金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯生物传感器的制备及应用的制作方法

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯生物传感器的制备方法；本发明还涉及一种该制备方法制得的生物传感器在快速检测杏仁露氰化物中的应用。

背景技术：

乳制品作为一种与人们生活密切相关的食品，其发展也受到了政府、社会的极大关注和高度重视。乳制品安全是近年来食品安全的焦点之一，检测新技术运用滞后，部分标准缺乏，导致乳制品不安全事件屡禁不绝。乳制品污染多见于原料乳的掺假，为了提高乳制品中蛋白含量，向其中添加三聚氰胺和皮革水解物；为了乳及乳制品的保鲜，向乳中添加硫氰酸钠；杏仁露中的有害物质—氰化物主要来源于配料苦杏仁及保存条件不当产生的。这一系列有毒有害物质的污染造成食用者急性或慢性蓄积性中毒等危害，因此，为确保人类身体健康和食品安全，建立快速、有效、经济、环保的乳制品化学性污染的检测显得非常有意义。

氰化物是一类有氰基（cn^-）的剧毒化合物，氰根离子（cn^-）进入人体后，主要作用于血液，能抑制组织细胞中40多种酶的活性，引起整个细胞色素体系的氧化还原障碍，导致机体的氧化还原作用停止，造成细胞窒息，组织缺氧。食品中的氰化物不但会污染环境，使人、畜中毒甚至死亡，即使像铁氰酸盐和亚铁氰酸盐低毒性的氰化物复盐，如果大量排入地面水中，经过阳光照射和其他条件配合也可以分解释放出相当数量的游离氰化物，导致水生物中毒死亡。

食品中氰化物的检测方法主要有分光光度法、气相色谱法，离子色谱法、气相色谱-质谱联用仪、液相色谱法等。但这些方法检测效率低、干扰大、数据不可靠，不适用于杏仁露中氰化物的快速检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯生物传感器的制备方法，能制得用于快速检测杏仁露中氰化物的生物传感器。

本发明的另一个目的是提供一种上述制备方法制得的生物传感器在快速检测杏仁露氰化物中的应用，消除基质干扰，提高检测效率，节约成本。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯电化学生物传感器的制备方法，具体按以下步骤进行：

1）金纳米粒子的制备：

采用抗坏血酸还原法制备金纳米粒子，具体制备过程如下：按体积比1︰1︰1.5︰25，分别取质量分数为1%的氯金酸溶液、质量分数为0.7%的抗坏血酸溶液、摩尔体积浓度为0.2mol/l的碳酸钾溶液和蒸馏水，将氯金酸溶液、碳酸钾溶液和蒸馏水混匀，在搅拌的条件下加入抗坏血酸溶液，立即呈现紫红色；加蒸馏水至500ml，加热至溶液变为透明红色为止，制得粒径为10～15nm的金纳米粒子；

2）氧化石墨烯表面的环氧功能化：

按40ml去离子水中加入10ml质量体积浓度为8mg/ml的氧化石墨烯悬浮液和1.5ml环氧氯丙烷的比例，分别取去离子水、氧化石墨烯悬浮液和环氧氯丙烷，氧化石墨烯悬浮液加入去离子水中，超声20～30min，得到均一氧化石墨烯悬浮液；向该均一氧化石墨烯悬浮液中加入10wt%氢氧化钠溶液，待均一氧化石墨烯悬浮液的ph值为9.5～10.0后，逐滴加入环氧氯丙烷，在60～80℃的温度下磁力搅拌3～4h，离心，水洗三次，得环氧基团功能化氧化石墨烯；

3）β-环糊精功能化石墨烯的制备：

按质量比1︰10～15，分别取环氧基团功能化氧化石墨烯和β-环糊精，将环氧基团功能化氧化石墨烯完全溶解于ph值为9.5～10.0的碳酸缓冲溶液中，然后，加入β-环糊精，在60～70℃的温度下磁力搅拌3～4h，用14000rpm的离心机离心10min，水洗三次，冷冻干燥，得β-环糊精功能化的氧化石墨烯；

4）金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物的制备：

按质量比1︰6～8︰14～21，分别取粉末状的4-氨基苯硫酚、β-环糊精功能化的氧化石墨烯和金纳米粒子，将4-氨基苯硫酚加入无水乙醇中，超声溶解，然后，加入β-环糊精功能化的氧化石墨烯，超声30～40min，再加入金纳米粒子，磁力搅拌20～24h，离心分离，干燥，得金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物；

5）将金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物分散在体积分数为75%的乙醇中，得到摩尔体积浓度为1mol/l的分散液；

6）用三氧化二铝粉末将裸玻碳电极打磨干净，红外灯下烘干；然后，在打磨干净的裸玻碳电极表面滴涂1～2滴步骤5）制得的分散液，自然晾干作为工作电极，以铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，构成金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯电化学生物传感器。

本发明所采用的另一个技术方案是：一种上述生物传感器在快速检测杏仁露氰化物中的应用。具体为：将硫酸铵溶液作为蛋白沉淀剂，加入杏仁露中，通过盐析法沉淀杏仁露中的蛋白质，再通过离心分离，取上清液定容，在定容后的上清液中加入氯胺t和磷酸，涡旋衍生，得杏仁露氰化物提取液，将构成的金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯电化学生物传感器放入该杏仁露氰化物提取液中，在电压-0.1～1.0v、电流、0～10a的条件下，通过电化学工作站chi600e对氰化物进行定量和定性快速检测。

在杏仁露中添加硫酸铵溶液，提取过程中主要为涡旋、超声、离心，操作简单易行，极大地消除了基质的干扰。使得检测的灵敏度高，数据可靠，分析速度快。

本发明制备方法将金纳米粒子负载到β-环糊精功能化石墨烯上，极大地提高了石墨烯在水中的溶解度和分散性，构筑的生物传感器对杏仁露中氰化物具有很好的选择吸附性。利用该纳米复合物构筑电化学生物传感器对杏仁露中氰化物进行快速检测，操作简单快速、重现性好、选择性高。数据可靠，干扰小，检测的灵敏度高，分析速度快，实用性强。

附图说明

图1是本发明实施例1制得的金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物的透射电镜图。

图2是本发明实施例1构筑的电化学生物传感器、对比例1中的三电极、对比例2中的三电极和对比例3中的三电极对杏仁露中氰化物快速检测时，在电化学工作站chi600e通过一定范围电压和电流的示差脉冲伏安图。

图3是本发明实施例1制得的金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物构筑电化学生物传感器对不同浓度氰化物吸附性能图。

图4是本发明实施例1杏仁露氰化物提取过程中衍生剂用量的选择图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明。

实施例1

1）将在4℃预冷的质量分数为1%的氯金酸溶液5ml、摩尔体积浓度为0.2mol/l的碳酸钾溶液7.5ml、蒸馏水125ml混匀。在搅拌下加入5ml质量分数0.7%的抗坏血酸溶液，立即呈现紫红色。加蒸馏水至500ml，加热至溶液变为透明红色为止，得粒径为10～15nm的金纳米粒子；

2）取质量体积浓度为8mg/ml氧化石墨烯悬浮液10ml，加入40ml去离子水中，超声20min，得到均一的氧化石墨烯悬浮液；向氧化石墨烯悬浮液中加入10wt%的氢氧化钠溶液，待悬浮液的ph值达到9.5后逐滴加入1.5ml环氧氯丙烷；在60℃条件下磁力搅拌3h，离心，水洗三次，得到环氧基团功能化的氧化石墨烯；

3）将环氧基团功能化的氧化石墨烯溶解在60mlph=10的碳酸缓冲溶液中，向其中加入0.5g的β-环糊精，在60℃条件下磁力搅拌3h，，用14000rpm的离心机离心10min，并水洗三次，冷冻干燥，得到β-环糊精功能化的氧化石墨烯；

3）称取5mg的4-氨基苯硫酚固体粉末溶解于80ml无水乙醇，超声使其溶解，加入30mg的β-环糊精功能化的氧化石墨烯，超声30min，再加入70mg金纳米粒子，磁力搅拌24h；离心分离，干燥，得金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物；

5）将金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物分散在体积分数为75%的乙醇中，得到摩尔体积浓度为1mol/l的分散液；

6）用三氧化二铝粉末将裸玻碳电极打磨干净，红外灯下烘干；然后，在打磨干净的裸玻碳电极表面滴涂1～2滴步骤5）制得的分散液，自然晾干作为工作电极，以铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极电化学生物传感器。

实施例1制得的金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物的透射电镜图，如图1所示。图1显示该功能化石墨烯复合物的结构分布情况，β-环糊精极大地提高了石墨烯在水中的溶解度和分散性，从图中可以看出功能化石墨烯没有出现团聚现象，并且金纳米粒子均匀地分散在功能化石墨烯表面上，由于金纳米粒子和β-环糊精的特异性及石墨烯比表面积大，提高了该电化学生物传感器的电化学性能。

对比例1

将硫酸铵溶液作为蛋白沉淀剂，加入杏仁露中，通过盐析法沉淀杏仁露中的蛋白质，再通过离心分离，取上清液定容，在定容后的上清液中加入氯胺t和磷酸，涡旋衍生，得杏仁露中氰化物提取液。用三氧化二铝粉末将裸玻碳电极打磨干净，红外灯下烘干，作为工作电极，以铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，将该三电极放入杏仁露中氰化物提取液中进行快速检测。

对比例2

将实施例1制得金纳米粒子分散于二次蒸馏水中，得金纳米粒子分散液。

将硫酸铵溶液作为蛋白沉淀剂，加入杏仁露中，通过盐析法沉淀杏仁露中的蛋白质，再通过离心分离，取上清液定容，在定容后的上清液中加入氯胺t和磷酸，涡旋衍生，得杏仁露中氰化物提取液。用三氧化二铝粉末将裸玻碳电极打磨干净，红外灯下烘干；然后，在打磨干净的裸玻碳电极表面滴涂1～2滴金纳米粒子分散液，自然晾干作为工作电极，以铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，将该三电极放入杏仁露中氰化物提取液中进行快速检测。

对比例3

将实施例1制得环氧基团功能化的氧化石墨烯分散于二次蒸馏水中，得氧化石墨烯分散液。

将硫酸铵溶液作为蛋白沉淀剂，加入杏仁露中，通过盐析法沉淀杏仁露中的蛋白质，再通过离心分离，取上清液定容，在定容后的上清液中加入氯胺t和磷酸，涡旋衍生，得杏仁露中氰化物提取液。用三氧化二铝粉末将裸玻碳电极打磨干净，红外灯下烘干；然后，在打磨干净的裸玻碳电极表面滴涂1～2滴氧化石墨烯分散液，自然晾干作为工作电极，以铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，将该三电极放入杏仁露中氰化物提取液中进行快速检测。

实施例1构筑的电化学生物传感器、对比例1中的三电极、对比例2中的三电极和对比例3中的三电极对杏仁露中氰化物快速检测时，在电化学工作站chi600e通过一定范围电压和电流的示差脉冲伏安图，如图2所示。从图中可以看出，与裸玻碳电极（d）、金纳米粒子修饰电极（b）、石墨烯修饰电极（c）相比较，实施例1中构筑的金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物修饰电极（a）对杏仁露氰化物具有很好的电化学响应。

实施例1制得的金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物构筑的电化学生物传感器对不同浓度氰化物的吸附图，如图3所示，从图中可以看出，随着杏仁露中氰化物含量的不断增加，其电流信号也不断地增大，说明该纳米复合物构筑的电化学生物传感器对杏仁露中不同浓度氰化物具有良好的线性关系，最低检出限为0.05μg/ml。

杏仁露氰化物提取过程中衍生剂用量的选择图，如图4所示，利用不含苦杏仁的杏仁露阴性样品作为分析物，准确移取该杏仁露7份20ml于顶空瓶中编号为1，2，3，4，5，6，7，编号为1试样作为空白，其他试样中分别加入20μl浓度为0.05mg/l氰离子标准储备液，再依次添加50μl、100μl、200μl、300μl、350μl、400μl、500μl浓度为10g/l的氯胺t衍生剂溶液，从图4可以观察氯胺t的用量对响应值的影响情况。由图4可以看出，当氯胺t用量达到300μl后电化学响应最好，即可获得满意的实验结果。

实施例2

按体积比1︰1︰1.5︰25，分别取质量分数为1%的氯金酸溶液、质量分数为0.7%的抗坏血酸溶液、摩尔体积浓度为0.2mol/l的碳酸钾溶液和蒸馏水，将氯金酸溶液、碳酸钾溶液和蒸馏水混匀，在搅拌的条件下加入抗坏血酸溶液，立即呈现紫红色；加蒸馏水至500ml，加热至溶液变为透明红色为止，制得粒径为10～15nm的金纳米粒子；

按40ml去离子水中加入10ml质量体积浓度为8mg/ml的氧化石墨烯悬浮液和1.5ml环氧氯丙烷的比例，分别取去离子水、氧化石墨烯悬浮液和环氧氯丙烷，氧化石墨烯悬浮液加入去离子水中，超声30min，得到均一氧化石墨烯悬浮液；向该均一氧化石墨烯悬浮液中加入10wt%氢氧化钠溶液，待均一氧化石墨烯悬浮液的ph值为10.0后，逐滴加入环氧氯丙烷，在80℃的温度下磁力搅拌4h，离心，水洗三次，得环氧基团功能化氧化石墨烯；按质量比1︰15，分别取环氧基团功能化氧化石墨烯和β-环糊精，将环氧基团功能化氧化石墨烯完全溶解于ph值为9.5的碳酸缓冲溶液中，然后，加入β-环糊精，在70℃的温度下磁力搅拌4h，用14000rpm的离心机离心10min，水洗三次，冷冻干燥，得β-环糊精功能化的氧化石墨烯；按质量比1︰8︰21，分别取粉末状的4-氨基苯硫酚、β-环糊精功能化的氧化石墨烯和金纳米粒子，将4-氨基苯硫酚加入无水乙醇中，超声溶解，然后，加入β-环糊精功能化的氧化石墨烯，超声40min，再加入金纳米粒子，磁力搅拌20h，离心分离，干燥，得金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物；将金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物分散在体积分数为75%的乙醇中，得到摩尔体积浓度为1mol/l的分散液；用三氧化二铝粉末将裸玻碳电极打磨干净，红外灯下烘干；然后，在打磨干净的裸玻碳电极表面滴涂1～2滴制得的分散液，自然晾干作为工作电极，以铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，构成金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯电化学生物传感器。

实施例3

按实施例2的方法制得金纳米粒子；按40ml去离子水中加入10ml质量体积浓度为8mg/ml的氧化石墨烯悬浮液和1.5ml环氧氯丙烷的比例，分别取去离子水、氧化石墨烯悬浮液和环氧氯丙烷，氧化石墨烯悬浮液加入去离子水中，超声25min，得到均一氧化石墨烯悬浮液；向该均一氧化石墨烯悬浮液中加入10wt%氢氧化钠溶液，待均一氧化石墨烯悬浮液的ph值为9.75后，逐滴加入环氧氯丙烷，在70℃的温度下磁力搅拌3.5h，离心，水洗三次，得环氧基团功能化氧化石墨烯；按质量比1︰10，分别取环氧基团功能化氧化石墨烯和β-环糊精，将环氧基团功能化氧化石墨烯完全溶解于ph值为9.75的碳酸缓冲溶液中，然后，加入β-环糊精，在65℃的温度下磁力搅拌3.5h，用14000rpm的离心机离心10min，水洗三次，冷冻干燥，得β-环糊精功能化的氧化石墨烯；按质量比1︰7︰17.5，分别取粉末状的4-氨基苯硫酚、β-环糊精功能化的氧化石墨烯和金纳米粒子，将4-氨基苯硫酚加入无水乙醇中，超声溶解，然后，加入β-环糊精功能化的氧化石墨烯，超声35min，再加入金纳米粒子，磁力搅拌22h，离心分离，干燥，得金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物；将金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物分散在体积分数为75%的乙醇中，得到摩尔体积浓度为1mol/l的分散液；用三氧化二铝粉末将裸玻碳电极打磨干净，红外灯下烘干；然后，在打磨干净的裸玻碳电极表面滴涂1～2滴制得的分散液，自然晾干作为工作电极，以铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，构成金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯电化学生物传感器。

实施例4

按实施例2的方法制得金纳米粒子、环氧基团功能化氧化石墨烯；按质量比1︰12，分别取环氧基团功能化氧化石墨烯和β-环糊精，将环氧基团功能化氧化石墨烯完全溶解于ph值为9.75的碳酸缓冲溶液中，然后，加入β-环糊精，在65℃的温度下磁力搅拌3.5h，用14000rpm的离心机离心10min，水洗三次，冷冻干燥，得β-环糊精功能化的氧化石墨烯；按质量比1︰6︰21，分别取粉末状的4-氨基苯硫酚、β-环糊精功能化的氧化石墨烯和金纳米粒子，将4-氨基苯硫酚加入无水乙醇中，超声溶解，然后，加入β-环糊精功能化的氧化石墨烯，超声35min，再加入金纳米粒子，磁力搅拌22h，离心分离，干燥，得金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物；再按实施例2的方法制得分散液，并构成金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯电化学生物传感器。

实施例5

按实施例1的方法制得金纳米粒子、环氧基团功能化氧化石墨烯和β-环糊精功能化的氧化石墨烯；按质量比1︰6︰17.5，分别取粉末状的4-氨基苯硫酚、β-环糊精功能化的氧化石墨烯和金纳米粒子，将4-氨基苯硫酚加入无水乙醇中，超声溶解，然后，加入β-环糊精功能化的氧化石墨烯，超声35min，再加入金纳米粒子，磁力搅拌22h，离心分离，干燥，得金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物；再按实施例1的方法制得分散液，并构成金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯电化学生物传感器。

实施例6

按实施例1的方法制得金纳米粒子、环氧基团功能化氧化石墨烯和β-环糊精功能化的氧化石墨烯；按质量比1︰8︰14，分别取粉末状的4-氨基苯硫酚、β-环糊精功能化的氧化石墨烯和金纳米粒子，将4-氨基苯硫酚加入无水乙醇中，超声溶解，然后，加入β-环糊精功能化的氧化石墨烯，超声35min，再加入金纳米粒子，磁力搅拌22h，离心分离，干燥，得金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物；再按实施例1的方法制得分散液，并构成金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯电化学生物传感器。

实施例7

按实施例2的方法制得金纳米粒子、环氧基团功能化氧化石墨烯和β-环糊精功能化的氧化石墨烯；按质量比1︰8︰17.5，分别取粉末状的4-氨基苯硫酚、β-环糊精功能化的氧化石墨烯和金纳米粒子，将4-氨基苯硫酚加入无水乙醇中，超声溶解，然后，加入β-环糊精功能化的氧化石墨烯，超声35min，再加入金纳米粒子，磁力搅拌22h，离心分离，干燥，得金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物；再按实施例2的方法制得分散液，并构成金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯电化学生物传感器。

实施例8

按实施例2的方法制得金纳米粒子、环氧基团功能化氧化石墨烯和β-环糊精功能化的氧化石墨烯；按质量比1︰7︰14，分别取粉末状的4-氨基苯硫酚、β-环糊精功能化的氧化石墨烯和金纳米粒子，将4-氨基苯硫酚加入无水乙醇中，超声溶解，然后，加入β-环糊精功能化的氧化石墨烯，超声35min，再加入金纳米粒子，磁力搅拌22h，离心分离，干燥，得金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物；再按实施例2的方法制得分散液，并构成金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯电化学生物传感器。

实施例9

按实施例2的方法制得金纳米粒子、环氧基团功能化氧化石墨烯和β-环糊精功能化的氧化石墨烯；按质量比1︰7︰21，分别取粉末状的4-氨基苯硫酚、β-环糊精功能化的氧化石墨烯和金纳米粒子，将4-氨基苯硫酚加入无水乙醇中，超声溶解，然后，加入β-环糊精功能化的氧化石墨烯，超声35min，再加入金纳米粒子，磁力搅拌22h，离心分离，干燥，得金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯复合物；再按实施例2的方法制得分散液，并构成金纳米粒子负载β-环糊精功能化石墨烯电化学生物传感器。