一种桉油或桉油精中杂质的检测方法与流程

本发明涉及一种挥发性物质中杂质的检测方法，具体是一种桉油或桉油精中杂质的检测方法。

背景技术：

桉油为桃金娘科植物蓝桉(eucalyptusglobuluslabill)、樟科植物樟树(cinnamoumcamphora(l)sieb)、或上述两科同属其它植物经水蒸气蒸馏得到的挥发油。桉油中主要成分是桉油精，是一种单萜类化合物，在临床上具有抗菌消炎、平喘镇咳、祛痰等作用，也常用作香料和防腐剂。

gc-ms，即气相色谱-质谱联用仪，包括色谱单元、接口及质谱仪三部分，利用色谱仪将样品中各成分分离，通过接口将其送入质谱仪进行检测。

由于桉油或桉油精主要通过植物提取得到，受提取方法的影响，其中会含有多种杂质，为了保证桉油或桉油精的安全性及有效性，需要对其中含有的杂质进行鉴定及含量测定。此外由于杂质种类较多且多为天然挥发油，杂质对照品相对较难获得，利用常规的外标法进行杂质含量测定较为困难，因此有必要开发简单易行的杂质定量测定方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种桉油或桉油精中杂质的检测方法。该方法准确、快速、灵敏度高、重现性好，能够有效检出桉油或桉油精中含量高于0.01％的杂质并测定含量高于0.1％的杂质，从而确保其安全性及有效性。

本发明涉及一种桉油或桉油精中杂质的检测方法，包括如下步骤：

(1)桉油或桉油精供试品溶液的配制

取桉油或桉油精适量，溶解于溶剂中配制成供试品溶液；

(2)通过对桉油或桉油精供试品溶液进行gc-ms检测，对桉油或桉油精中的杂质进行结构鉴定

将桉油或桉油精供试品溶液利用gc-ms进行检测，采集质谱总离子流图，对检出的杂质进行结构鉴定；和/或

(3)通过对桉油或桉油精供试品溶液进行gc-fid检测，对桉油或桉油精中的杂质进行定量

取柠檬烯适量，溶解于溶剂中配制成柠檬烯对照品溶液；

将桉油或桉油精供试品溶液利用gc-fid进行检测，以柠檬烯为内参，测定杂质和柠檬烯的响应值，根据如下公式计算杂质含量：

cx＝f×ax×cs/as

其中，cx为供试品溶液中杂质浓度，f为相对校正因子，ax为供试品溶液中杂质响应值，cs为柠檬烯对照品溶液中柠檬烯浓度，as为柠檬烯对照品溶液中柠檬烯响应值。

本领域技术人员可以理解，本领域常用的各种溶剂都能用来配制桉油或桉油精供试品溶液、柠檬烯对照品溶液，优选乙酸乙酯。优选地，桉油或桉油精供试品溶液的浓度为0.5-5mg/ml，进一步优选0.8-1.5mg/ml，最优选约1mg/ml。优选地，柠檬烯对照品溶液的浓度为0.005-0.05mg/ml，进一步优选0.008-0.015mg/ml，最优选约0.01mg/ml。

本领域技术人员可以理解，步骤(2)和步骤(3)中，色谱条件根据所要确定含量的杂质来选择，只要能够将所要确定含量的杂质与桉油或桉油精中含有的其他物质分离开。一般来说，gc-ms选用he作为载气，gc-fid选用n2作为载气。在一个优选的技术方案中：气相色谱柱为以(95％-苯基)-甲基聚硅氧烷(tg-5ms或极性相似)为固定液的毛细管柱，如thermoscientifictg-5ms、agilenthp-5ms，柱长至少为30m，优选thermoscientifictg-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为he或n2(gc-ms选用he作为载气，gc-fid选用n2作为载气)，流速为1ml/min，进样体积为1μl，分流比为10:1，进样口温度为250℃-350℃，优选250℃，气相色谱柱在进样后0-3min保持初始温度60℃不变，3-21min以5℃/min的升温速率升温至150℃，21-24min保持150℃不变；质谱离子传输线温度为250℃，离子源温度为200℃，扫描范围为50-300。本发明发现，在上述色谱条件下，北京九和药业有限公司不同时期生产的多个批号的桉油精中的杂质都能实现良好分离。

本发明对桉油和桉油精中所含有的杂质进行了结构鉴定，在上述色谱条件下，步骤(2)中，杂质鉴定结果及其相对于桉油精的相对保留时间如下表1所示：

表1

在上表中，各杂质按照序号顺序依次被分离。其中由于相对保留时间仅保留小数点后两位，序号为3和4的杂质相对保留时间都是0.87。若保留小数点后三位，序号为3的杂质的相对保留时间为0.866，序号为4的杂质的相对保留时间为0.873。在上述杂质中，序号为4、6、11、13、14、16、17和19的杂质首次被发现存在于桉油或桉油精中。

在一个优选的实施方案中，根据所检出杂质相对于桉油精的相对保留时间确定结构。

根据本发明，在一个实施方案中，相对校正因子f通过如下步骤确定：

(1)取柠檬烯对照品和杂质对照品适量，分别溶解于溶剂中，配制成一系列线性溶液，例如5-10个浓度梯度；

(2)将柠檬烯对照品线性溶液和杂质对照品线性溶液分别利用gc-fid进行检测，测定响应值，根据如下公式计算各浓度水平下的相对校正因子f：

f＝(as/cs)/(ax/cx)

其中，f为一个浓度水平下的相对校正因子，as为柠檬烯对照品溶液中柠檬烯响应值，cs为柠檬烯对照品溶液中柠檬烯浓度，ax为杂质对照品溶液中杂质响应值，cx为杂质对照品溶液中杂质浓度；以各个浓度水平下的相对校正因子f的平均值为杂质相对于柠檬烯的相对校正因子f，要求rsd小于5％。

本领域技术人员可以理解，本领域常用的各种溶剂都能用来配制柠檬烯对照品和杂质对照品溶液，优选乙酸乙酯。本领域技术人员可以理解，根据桉油或桉油精中杂质的含量设置一系列浓度的线性溶液，一般来说，最低的浓度需高于定量限，各浓度的设置只要满足线性方程回归系数r＞0.999即可。优选地，配制7个浓度梯度，例如0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.02mg/ml和0.01mg/ml、0.005mg/ml、0.002mg/ml、0.001mg/ml。

本发明，对桉油和桉油精中所含有的主要杂质的含量进行了定量，在上述色谱条件下，步骤(3)中，以柠檬烯为内参，桉油或桉油精中主要杂质相对于柠檬烯的相对保留时间和相对校正因子f值如下表2所示：

表2

根据本发明，当桉油或桉油精中杂质含量高于0.01％(面积归一化法)时，s/n≥3，从而本发明桉油或桉油精中杂质的检出限为0.01％。当桉油或桉油精中杂质含量高于0.1％时，s/n≥10，从而本发明桉油或桉油精中杂质的定量限为0.1％。

本领域技术人员可以理解，在上述步骤(3)中，通过测定不同杂质对照品与内参柠檬烯之间的校正因子，在测定桉油或桉油精中柠檬烯内参的含量的同时实现其余杂质含量的测定。

本发明的有益效果是：

本发明的方法可以有效解决桉油或桉油精中杂质的检测、鉴定与含量测定问题。gc-ms检测桉油或桉油精中的杂质，灵敏度高，重现性好，能有效检出桉油或桉油精中含量超过0.01％(面积归一化法)的杂质，保证样品的安全性及有效性，并有助于研究人员有针对性地对桉油精生产工艺进行优化。本发明还对色谱条件进行了优化，在本发明的色谱条件下，桉油或桉油精中的杂质都能实现良好分离，还发现了多个从未被发现存在于桉油或桉油精中的杂质。特别是，本发明的方法仅用柠檬烯为内参，仅通过一次测量就能够确定桉油或桉油精中的多个杂质的含量，有效避免了桉油或桉油精中杂质种类多、对照品较难获得、杂质定量繁琐等问题。

附图说明

图1为批号为a20170904的桉油精供试品溶液gc-ms总离子流图谱

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

实施例1

1.1仪器与试药

thermoscientifictrace1310气相色谱仪；thermoscientifictriplusrsh自动进样器；thermoscientificisqlt质谱仪；mettlertoledonewclass十万分之一天平(瑞士mettler公司)；乙酸乙酯(纯度99.9％，北京百灵威科技有限公司，ls30s44)；桉油精(北京九和药业有限公司，批号分别为：y003170201，y003170202，y003170701，y003170702，a20170405，a20170904-1，a20170904-2，a20170905-1，a20170905-2，a20170906-1，a20170906-2，y2017022202；柠檬烯对照品(accustandard，17626-01)；α-蒎烯对照品(北京百灵威科技有限公司，l8c0r105)；β-月桂烯对照品(sigmaaldrich，bcbn4324v)；α-水芹烯对照品(sigmaaldrich，stbh0414)；β-蒎烯对照品(北京百灵威科技有限公司，lb80q61)；γ-松油烯对照品(北京百灵威科技有限公司，lg80q46)；对伞花烃对照品(北京百灵威科技有限公司，l630s36)。

1.2桉油精供试品溶液的配制

取批号分别为a20170904，a20170905，a20170906的桉油精各10mg置于10ml的量瓶中，加入乙酸乙酯直至刻度，摇匀，得浓度为1mg/ml的桉油精供试品溶液。

1.3对桉油精供试品溶液进行gc-ms检测

将桉油精供试品溶液利用gc-ms进行检测，其中：

气相色谱柱为以(95％-苯基)-甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱(thermoscientifictg-5ms，30m×0.25mm×0.25μm)，载气为he，流速为1ml/min，进样体积为1μl，分流比为10:1，进样口温度为250℃，气相色谱柱在进样后0-3min保持初始温度60℃不变，3-21min以5℃/min的升温速率升温至150℃，21-24min保持150℃不变；质谱离子传输线温度为250℃，离子源温度为200℃，扫描范围为50-300，采集质谱总离子流图，其中批号为a20170904的桉油精供试品溶液的质谱总离子流图见图1。

1.4对桉油精中的杂质进行结构鉴定

将总离子流图中的各峰与nist库进行匹配，并结合碎片峰及相关文献报道进行结构鉴定。结果如下表3所示。表中显示的杂质均s/n≥3。

表3批号为a20170904、a20170905、a20170906的桉油精杂质鉴定结果

1.5桉油或桉油精中主要杂质含量测定

1.5.1主要杂质相对于柠檬烯内参的校正因子f值的测定

准确称取柠檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-水芹烯、对伞花烃、γ-松油烯杂质对照品各约40mg分别置10ml量瓶中，乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀。精密量取上述杂质对照品储备溶液各1ml置同一20ml量瓶中，乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液各5ml、2.5ml、1ml、0.5ml、0.25ml、0.1ml、0.05ml分别置10ml量瓶中，乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，得各杂质线性溶液。色谱条件同1.3节，载气为n2，将上述溶液连进3针，测定峰面积，取平均值，得到各杂质峰面积与浓度之间的线性回归曲线。根据斜率比可以看出，各杂质在fid检测器上的响应相近。以各个浓度水平下的相对校正因子f值的平均值作为各杂质相对于柠檬烯的f值。

f＝(as/cs)/(ax/cx)

其中，f为一个浓度水平下的相对校正因子，as为柠檬烯对照品溶液中柠檬烯响应值，cs为柠檬烯对照品溶液中柠檬烯浓度，ax为杂质对照品溶液中杂质响应值，cx为杂质对照品溶液中杂质浓度。

表47个成分的回归方程、线性范围及回归系数(柠檬烯为内参，n＝3)

表5以柠檬烯为内参的杂质各浓度f值及各浓度f值平均值f值(n＝3)

1.5.2杂质含量测定

准确称取批号分别为y003170201，y003170202，y003170701，y003170702，a20170405，a20170904-1，a20170904-2，a20170905-1，a20170905-2，a20170906-1，a20170906-2，y2017022202的桉油精供试品各10mg分别置10ml量瓶中，乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。准确称取柠檬烯对照品10mg置10ml量瓶中，乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液1ml置100ml量瓶中，乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，作为柠檬烯对照品溶液。取供试品及对照品溶液各1μl，进样分析。色谱条件同1.3节，载气为n2，同时利用外标法及本发明方法计算杂质量。结果显示，所有批号的桉油精利用本发明方法与外标法测得的含量结果均无显著性差异，证明了本发明方法的准确性。1.5.3本发明方法耐用性考察

实验中考察了在不同型号的仪器、不同色谱柱、不同流速、不同程序升温初始温度、不同检测器温度、不同进样口温度下各杂质的f值变化，其他条件同1.3节，载气为n2。在不同色谱条件下，各杂质的f值rsd均小于5％，耐用性较好。

表6不同型号仪器及色谱柱上各杂质f值(柠檬烯为内参，n＝3)

表7流速对f值影响(柠檬烯为内参，n＝3)

表8程序升温初始温度对f值影响(柠檬烯为内参，n＝3)

表9检测器温度对f值影响(柠檬烯为内参，n＝3)

表10进样口温度对f值影响(柠檬烯为内参，n＝3)

1.5.4杂质定位

本发明方法杂质色谱峰可以采用保留时间差或者相对保留时间进行定位。本发明考察了在不同型号的仪器、不同色谱柱上各色谱峰的相对保留时间，其他条件同1.3节，载气为n2。结果显示，上述色谱条件下各杂质的相对保留时间rsd均小于2％，因此最终选择各杂质相对于柠檬烯的相对保留时间进行定位。

表11不同型号仪器及色谱柱上各杂质相对保留时间(柠檬烯为内参，n＝3)

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。