于深圳某医院检验科。将2号样本与纯水按照体积比为1:200混合，得到一级稀释液。再将一级稀释液与sa基质按体积比1:10混合，涡旋10s，得待测样本溶液。

(2)制备靶板：用移液器将上述1号待测样本溶液滴加到maldi-tof-ms飞行时间质谱配套的靶板上，每个样本平行点3个靶孔，滴加待测液时，靶板置于40℃的加热板上，目的是加速一级稀释液与芥子酸基质液形成结晶。

(3)将上述形成结晶的靶板置于飞行时间质谱上扫描，得到包含αhb与βhb以及αghb、βghb等的质谱图。如图2，扫描条件，数据采集范围为5000～20000da，采集频率为5000hz。

(4)图2中，显示2号样本的质谱信息。b图为a图的部分放大图。αhb质谱峰为15127da，表示α链携带精氨酸的血红蛋白；βhb质谱峰为15868da，表示β链携带缬氨酸的血红蛋白；glycatedβhb质谱峰为16030da，表示β链携带缬氨酸被糖基化的糖化蛋白；*βhb＝βhb(val->glu)质谱峰为15928da，βhb存在变异体，表示β链携带丝氨酸的血红蛋白变异为β链携带苯丙氨酸的血红蛋白。

(5)图3中，在15928da处有*βhb质谱峰的曲线为2号样本，其他曲线质谱图为含有正常血红蛋白的全血样本的对照组。

从图2和3可看出，βghb蛋白峰受到β链变异体的影响，无法用β对其糖化率进行定量。此时，由糖化血红蛋白定量软件可知2号样本的a(αghb)/(a(αhb)+a(αghb))为4.48，然后根据实施例1中比例常数c，可得2号样本的a(βghb)/(a(βhb)+a(βghb))为7.26，将其代入实施例2中标准曲线y＝[0.0089x-0.0126]*100％r²＝0.998，从而可得2号样品中血红蛋白糖化率为5.2％。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。