本发明涉及免疫诊断领域，具体涉及一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒及使用方法。
背景技术：
：天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase，ast)广泛存在于人体各组织细胞中，尤其以肝脏细胞、心肌细胞含量最为丰富，所以ast常用于肝脏疾病和心肌疾病的检测。电泳分析法进一步将ast分为胞浆型ast(cytosolicast，c-ast)和线粒体型ast(mitochondrialast，m-ast)。血清中ast的活性为c-ast和m-ast的活性之和。ast、m-ast、c-ast三者密切相关。m-ast的检测方法目前主要有免疫抑制法和酶水解法2种，但2种方法的测定结果存在差异。这表明ast和m-ast升高时免疫抑制法m-ast的特异性下降，原因可能在于抗c-ast抗体不足，c-ast的活性没有完全抑制。通过外加抗c-ast抗体试验充分说明了抗c-ast抗体不足的问题，样本在额外加入抗c-ast抗体后，测定值下降，并与抗体加入量相关。抗c-ast抗体浓度是m-ast测定的主要影响因素之一，试剂中抗体加入量及其储存过程中稳定性值得深入探讨。也有可能是抗c-ast抗体特异性较差，抗体和c-ast结合后并未完全覆盖c-ast的活性中心，导致c-ast不能完全被抑制，m-ast测定结果偏高。技术实现要素：本发明的目的是为了解决上述问题而提供。本发明通过以下技术方案实现：原理:免疫抑制法为单克隆抗c-ast+c-ast-ag→c-ast-ag-ab(c-ast失去活性),再用速率法检测m-ast。l-天冬氨酸+α-酮戊二酸m-ast草酰乙酸+l-谷氨酸，草酰乙酸+nadh+h+mdhl-苹果酸+nad+以nadh在340nm波长的吸光度(a)的减少来计算m-ast活力。计算公式:m-ast(u/l)=δa/min×f。本发明所采用的方法为将通常的m-ast检测试剂盒中的试剂2换成了包含两种分别针对两个抗原决定簇c-ast特异性单抗，并以之作为血清中c-ast的特异性结合屏蔽剂。这种做法能够以较小的浓度起到封闭c-ast活性的作用，比通常使用多克隆抗体效率更高，多克隆抗体由于针对多个抗原决定簇的多种抗体混合而成，封闭时特异性不高，对抗体的浓度要求很高，如果遇到该批次的多克隆抗体针对特异性位点的浓度不够高，会造成封闭不够，引起测量时的误差，而采用单克隆抗体会根据实际的酶浓度范围进行评估，按照最大需求量进行c-ast活性的封闭，而且都是特异性的高效针对酶活性位点，效率进一步提高。使用针对c-ast蛋白的两个抗原决定簇的特异性单抗作为该蛋白活性的屏蔽剂，用于制备m-ast检测试剂盒，所采用的两个抗原决定簇分别为针对c-ast蛋白序列的两个抗原决定簇，分别是nheylpilglaefrscasrlal和kqiasvmkhrflfpffdsayqg两个片段，这两个片段制备出来的单克隆抗体，特异性非常高，在使用时可以以比较小的浓度就能得到高效屏蔽c-ast酶活性的作用，在测定血清中m-ast活性的时候能够起到单独检测血清中m-ast的活性的作用。有益效果能够控制抗体的使用量，起到节约成本和提高试剂盒的测值准确性的作用。具体实施方式下面结合实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。实施例1.本发明制备的检测试剂盒试剂1包括以下组分：tris缓冲液50mmol/l；l-天门冬氨酸15mmol/l；乳酸脱氢酶0.5mmol/l；羊抗人c-ast抗体1＞1ku/l；羊抗人c-ast抗体2＞1ku/l；苹果酸脱氢酶＞0.8ku/l；试剂2包括以下组分：α-酮戊二酸130mmol/l；nadh130mmol/l。其中羊抗人c-ast抗体1的结合抗原决定簇为nheylpilglaefrscasrlal；羊抗人c-ast抗体2的结合抗原决定簇为kqiasvmkhrflfpffdsayqg；实施例2.使用多克隆抗体制备的试剂盒试剂1包括以下组分：tris缓冲液50mmol/l；l-天门冬氨酸15mmol/l；乳酸脱氢酶0.5mmol/l；多克隆羊抗人m-ast抗体＞1ku/l；苹果酸脱氢酶＞0.8ku/l；试剂2包括以下组分：α-酮戊二酸130mmol/l；nadh130mmol/l。实施例3.使用其他位点制备的单克隆抗体作为屏蔽剂。试剂1包括以下组分：tris缓冲液50mmol/l；l-天门冬氨酸15mmol/l；乳酸脱氢酶0.5mmol/l；羊抗人c-ast抗体1＞1ku/l；羊抗人c-ast抗体2＞1ku/l；苹果酸脱氢酶＞0.8ku/l；试剂2包括以下组分：α-酮戊二酸130mmol/l；nadh130mmol/l。其中羊抗人c-ast抗体1的结合抗原决定簇为lrarlea；羊抗人c-ast抗体2的结合抗原决定簇为wairyfvse；实施例4.采用单克隆抗体的稳定剂制备的试剂盒。试剂1包括以下组分：tris缓冲液50mmol/l；l-天门冬氨酸15mmol/l；乳酸脱氢酶0.5mmol/l；羊抗人asts抗体＞1ku/l；苹果酸脱氢酶＞0.8ku/l；试剂2包括以下组分：α-酮戊二酸130mmol/l；nadh130mmol/l；添加了稳定剂甘露糖的在试剂中的浓度为0.1g/l,甘油在试剂中浓度为0.05g/l。实验例1.批间精密度：取一种浓度为15u/l血清标本，按批内精密度要求对上述4个实施例制备的试剂盒进行测试,结果显示批内cv结果如下表。实施例1234cv值3.06%5.78%6.69%3.06%cv值（30天后）4.11%7.23%8.41%3.12%实验例2.分析灵敏度：根据检测结果当被测物浓度为20u/l时，4种制备的试剂盒吸光度变化值都在0.008-0.050之间。符合国家标准。序列表<110>武汉生之源生物科技股份有限公司<120>一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒及应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>2<211>22<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>2asnhisglutyrleuproileleuglyleualaglupheargsercys151015alaserargleualaleu20<210>3<211>22<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>3lysglnilealaservalmetlyshisargpheleupheprophephe151015aspseralatyrglngly20当前第1页12