响应面优化薏米多酚提取方法与流程

本发明属于薏米多酚提取技术领域，特别是涉及到一种响应面优化薏米多酚提取方法。

背景技术：

薏米又称薏苡仁，是薏苡去壳后的种仁，薏米营养丰富，含有约65％的碳水化合物、17％的蛋白质、5％的脂肪；除三大能量物质之外，薏米还含有多种活性成分，如薏仁素、维生素、微量元素、多酚等，其中多酚含量在同类植物中居高。多酚是一类广泛存在于植物体内的具有多元酚结构的次生代谢物，是天然抗氧化剂。人体自身不能产生多酚，定期摄入含有丰富多酚的食物非常必要，可有效降低心血管疾病的发生，经常食用薏米就是不错的选择。目前食品行业研发了较多类型的薏米产品，而薏米多酚提取工艺研究较少。

李倩等人采用微波辅助技术提取薏米中多酚，主要考察微波条件对多酚提取率的影响，并利用正交实验法优化最佳提取工艺，得到最大提取率为376.81mg/kg。姚轶俊等人采用响应面法对薏米中结合型多酚提取条件进行优化，并未研究总多酚的提取。上述文献对薏米多酚提取研究具有一定参考价值，但仍然不够全面。现有专利cn20150789239采用水浴浸提法提取沉香叶中茶多酚，并利用响应面法优化提取工艺，得到茶多酚含量为13.72％。cn201811054162专利采用热水浸提结合超声波提取技术提取黑松中松多酚，并利用响应面法优化最佳提取工艺，得到松多酚提取量为20.21mg/g。

综合分析现有文献和专利可知，超声法是目前中药材主成分提取常用的方法，声波产生强烈的空化效应和热效应能够破坏植物细胞，缩短提取时间，提高提取率。响应面法又可以解决多变量问题，通过回归方程的分析来寻求最佳工艺条件。现有技术中对超声和响应面法结合提取薏米多酚的研究未见报道。

因此现有技术当中亟需要一种新型的技术方案来解决这一问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种响应面优化薏米多酚提取方法用于解决现有技术中对超声和响应面法结合提取薏米多酚的研究未见报道的技术问题。

响应面优化薏米多酚提取方法，包括以下步骤，并且以下步骤顺次进行，

步骤一、制备薏米粉

将薏米用蒸馏水冲洗除去杂质，干燥、粉碎、过筛，制得薏米粉，放于干燥瓶中密封保存备用；

步骤二、制备薏米多酚提取液

选取甲醇溶液为薏米多酚提取液，按照设定的料液比混合薏米粉和甲醇溶液，置于超声波中超声提取后，置于离心机中离心，取上清液，挥干溶剂，用纯水洗涤定容到设定的体积，测定薏米多酚提取率并获得薏米多酚提取率最大条件下对应的各单一因素值；

步骤三、选择料液比、甲醇体积分数、提取温度和提取时间四个因素为自变量，以步骤二中获得的料液比、甲醇体积分数、提取温度和提取时间的单一因素值为中间值进行自变量取值，选择多酚提取率为响应值，进行响应面法优化，获得薏米多酚提取率y的回归方程：

y＝76.54+1.53a+0.98b-2.10c+1.42d-0.55ab+2.12ac-2.77ad-1.63bc-

2.67bd+0.000cd-3.49a²-1.89b²-11.14c²-1.94d²，

其中a为料液比、b为甲醇体积分数、c为提取温度、d为提取时间；

步骤四、通过软件design-expert8.0.5.0优化并获得在料液比、甲醇体积分数、提取温度和提取时间四个因素交互作用下的薏米多酚提取率最大值及对应的料液比值、甲醇体积分数值、提取温度值和提取时间值。

所述步骤一中干燥条件为置于恒温鼓风干燥箱105℃干燥2h。

所述步骤一中过筛为过20目筛。

所述步骤二中薏米多酚提取率的测定方法为：

①称取0.0100g没食子酸置于10ml容量瓶中，加入纯水溶解并定容，获得浓度为1mg/ml没食子酸标准储备液，

②取0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml标准储备液分别放入50ml容量瓶，用纯水定容，得到10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml的标准系列溶液，

③用吸量管分别吸取标准系列溶液1ml于比色管中，依次加入1ml福林酚试剂、3.00ml7.5％无水碳酸钠溶液，摇匀后避光反应60min，同时做试剂空白，作为参比溶液，在765nm处测量吸光度，

④以没食子酸浓度为横坐标c，吸光度值为纵坐标a，得到回归方程a＝0.0128c+0.0154，相关系数为0.999；

⑤吸取1ml薏米多酚提取液置于比色管中，依次加入1ml福林酚试剂、3.00ml7.5％无水碳酸钠溶液，摇匀后避光反应60min，在765nm处测量吸光度值a，根据步骤④中的回归方程获得薏米中所含多酚浓度c；

⑥根据多酚提取率w公式：w＝(c×v)/m，获得多酚提取率w，其中v为样品定容体积，m为称样质量，c为样品中多酚浓度。

所述步骤二中单一因素包括甲醇溶液的体积分数、薏米粉与甲醇溶液的料液比、提取温度、提取时间和提取次数。

所述甲醇溶液的体积分数为40％～80％，薏米粉与甲醇溶液的料液比为1:10～1:50，提取温度为35℃～75℃，提取时间为10min～50min，提取次数为1次～6次。

所述步骤四中薏米多酚提取率最大值为76.93mg/100g，料液比值为1:21.1、甲醇体积分数值为63.2％、提取温度值为54℃、提取时间值为33.6min。

通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：

本发明通过单一超声法提取薏米多酚，探究单因素即不同提取溶剂、料液比、提取时间、提取温度、溶剂体积分数、颗粒度、提取次数对薏米多酚提取率的影响，并利用box-behnken响应面法设计实验方案，建立回归模型，分析回归方程的有效性及各单因素的影响度，优化并验证薏米多酚提取条件。单因素实验表明，当料液比1:20、甲醇体积分数60％、提取温度55℃、提取时间30min、提取3次时薏米多酚提取率最高；提取次数、提取溶剂、颗粒度的影响很明确，可确定提取次数为3次、提取溶剂为甲醇、薏米粉样品为响应面优化的实验条件。进行响应面分析，当料液比1:21.1，甲醇体积分数63.2％，提取温度54℃，提取时间33.6min时，薏米多酚提取率预测值为76.93mg/100g。最佳优化工艺条件下进行实验验证，薏米多酚提取率为75.75mg/100g，实测值与理论值具有良好的拟合度，优化的工艺条件适合薏米多酚提取。

本发明实验结果与现有技术对比发现：现有文献和专利中均选择乙醇作为提取溶剂，而本发明溶剂筛选实验结果表明甲醇提取效果好于乙醇等其他有机溶剂；现有文献和专利中使用微波法、水提法及水提-超声法的提取技术，而本发明利用单一超声提取技术取得较好效果，响应面优化最佳工艺条件下薏米多酚提取率为75.75mg/100g，比现有文献结果高1倍。

本发明建立的响应面法优化薏米多酚工艺条件，解决多因素组合问题对提取率的影响，该方法具有实验成本低、提取时间短、多酚提取率高等特点，能够为薏米多酚提取提供技术贮备，为薏米产品深加工提供思路和方向，具有一定应用和推广价值。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：

图1为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中考察单因素时料液比与多酚提取率的对应关系图。

图2为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中考察单因素时甲醇体积分数与多酚提取率的对应关系图。

图3为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中考察单因素时提取温度与多酚提取率的对应关系图。

图4为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中考察单因素时提取时间与多酚提取率的对应关系图。

图5为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中考察单因素时提取次数与多酚提取率的对应关系图。

图6为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中分析交互作用时料液比和提取时间的等高线图。

图7为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中分析交互作用时料液比和提取时间的响应面图。

图8为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中分析交互作用时甲醇体积分数和提取时间的等高线图。

图9为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中分析交互作用时甲醇体积分数和提取时间的响应面图。

图10为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中分析交互作用时料液比和甲醇体积分数的等高线图。

图11为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中分析交互作用时料液比和甲醇体积分数的响应面图。

图12为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中分析交互作用时提取温度和提取时间的等高线图。

图13为本发明响应面优化薏米多酚提取方法中分析交互作用时提取温度和提取时间的响应面图。

具体实施方式

1材料与方法

1.1原料与试剂

薏米产地吉林省，甲醇、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、无水碳酸钠、福林酚、没食子酸等化学试剂。

1.2仪器与设备

分光光度计(721型，上海精密科学仪器有限公司)；超声波清洗机(kq-500e，昆山市超声仪器有限公司)；低速离心机(sc-3610，安徽中科中佳科学仪器有限公司)；水浴锅(hh-6，金坛市科析仪器有限公司)；恒温干燥箱(gzx-9070mbe，上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；电子天平(fa2004n，上海精密科学仪器有限公司)；粉碎机(jy7114，上海微型电机厂)。

1.3薏米多酚提取方法

用蒸馏水反复冲洗薏米除去杂质，置于恒温鼓风干燥箱105℃干燥2h，取出后粉碎，过20目筛，制得薏米粉，放于干燥瓶中密封保存备用。称取一定质量的薏米粉，按一定料液比加入一定体积分数的提取溶剂，置于超声波中超声提取一定时间，置于离心机中离心，取上清液挥干溶剂，用纯水洗涤定容到设定的体积，此处设定定容体积为50ml。

1.4薏米多酚含量测定方法

精密称取0.0100g没食子酸置于10ml容量瓶中，加入纯水充分溶解并定容，即得浓度为1mg/ml没食子酸标准储备液。分别移取0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml标准储备液于50ml容量瓶，用纯水定容，得到10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml标准系列溶液。用吸量管分别吸取标准系列溶液1ml于比色管中，依次加入1ml福林酚试剂、3.00ml7.5％无水碳酸钠溶液，摇匀后避光反应60min。同时做试剂空白，作为参比溶液，在765nm处测量吸光度值a。以没食子酸浓度为横坐标c，吸光度值为纵坐标a，得到回归方程a＝0.0128c+0.0154，相关系数为0.999，曲线线性良好，可以满足实验。

吸取1ml定容后的薏米多酚提取液置于比色管中，依次加入1ml福林酚试剂、3.00ml7.5％无水碳酸钠溶液，摇匀后避光反应60min，在765nm处测量吸光度值a，根据回归方程：a＝0.0128c+0.0154，获得薏米中所含多酚浓度c；再根据多酚提取率w公式：w＝(c×v)/m，获得多酚提取率w，其中v为样品定容体积，m为称样质量，c为样品中多酚浓度。

2结果与讨论

2.1单因素实验

本实验采用超声法提取薏米多酚，实验从不同提取溶剂、料液比、溶剂体积分数、提取温度、提取时间、提取次数、颗粒度7个单因素展开。不同提取溶剂分别为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和水，料液比分别为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50，溶剂体积分数分别为40％、50％、60％、70％、80％，提取温度分别为35℃、45℃、55℃、65℃、75℃，提取时间分别为10min、20min、30min、40min、50min，提取次数为1次～6次。

选取甲醇溶液的方法为：

分别取相同体积的甲醇溶液、乙醇溶液、丙酮溶液、乙酸乙酯溶液和水按照相同的料液比溶解薏米粉并按照相同的提取温度、相同的提取时间和相同的提取次数进行薏米多酚的提取，其中所述甲醇溶液、乙醇溶液、丙酮溶液、乙酸乙酯溶液的体积分数相同，测量并获得各提取液的薏米多酚提取率。

2.1.1提取溶剂对薏米多酚提取率的影响

表1为不同提取溶剂对薏米多酚提取率的影响，分析实验结果可知，用甲醇溶液做提取溶剂薏米多酚提取率最高，为52.1mg/100g，选定甲醇溶液为薏米多酚提取液。

表1不同提取溶剂对多酚提取率的影响

2.1.2料液比对薏米多酚提取率的影响

图1为料液比对薏米多酚提取率的影响，分析实验结果可知，薏米多酚提取率呈现先上升后下降的趋势，在料液比达到1:20时多酚提取率达到最高值53.7mg/100g，继续增加甲醇溶液，多酚提取率呈下降趋势。这可能由于料液比的增加导致含水量过多，多酚溶入甲醇溶液的速率缓慢所致，故最佳料液比为1:20。

2.1.3甲醇溶液体积分数对薏米多酚提取率的影响

图2为甲醇溶液体积分数对薏米多酚提取率的影响，多酚提取率随甲醇溶液体积分数的增大呈先上升后下降趋势，在甲醇体积分数为60％时达到最高值54.6mg/100g，继续增加甲醇溶液体积分数提取率呈下降趋势。分析原因，可能为甲醇体积分数高于60％时，多酚的溶解受到抑制，溶解度降低，故最佳甲醇溶液体积分数为60％。

2.1.4提取温度对薏米多酚提取率的影响

图3为提取温度对薏米多酚提取率的影响，分析结果可知，薏米多酚提取率呈现先上升后下降的趋势，在提取温度达到55℃时多酚提取率达到最大值70.2mg/100g，继续提高温度，提取率呈下降趋势。分析原因，开始升温时分子运动加快，加快多酚的溶解，但温度过高也会导致杂质溶出，降低多酚提取率；同时也会导致薏米糊化，影响多酚溶解，故最佳提取温度为55℃。

2.1.5提取时间对薏米多酚提取率的影响

图4为提取时间对薏米多酚提取率的影响，分析实验结果可知，多酚提取率呈现先升高后下降的趋势，在提取时间达到30min时多酚提取率达到最高值69.5mg/100g，提取时间大于30min，薏米多酚提取呈下降趋势。分析原因，可能为随着提取时间的增加，薏米多酚不断溶出，但过长的提取时间会使杂质不断溶出，影响多酚提取，故最佳提取时间为30min。

2.1.6提取次数对薏米多酚提取率的影响

图5为提取次数对薏米多酚提取率的影响，分析实验结果可知，多酚提取率呈现先上升后下降的趋势。上升趋势较明显，在提取次数达到3次时多酚提取率达到最高值75.4mg/100g，继续增加提取次数多酚提取率变化较小，相差不到2mg/100g。综合能耗等因素，确定最佳提取次数为3次。

2.1.7颗粒度对薏米多酚提取率的影响

颗粒度对多酚提取率的影响很显著，整粒薏米的多酚提取率为43.5mg/100g，粉状薏米多酚提取率为76.1mg/100g，整粒薏米的多酚提取率明显低于粉状薏米多酚提取率，粉状样品在超声辅助下与提取溶剂接触充分。将薏米粉过20目筛，保证多酚提取率的同时尽量降低对粉碎机的要求，降低设备成本。

2.2响应面实验

2.2.1box-behnken实验

根据响应面设计原理，在单因素实验基础上选择对薏米多酚提取率影响显著的4个单因素，即料液比、甲醇体积分数、提取温度、提取时间为自变量，多酚提取率为响应值，进行四因素三水平实验，共计29个实验点，5个中心实验点。响应面实验因素水平如表2所示，实验设计方案和结果如表3所示。

表2响应面实验因素编码及水平

表3响应面实验设计和结果

2.2.2回归模型的建立及显著性检验

应用响应面优化软件对数据进行方差分析，数据拟合得到y(多酚提取率)对a(料液比)、b(甲醇体积分数)、c(提取温度)、d(提取时间)的回归方程为：y＝76.54+1.53a+0.98b-2.10c+1.42d-0.55ab+2.12ac-2.77ad-1.63bc-2.67bd+0.000cd-3.49a²-1.89b²-11.14c²-1.94d²，对回归方程进行方差分析和显著性检验，结果如表4所示。根据模型的显著性、确定系数r²、校对确定系数radj²、信噪比、失拟项、变异系数等结果分析该模型的准确度和可信度。由表4可知，该回归模型p<0.01，表明该回归模型结果极为显著；失拟项p为0.1759>0.05，即失拟项不显著；确定系数r²为0.9315>0.8，说明该模型能解释93.15％的响应值变化；校正确定系数radj²为0.8629>0.8，与r²接近，说明模型的拟合程度好；信噪比为12.206，大于临界值4，说明模型的准确度高；变异系数cv为3.37％，小于10％，说明实验结果具有较高的精密度和可靠性。综上所述，该回归模型拟合度高，误差小，可信度高，可以用于薏米多酚提取优化。

分析p值的大小可知，有极为显著的因素，一次项c、二次项a²、c²；有显著的因素，一次项a、交互项ad、bd；也有不显著的因素，一次项b、d，二次项b²、d²，交互项ab、ac、bc、cd。由此可知，对响应值有影响的不仅仅是一次项的因素，还有二次项和交互项。说明每个因素对响应值的影响不是线性关系，而是二次关系，四个因素彼此影响，有交互作用。由f值大小可知a、b、c、d四个因素对薏米多酚提取率的影响大小为c>a>d>b，即提取温度>料液比>提取时间>甲醇体积分数。

表4回归模型方差分析和显著性检验

注：^*表示显著，^**表示极显著；

2.2.3交互作用分析

由表4可知，ad和bd交互作用对多酚提取率的影响极为显著(p<0.01)，ab和cd交互作用对多酚提取率的影响不显著(p＞0.05)，其等高线图和响应面图如图6至图13所示。等高线的形状可以判断因素交互作用的强弱，等高线的形状越接近圆形，则交互作用越弱。由图6至图13可知，提取时间和液料比、提取时间和甲醇体积分数的交互作用对多酚提取率影响显著，甲醇体积分数和液料比、提取时间和提取温度的交互作用对多酚提取率影响不显著。

根据响应面坡度的大小可以反映出因素水平改变对响应值的影响程度，响应面坡度越大，则影响越大。多酚提取率随因素交互作用的改变而有所波动，分析图6和图7可知，固定料液比为1:20，多酚提取率随着提取时间延长先上升后下降；固定提取时间为30min，多酚提取率随着料液比增加先上升后下降；当料液比为1:10、提取时间为50min时，多酚提取率达到最大值。分析图8和图9可知，固定甲醇体积分数60％，多酚提取率随着提取时间延长先上升后下降；固定提取时间为30min，多酚提取率随着甲醇体积分数增加先上升后下降；当甲醇体积分数40％、提取时间为50min时，多酚提取率达到最大值。分析图10和图11可知，固定料液比1:20，多酚提取率随着甲醇体积分数增加先上升后下降；固定甲醇体积分数为60％，多酚提取率随着料液比增加先上升后下降；当固定料液比1:30、甲醇体积分数80％时，多酚提取率达到最大值。分析图12和图13可知，固定提取温度55℃，多酚提取率随着提取时间延长先上升后下降；固定提取时间为30min，多酚提取率随着提取温度增加先上升后下降；当提取温度55℃、提取时间为30min时，多酚提取率达到最大值。

2.2.4响应面优化结果及实验验证

根据软件design-expert8.0.5.0优化出最佳工艺条件，提取温度54℃，料液比1:21.1，甲醇体积分数63.2％，提取时间33.6min，薏米多酚提取得率预测值为76.93mg/100g。考虑实验的易操作性，确定最佳工艺条件为提取温度54℃，料液比1:21，甲醇体积分数63％，提取时间34min。最佳工艺条件下，6次平行实验结果显示，薏米多酚提取率为75.75mg/100g，与理论预测值相差不大，证明回归模型良好的预测了薏米多酚的提取效果，优化后的工艺条件参数合理，适用于薏米多酚提取。

3结论

本发明通过超声法提取薏米多酚，探究单因素即不同提取溶剂、料液比、提取时间、提取温度、甲醇体积分数、颗粒度、提取次数对薏米多酚提取率的影响。单因素实验表明，当料液比1:20、甲醇体积分数60％、提取温度55℃、提取时间30min、提取3次时薏米多酚提取率最高；提取次数、提取溶剂、颗粒度的影响很明确，可确定提取次数为3次、提取溶剂为甲醇、薏米粉样品为响应面优化的实验条件。进行响应面分析，当料液比1:21.1，甲醇体积分数63.2％，提取温度54℃，提取时间33.6min时，薏米多酚提取率预测值为76.93mg/100g。最佳优化工艺条件下进行实验验证，薏米多酚提取率为75.75mg/100g，实测值与理论值具有良好的拟合度，优化的工艺条件适合薏米多酚提取。本发明建立的响应面法优化薏米多酚工艺条件，解决多因素组合问题对提取率的影响，该方法具有实验成本低、提取时间短、多酚提取率高等特点。能够为薏米多酚提取提供技术贮备，为薏米产品深加工提供思路和方向，具有一定应用和推广价值。