一种肿瘤精准、个性化药物治疗方法及应用与流程

本发明涉及精准治疗技术领域，特别涉及一种体外培养肿瘤模型以及利用该肿瘤模型用于研究肿瘤，评价抗肿瘤药物的药效，测试抗肿瘤药物的药效敏感性筛选抗肿瘤治疗方案的方法。

背景技术：

目前，对于多数患相同疾病的不同病人，治疗方法是用同样的药、标准的剂量，但实际上不同病人在治疗效果、不良反应方面有很大的差异，有时候这种差异甚至是致命的。常用的抗肿瘤化疗药物对患者治疗的有效性低于70％，约20％-35％的患者接受了不恰当的药物治疗。如果肿瘤治疗能够同病异治、因人而异、实施个体化治疗，将能够大大提高疗效，避免过度治疗和降低患者经济负担，减少医疗资源的浪费。因此如何选择有效药物，进行个性化的治疗早已成为医学界所关注的问题。

个性化治疗可以帮助患者选择合适的化疗药物，提高治疗的针对性，最大程度的延长患者的生存期。因此，在医院医生指导肿瘤病人用药时，必须根据不同的人不同的肿瘤选用不同的药物，即使是同一肿瘤，不同的患者也对药物的敏感性存在较大差异。因此，医生需要一个能够高效、快捷地筛选出适合特定病人的抗肿瘤药物的方法。

目前主要的药敏检测方法都是基于原代肿瘤细胞培养成功的基础上。如atp-生物荧光体外肿瘤药物敏感性检测技术(atp-tca)、四唑盐(mtt)比色法、细胞毒性差异染色法(disc)等。但常规的原代肿瘤细胞脱离体内环境后，在体外最初培养的24小时后，大部分细胞都会逐渐死亡飘浮，能够贴壁生长的细胞占极少比例。传统的原代肿瘤细胞培养，耗时较长，样品易污染，灵敏度较低等缺点均会干扰实验结果的准确性，进而影响到化疗方案的正确选择和最终疗效。且二维细胞培养方式改变了细胞的生存环境，加大了细胞变异的可能性。同时细胞培养过程漫长，延缓了治疗过程，而且可能面临二次手术，给患者健康带来潜在的危害。低氧是实体肿瘤中普遍具有的特性之一，在多种生理过程(细胞增殖、血管生成、肿瘤侵袭等)中发挥重要作用，可以激活各种信号通路导致肿瘤细胞对放化疗的耐药。当前培养方式很少考虑氧浓度的影响。这些因素都限制了药敏试验的推广，制约着此类方法的成功率和可靠性。

肿瘤动物模型一直以来是抗肿瘤药物临床前疗效预测和可能的毒性评价的有效工具。促使一个实验室候选药物进入临床试验的前提是来自动物模型的研究数据能够预测该药物在临床应用时的疗效。当药物研发人员开发一个新型药物时，摆在他们面前的其中一个最大的障碍是从动物实验中获得的药敏和毒理数据有时并不能完全验证在患者身上。目前用于药物筛选的肿瘤模型基本采用的是将成熟的肿瘤细胞系接种于免疫缺陷小鼠获得的。这种模型已经用于抗肿瘤新药的筛选达数十年之久。虽然这种模型在揭示肿瘤转移的细胞和分子机制中显示出其优点，但是在预测抗肿瘤药物的临床治疗敏感性时，这种模型的价值却非常有限。经过体外几十代的培养，恶性肿瘤细胞已经呈现出高度未分化的状态，细胞系在体外培养的选择压力下表现出均一的组织学特征，其生物学特性和分子特征已经和原发肿瘤相差甚远。而且体外培养的细胞系缺乏肿瘤的间质成分，而这种间质成分被认为在肿瘤转移的病理过程中起到很关键的作用。

构建和使用患者肿瘤模型能比较完整地保留患者来源组织的形态和分子特征。最新的技术显示，很多研究小组建立了一种直接接种来源于肿瘤患者新鲜肿瘤组织的裸鼠移植瘤模型，即pdx模型。这种模型将患者的新鲜肿瘤组织接种于免疫缺陷小鼠皮下或肾包膜下形成肿瘤。pdx模型比传统的细胞系模型更能反映人类肿瘤的生物学特征，这种模型不仅保留了与原发肿瘤组织相似的增殖和组织病理学特征，而且在生物学行为上，包括肿瘤的基因，蛋白质等分子特征与来源肿瘤组织具有高度的一致性。由于pdx模型比细胞系模型更能反映体内状况，因此被有效地应用于潜在抗肿瘤药物的特异性快速筛选。但pdx模型实验要求条件高，成本高，周期长，也很难解决实际问题。并且人源肿瘤在动物体内生长，这种种属差异也带来新的影响因素，无法反应实际情况。

本发明解决了原代肿瘤在体外难以培养的问题，培养的肿瘤组织可以用来筛选新型抗肿瘤药物或检测肿瘤细胞对不同抗肿瘤药物的敏感性。还解决了传统培养方法耗时长，样品易污染，灵敏度较低等问题，为临床肿瘤单向用药和联合用药的药敏实验开展提供了可能。可提高肿瘤患者用药准确性，为临床医师确定个体化疗方案和开展个体化治疗提供科学依据，为临床前抗肿瘤药物评价提供了可靠的药物开发平台。

技术实现要素：

本发明提供了一种肿瘤精准、个性化药物治疗方法，本发明的一个目的是提供一种体外培养肿瘤组织用于抗肿瘤药物药效评价的方法，本发明的另一目的是提供用于肿瘤患者个性化治疗方案筛选的方法。

本发明通过以下技术方案来实现发明目的：

一种肿瘤精准、个性化药物治疗方法，包括以下步骤，

步骤一、肿瘤微组织的制备，将实体瘤肿瘤病人穿刺活检获得或者术后分离的肿瘤组织制备成目标大小的肿瘤微组织；

步骤二、肿瘤的培养，将肿瘤微组织培养在低氧环境下；

步骤三、个性化治疗方案筛选及抗肿瘤药物评价，加入药物刺激后，评价药物对肿瘤组织的作用。

上述用于肿瘤精准、个性化药物治疗方法中，所述目标大小肿瘤微组织的大小为0.1-3mm。

上述用于肿瘤精准、个性化药物治疗方法中，所述目标大小肿瘤微组织的在一次实验中大小应均一，如1±0.1mm。

上述用于肿瘤精准、个性化药物治疗方法中，所述肿瘤组织是从患者取材制备的，在体外进行操作的肿瘤组织。

上述用于肿瘤精准、个性化药物治疗方法中，所述肿瘤微组织为选自肺癌、肾癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、原髓细胞白血病和结肠癌等实体瘤中的任一种。

上述用于肿瘤精准、个性化药物治疗方法中，所述微环境环境，为低氧环境，其氧浓度在0.1％-12％。

上述用于肿瘤精准、个性化药物治疗方法中，所述微环境环境，使用患者血清作为培养基血清成分。

上述用于肿瘤精准、个性化药物治疗方法中，所述微环境，肿瘤组织可以培养在芯片中。

上述用于肿瘤精准、个性化药物治疗方法中，个性化治疗方案筛选及抗肿瘤药物评价，药物评价的具体过程如下，

(1)药物刺激；

(2)结果测定；包括活力测定与染色测定；

(3)结果分析。

上述用于肿瘤精准、个性化药物治疗方法中，药物刺激的时间可以为1-96小时。

上述用于肿瘤精准、个性化药物治疗方法中，在用于个性化方案筛选时，药物刺激的浓度可以根据auc浓度计算。

上述用于肿瘤精准、个性化药物治疗方法中，使用细胞毒性试剂盒进行细胞活性的检测，包括cck-8，mtt等。

上述用于肿瘤精准、个性化药物治疗方法中，可以进行常规免疫荧光染色，包括但不限于live/dead染色，蛋白表达染色，中性红染色等。

一种肿瘤精准、个性化药物治疗方法的应用，在体外培养肿瘤组织进行抗肿瘤药物评价，用于肿瘤患者个性化治疗方案筛选的方法。

该发明很好地保留患者肿瘤组织的生物学特征和对药物的反应特征，因此可以更准确地预测多种化疗药物的临床疗效,并可以避免无效化学治疗和可能的毒副作用。该技术能对多种药物和联合用药方案进行测试，找出准确的个体用药方案以获得最好的临床疗效，可以有效地引导肿瘤患者的个体化癌症治疗，减少了临床用药的盲目性。

本发明的有益效果为：(1)提高肿瘤原代培养的成功率，特别是难培养肿瘤和获取组织块较小的肿瘤。(2)保证体外原代培养的肿瘤能够很好的再现其在体内的遗传表型和异质性。(3)原代培养最大程度保留了肿瘤的细胞成分及微环境。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1：本发明技术流程示意图；

其中，a肿瘤微组织制备；b肿瘤微组织培养；c药物刺激；d数据收集；

e报告分析；f模拟体内微环境。

图2：药物处理后，肿瘤微组织live/dead染色图。

图3：药物处理后，肿瘤微组织cck-8细胞活力测定图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

将实体瘤肿瘤(乳腺癌)病人术后分离的肿瘤组织在最短时间内进入无菌环境中进行处理。切取非坏死部位的肿瘤样本，取出标本后立即浸入4℃预冷的装有pbs的无菌小瓶中，并在3小时内送抵实验室。其中pbs中含100u/ml青霉素和100u/ml链霉素；在生物安全柜内，将肿瘤样本转移至100mm细胞培养皿内，用1×pbs10ml冲洗三次，将血细胞清洗掉，剥离肿瘤标本表面的结缔组织、纤维和脂肪，将肿瘤组织制备成直径小于1mm³的肿瘤微组织如图1中a所示。细胞培养基使用10％患者血清与90％dmem配置，将肿瘤微组织培养在芯片中，置于37度，5％co2，5％o2的环境中培养，如图1中b所示。对肿瘤微组织进行药物刺激，使用10μg/ml氟尿嘧啶处理48小时，如图1中c所示。对肿瘤微组织进行指标检测，使用cck-8试剂盒对细胞活力进行定量，live/dead染色对死细胞和活细胞分别荧光标记，使用荧光显微镜拍照，如图1中d所示。

结果如图2所示，肿瘤微组织在低氧(5％)条件下培养，死细胞数量较常氧(21％)条件下少，细胞活力较常氧可能更高。药物刺激后，氟尿嘧啶处理组的死细胞数量显著多于对照组，常氧条件下，肿瘤细胞活力降低较多；而低氧条件下，细胞活力降低较少。图3的细胞活力定量数据也很好地证实了这种趋势。这说明肿瘤微组织在低氧条件下的对药物反应的敏感性下降，这更接近实际的反应。