一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及检测试剂盒
技术领域：
，具体涉及一种猪圆环病毒2型的elisa抗原检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：猪圆环病毒2型(procinecircovirustype2，pcv2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，pmws)的主要病原。pmws主要发生在5-12周龄的断奶仔猪，其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等。病原学及血清学调查研究表明，该病在许多国家广泛存在，给养猪业造成严重的经济损失。pcv2属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种单股共价闭合环状dna病毒，基因组含有1766～1768nt，结构简单，主要含有2个阅读框架(orfs)：orf1编码病毒复制相关蛋白rep和rep’，参与病毒复制；orf2编码病毒衣壳蛋白cap，是病毒的结构蛋白，与病毒的致病性和免疫原性有关。目前，疫苗免疫接种被认为是防控猪圆环病毒病的有效手段，商品化疫苗的推广应用为有效防控中国pcv2疫情发挥了重要作用。国内商品化pcv2疫苗众多，疫苗的效力检测一般采用免疫攻毒法，该方法经典却耗时耗力，而且动物免疫是必不可少的环节。技术实现要素：针对上述问题，本发明提供了一种猪圆环病毒2型的elisa抗原检测试剂盒，其能解决现有疫苗的效力检测方法费时费力，并且需要免疫的技术问题。一种猪圆环病毒2型的elisa抗原检测试剂盒，其特征在于：所述elisa抗原检测试剂盒包括包被板、阳性质控血清、阴性质控血清、对照样品、酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液；所述包被板由猪圆环病毒2型抗原包被，所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活培养物纯化后的猪圆环病毒2型全病毒蛋白；所述对照样品为猪圆环病毒2型参考疫苗，所述猪圆环病毒2型参考疫苗为猪圆环病毒2型灭活培养物与佐剂混合制成。进一步的，所述猪圆环病毒2型灭活培养物由以下方法制得：将猪圆环病毒2型毒种接种于pk细胞的培养瓶中，置37℃下吸附30分钟，加入细胞维持液，置37℃下旋转培养，转速为10～12转/小时，培养4日后，置-20℃下冻融3次，收获细胞培养物并留样作病毒含量测定，将检验合格的病毒液加入β-丙酰内酯灭活，使其终浓度为0.1％，随即充分混匀，4℃20小时，37℃振摇2小时，得到所述猪圆环病毒2型灭活培养物。进一步的，所述猪圆环病毒2型抗原的包被浓度为0.05-5μg/ml，包被稀释液为0.1mol/l，ph9.6的碳酸盐缓冲液。进一步的，所述阳性质控血清为所述猪圆环病毒2型全病毒蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔后采集血清，经mabselect纯化所得，稀释比例为1:1000-1:4000；所述阴性质控血清为健康新西兰大白兔的血清经mabselect纯化后所得，稀释比例为1:50-1:500。进一步的，所述酶标二抗为hrp-羊抗兔(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg)，稀释浓度为1:1000-1:20000，稀释液为含有0.1-5％(w/v)的牛血清蛋白和0.02-0.05％(v/v)proclin300的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/l，ph7.2-7.4。进一步的，所述样品稀释液为含有0.1-5％(w/v)的牛血清蛋白和0.02-0.05％(v/v)proclin300的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/l，ph7.2-7.4。进一步的，所述洗涤液为10倍的浓缩洗涤液，所述10倍的浓缩洗涤液为含有0.5％(v/v)吐温-20的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.1mol/l，ph7.2-7.4。进一步的，所述显色液为tmb底物显色液。进一步的，所述终止液为2mol/l的h2so4。本发明还提供了上述elisa抗原检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：(1)向包被板分别加入1：2稀释的待检样品、1：2稀释的对照样品各一列，每孔50μl；(2)向包被板剩余列中分别加入1:2稀释的阴性质控血清一列、1:2稀释的阳性质控血清一列，作为对照，每孔100μl；(3)向包被板的待检样品、对照样品列中加入阳性质控血清，每孔50μl，盖好包被板；(4)包被板置37℃反应1小时；(5)倒掉孔内液体，用洗涤液洗涤3～5次，每孔300μ1，最后一次洗涤后拍干板子；(6)每孔加入100μ1辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg，酶标板置37℃反应1小时；(7)倒掉孔内液体，用洗涤液洗涤3～5次，每孔300μ1，最后一次洗涤后拍干板子；(8)每孔加入100μ1tmb底物显色液，室温显色15分钟；(9)每孔加入50μ1终止液，10分钟内在酶标仪上读取od450nm值；(10)结果计算：阴性质控血清1:2稀释对照孔od450nm值＜0.4，阳性质控血清1:2稀释对照孔od450nm值＞1.0，待检疫苗与对照样品测定的od450nm值采用relpot4.0软件进行相对效力rp值计算，当rp值大于1.0则待检疫苗合格。其中，洗涤液是用去离子水稀释后的1倍工作洗涤液。微生物资源信息本发明涉及的猪圆环病毒2型(porcinecircovirus2，pcv2)sh株(保藏号为cgmccno.2389，由南京农业大学姜平教授提供)，该毒株为我国商品化猪圆环病毒2型灭活疫苗(sh株)的生产用种毒，猪圆环病毒2型灭活疫苗(sh株)是由中华人民共和国农业部批准为二类新兽药(农业部公告1448号，2010.08.27发布)。本发明通过elisa抗原检测试剂盒检测疫苗效力，该试剂盒以及基于该试剂盒的检测方法将疫苗中蛋白含量与对照样品进行比较，无需对试验动物进行免疫，一方面，省时省力，降低成本，另一方面，可以使疫苗的效力检验减少对试验动物的依赖，降低了试验动物本身的差异对效力检验的影响，尊重了动物试验的“3r”原则。附图说明图1为实施例纯化后pcv2全病毒蛋白的westernblot鉴定，其中，pm为彩色预染蛋白质分子标准量，1为pk细胞培养物，2为pcv2全病毒蛋白。图2为实施例阳性质控血清的sds-page鉴定，其中，pm为彩色预染蛋白质分子标准量，1为纯化前的兔血清，2为纯化后的兔血清。具体实施方式实施例1：一种猪圆环病毒2型的elisa抗原检测试剂盒一种猪圆环病毒2型的elisa抗原检测试剂盒，elisa抗原检测试剂盒包括包被板、阳性质控血清、阴性质控血清、对照样品、酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液；包被板由猪圆环病毒2型抗原包被，猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活培养物纯化后的猪圆环病毒2型全病毒蛋白；对照样品为猪圆环病毒2型参考疫苗，猪圆环病毒2型参考疫苗为猪圆环病毒2型灭活培养物与佐剂混合制成。试剂盒各组成的配制和制备说明：1、猪圆环病毒2型灭活培养物的制备：将猪圆环病毒2型毒种按5％(v/v)接种于长成良好单层pk细胞的培养瓶中，置37℃下吸附30分钟，加入含有2％新生牛血清的dmem维持液，置37℃下旋转培养，转速为10～12转/小时，每日观察1～2次，细胞应生长良好，培养4日后，置-20℃下冻融3次，收获细胞培养物并留样作病毒含量测定，将检验合格的病毒液加入β-丙酰内酯灭活，使其终浓度为0.1％，随即充分混匀，4℃20小时，37℃振摇2小时，得到猪圆环病毒2型灭活培养物。2、猪圆环病毒2型全病毒蛋白的制备：将猪圆环病毒2型灭活培养物用分子筛sepharosetm4fastflow进行纯化，纯化的pcv2全病毒蛋白用bca测定浓度，蛋白浓度为320μg/ml，同时将纯化的pcv2全病毒蛋白进行westernblot鉴定，在27kd出有特异性的目的条带。3、包被板：用0.1mol/l碳酸盐缓冲液(ph9.6)将纯化的pcv2全病毒蛋白稀释至2μg/ml，加入96孔酶标板，100μl/孔，37℃孵育2小时后，用1倍的工作洗涤液洗涤3次后拍干，加入5％(w/v)脱脂乳封闭，200μl/孔，37℃孵育2小时，用1×洗涤液洗涤3次，25℃风干。4、阳性质控血清：(1)将纯化过的猪圆环病毒2型全病毒蛋白与弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂1:1混合乳化，配制成免疫原；皮下多点注射免疫健康的新西兰大白兔，首次免疫(弗氏完全佐剂)后2周进行第2次免疫(弗氏不完全佐剂)，首免后4周采血测定抗体效价，若兔血清中猪圆环病毒2型抗体未达到1:3200则进行第三次免疫(弗氏不完全佐剂)，2周后采血测定血清抗体效价，当抗体效价达到3200时可以分离收集兔抗猪圆环病毒2型高免血清。(2)将此兔血清进行纯化：mabselect填料亲和层析柱用ph7.2的pbs平衡10个柱体积，然后加入离心弃沉淀的兔抗猪圆环病毒2型高免血清，用10个柱体积的pbs洗涤杂蛋白，最后用5个柱体积的0.1mph2.9的甘氨酸-hcl洗脱，收集洗脱液，即制得纯化的兔抗猪圆环病毒2型高免血清，纯化的高免血清进行sds-page纯度鉴定。(3)将鉴定合格的兔抗猪圆环病毒2型高免血清进行1:1000稀释，即制得阳性质控血清。5、阴性质控血清：采集健康兔血清，离心分离血清，将各兔的血清无菌混合，经mabselect填料亲和层析柱纯化，将阴性血清进行1:50倍稀释，即制得阴性质控血清。6、酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg，稀释浓度为1:1000-1:20000，稀释液为含有0.1-5％(w/v)的牛血清蛋白和0.02-0.05％(v/v)proclin300的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/l，ph7.2-7.4。7、样品稀释液：含有0.1-5％(w/v)的牛血清蛋白和0.02-0.05％(v/v)proclin300的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/l，ph7.2-7.4。磷酸盐缓冲液的配制：取nacl8.0g、kh2po4-2h2o0.2g、na2hpo4-2h2o2.9g和kcl0.2g，溶于灭菌双蒸水中，定容至1000ml；然后加入5mg牛血清蛋白、0.5mlproclin300，混匀。8、10×洗涤液：取nacl80g、kh2po4-2h2o2g、na2hpo4-2h2o29g、kcl2g、tween-205ml，加入灭菌双蒸水，定容至1000ml。9、tmb显色液：a液：称取na2hpo414.6g，柠檬酸9.33g，30％h2o22ml，加双蒸水至1000ml，调ph值至5.0～5.4；b液：取3,3’,5,5’-四甲基联苯二胺(tmb)20mg，无水乙醇10ml，加双蒸水至1000ml；tmb底物液：将a液与b液等量混合，分装于棕色瓶内。10、终止液：取蒸馏水1778ml，缓慢加入h2so4(96％)222ml，分装。11、对照样品：将猪圆环病毒2型灭活培养物调整至病毒含量为2.25×105.0tcid50/ml，与水溶性佐剂按9:1比例混合制成对照样品。水溶性佐剂的配制：称取卡波姆50g，加入蒸馏水1000ml，115℃高压灭菌30分钟，呈胶冻状，室温放置。使用前缓慢加入灭菌的5％氢氧化钠溶液，使其转化为水溶性状，加入生育酚，4-8℃保存。对照样品按照《猪圆环病毒2型灭活疫苗(sh，ⅱ)制造与检验试行规程》中参考疫苗质量标准进行性状、无菌检验、安全检验、效力检验。(1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。(2)安全检验用14～21日龄pcv2elisa抗体阴性和pcv2抗原阴性健康仔猪3头，每头肌肉注射疫苗4ml，连续观察14日，无异常临床反应。(3)效力检验仔猪免疫攻毒法：用14～21日龄prrsvelisa抗体阴性、pcv2-elisa抗体阴性和pcv2抗原阴性阴性健康易感仔猪15头，分成3组，每组5头，第1组每头颈部肌肉注射疫苗1ml，两周后按相同途径和剂量进行第2次接种，第2组作非免疫攻毒对照，第3组作空白对照(非免疫、非攻毒)，均隔离饲养观察。首免后5周对所有猪称重。第1、2组用pcv2sh株(含106.0tcid50/ml)攻击，每头猪滴鼻1ml、肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒后第4、7日三组所有猪分别在猪的两腋下及两臀部位的4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(klh/icfa，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)，同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11日和19日再次分别腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。对照样品免疫组未见明显的临床表现，非免疫攻毒组从第7天起有2头出现被毛粗乱、食欲减退、消瘦。攻毒后25日剖杀所有试验猪，进行病理解剖，观察病理变化，非免疫攻毒组有2头出现明显病变，包括淋巴结异常肿胀，切面均匀白色；肺脏肿胀，弹性减低等。取出腹股沟淋巴结组织进行免疫组化检测pcv2抗原，不免疫攻毒对照组有4头阳性，对照样品免疫组保护效率为100％(表1)。表1.免疫猪攻毒保护试验结果小鼠免疫试验法：用5～6周龄pcv2elisa抗体阴性、健康雌性清洁级balb/c小鼠10只，分成2组，每组5只。第1组皮下接种疫苗，每只0.2ml，两周后按相同途径和剂量进行第2次接种；第2组不接种，作空白对照。各组小鼠均隔离饲养观察。首免后5周采血，分离血清，测定血清中pcv2elisa抗体效价。结果如表2所示，对照组小鼠血清均低于1:50，样品疫苗免疫组抗体平均效价为1：2080。表2小鼠效力检验结果组别12345平均效价空白对照组＜1:50＜1:50＜1:50＜1:50＜1:50＜1:50样品组1:8001:32001:32001:16001:16001:2080实施例2：试剂盒的检测方法上述elisa抗原检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：(1)向包被板分别加入1：2稀释的待检样品、1：2稀释的对照样品各一列，每孔50μl；(2)向包被板剩余列中分别加入1:2稀释的阴性质控血清一列、1:2稀释的阳性质控血清一列，作为对照，每孔100μl；(3)向包被板的待检样品、对照样品列中加入阳性质控血清，每孔50μl，盖好包被板；(4)包被板置37℃反应1小时；(5)倒掉孔内液体，用洗涤液洗涤3～5次，每孔300μ1，最后一次洗涤后拍干板子；(6)每孔加入100μ1辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg，酶标板置37℃反应1小时；(7)倒掉孔内液体，用洗涤液洗涤3～5次，每孔300μ1，最后一次洗涤后拍干板子；(8)每孔加入100μ1tmb底物显色液，室温显色15分钟；(9)每孔加入50μ1终止液，10分钟内在酶标仪上读取od450nm值；(10)结果计算：阴性质控血清1:2稀释对照孔od450nm值＜0.4，阳性质控血清1:2稀释对照孔od450nm值＞1.0，待检疫苗与对照样品测定的od450nm值采用relpot4.0软件进行相对效力rp值计算，当rp值大于1.0则待检疫苗合格。其中，洗涤液是用去离子水稀释后的1倍工作洗涤液。实验例1：特异性检测用建立好的猪圆环病毒2型elisa抗原检测试剂盒检测pcv2、pedv、hps、prrsv、pk-15、pcv1，分析该方法的特异性。将这些样品只进行1:2稀释度检测，检测结果(表3)显示，加入pcv2抗原其检测到的od450nm值较低，而其它病原检测其od450nm值均大于1.0，表明所建立的猪圆环病毒2型elisa抗原检测试剂盒具有良好的特异性。表3特异性检测结果实验例2：重复性检测2.1批内重复性试验在建立好的猪圆环病毒2型elisa抗原检测试剂盒，包括3个批次，1805001、1805002、1805003中，随机抽取1805001批猪圆环病毒2型elisa抗原检测试剂盒5盒，对猪圆环病毒2型灭活疫苗(sh株，ⅱ)(批号)进行疫苗抗原相对效力测定，计算标准差和批内变异系数，结果见表4。表4批内重复性试验检测结果。2.2批间重复性试验在建立好的猪圆环病毒2型elisa抗原检测试剂盒，包括3个批次，1805001、1805002、1805003中，随机抽取1805001、1805002、1805003批固相竞争elisa试剂盒各1盒，对同一批猪圆环病毒2型灭活疫苗(sh株，ⅱ)进行疫苗抗原相对效力测定，计算标准差和批间变异系数，结果见表5。表5批间重复性试验检测结果。批内实验结果标准差为0.08，变异系数为6.45％，批间实验结果标准差为0.058，变异系数为4.62％，表明本研究建立的elisa检测方法具有较好的重复性。实验例3：效力检测方法对比实验猪圆环病毒2型的elisa抗原检测试剂盒的检测方法与小鼠效力检验方法的比较分别挑选不同效价的10批猪圆环病毒2型灭活疫苗(sh株，ⅱ)进行检测，结果如表6所示，随着小鼠效力检验平均效价的升高，rp值也逐渐增大，相对效力rp值与小鼠效力检验的平均抗体效价有良好的平行性关系，因此可以用来替代小鼠效力检验方法。表6两种效力检测方法的检测结果。当前第1页12