一种基于硫代胆碱共反应促进剂电致化学发光适配体传感器及测定毒死蜱的方法与流程

本发明涉及农残分析测定技术领域，特别是涉及一种基于硫代胆碱共反应促进剂电致化学发光适配体传感器及测定毒死蜱的方法，包括毒死蜱电致化学发光适配体传感器的制备步骤、使用该传感器测定毒死蜱的操作方法等。

背景技术：

毒死蜱是乙酰胆碱酯酶抑制剂，属硫代磷酸酯类杀虫剂。毒死蜱残留通过抑制体内神经中的乙酰胆碱酯酶ache或胆碱酯酶che的活性而破坏正常的神经冲动传导，引起一系列中毒症状，如：异常兴奋、痉挛、麻痹、甚至死亡。由于毒死蜱对人类具有高毒性，已引起了人们越来越广泛的关注。目前常用的毒死蜱检测方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法和气相色谱法。酶生物传感器是目前农药残留快速检测技术中的研究热点之一，迄今为止，已有胆碱酯酶、酪氨酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、过氧化物酶、有机磷水解酶和谷胱甘肽巯基转移酶等七种活性酶被用于制作酶生物传感器，进行农药残留快速检测。其中前五种酶制作的酶生物传感器是测量酶抑制作用，而后两种是酶制作的酶生物传感器，直接测量酶促反应中所涉及的化合物。由于许多农药对酶的活性都有一定的抑制作用，通过酶抑制作用而构建的酶生物传感器的选择性和灵敏度常常受到影响。

电致化学发光(ecl)分析技术兼具发光分析的高灵敏度和电化学分析的高可控性，尤其适用于浓度极低、成分复杂体系分析，已成为现代分析科学的前沿领域之一。在ecl体系中引入具有强电化学氧化还原活性的共反应剂构成经典的“发光试剂-共反应试剂”ecl二元体系是增加激发态物质产效，从而增强发光强度和稳定性最直接的方法。但是，ecl二元体系中发光物质的发光强度除了受制于自身量子产率，还受共反应剂反应活性的显著影响。在ecl二元体系的基础上引入“共反应促进剂”，使之与共反应剂相互作用以增加单位时间内电化学反应产生的共反应剂自由基，进而通过自由基之间的相互作用提高发光物质的发光强度，构建新型、高效的ecl三元体系引起了人们的关注。目前，量子点、luminol、多种有机染料均构建了高效的ecl三元体系。与本发明最为接近的是袁若报道的aunc-s2o8²⁻体系（analyticalandbioanalyticalchemistry，2019,411（4）：905–913），但其发光物质为金纳米团簇，测定的是氯化乙酰胆碱。cds/k2s2o8作为经典的ecl体系之一却未见其共反应促进剂的报道，也未见将硫代胆碱作为共反应促进剂而构建毒死蜱适配体传感器的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对上述传感器研究中的缺点，构建一种能够用于高灵敏检测农药残留毒死蜱的电致化学发光适配体传感器。本发明要解决的技术问题是将酶和适配体结合起来，利用酶解产生硫代胆碱作为共反应促进剂，提高cds/k2s2o8体系发光效率，克服酶传感器选择性差的缺陷，提高检测的选择性和灵敏度。本发明以aunps@cofe2o4mnps负载毒死蜱适配体和乙酰胆碱酯酶，cds@aunps@rgo/gce负载毒死蜱适配体的互补链。乙酰胆碱酯酶与底物氯化乙酰胆碱发生酶解反应产生硫代胆碱，硫代胆碱进而生成rs^•自由基，催化s2o8²⁻产生更多的so4^•－自由基，提高发光物质cds的发光强度。适配体的引入，提高了传感器的选择性，酶的引入产生cds/k2s2o8体系共反应促进剂。当毒死蜱存在时，负载于aunps@cofe2o4mnps毒死蜱适配体解螺旋，从而脱离电极，负载其上的乙酰胆碱酯酶随之脱落，引起酶生共反应促进剂硫代胆碱量降低，cds的发光强度减小，从而实现对毒死蜱的高灵敏、特异性检测。本发明也是一种“signal-off”型电化学适配体传感器，使用简便，稳定性、重现性好，无毒，不污染环境，为农残毒死蜱的检测提供了一种可行的新方法。

本发明的技术方案

1.一种基于硫代胆碱共反应促进剂电致化学发光适配体传感器及测定毒死蜱的方法，是以酶生硫代胆碱作为cds+k2s2o8体系的共反应促进剂；aunps@cofe2o4mnps负载毒死蜱适配体和乙酰胆碱酯酶，cds@aunps@rgo/gce负载毒死蜱适配体的互补链负载，实现对毒死蜱的高灵敏、特异性检测；

2.所述的cds@aunps@rgo/gce，制备步骤如下：

（1）石墨烯(rgo)的合成：先将120.0ml浓硫酸缓慢加入到6.8g高锰酸钾中并持续搅拌混匀；接着，分别将15.0ml磷酸和1.0g石墨粉加入上述混合溶液中；将上述混合溶液转移至250ml三口烧瓶中，在50℃水浴中持续搅拌12h，之后加入到140.0ml冰水中；逐滴加入30%h2o2，可看到混合物变为土黄色；待溶液冷却后超声1.5h；在6000rpm下，用二次水离心洗涤至中性，所得到的产物即为氧化石墨烯；

将制备好的氧化石墨烯稀释成0.5mg/ml，然后取20.0ml稀释好的上述溶液，放入三口烧瓶内，在搅拌下加入300.0μl氨水和20.0μl水合肼，快速搅拌10min以上，然后在60℃左右的水浴中，继续搅拌3.5h，形成类似黑色的悬浊物再去除水分，即得石墨烯rgo；

(2)aunps@rgo复合材料的制备：搅拌的条件下，将1.2ml、0.1mol/l硼氢化钠加入到40ml含0.25mmol/l柠檬酸钠·二水，0.25mmol/lhaucl4和1mg/mlrgo的混合溶液中，老化6h，得到aunps@rgo复合材料；

(3)cds@aunps@rgo复合材料的制备：首先，将aunps@rgo重新分散在30.0ml超纯水中；其次，将0.1861gcd(no3)2·4h2o溶解于aunps@rgo溶液中并在搅拌下加热到70°c；接着，将0.5960gna2s·9h2o溶解于30ml超纯水中并缓慢加入到上述混合溶液中，在70°c下持续搅拌3h；最后，离心洗涤上述未反应完全的反应物，并重新分散在超纯水中备用；

（4）取8.0μlcds@aunps@rgo分散液滴涂到处理好的玻碳电极表面，自然晾干，得cds@aunps@rgo/gce；

3.所述的aunps@cofe2o4mnps，其制备方法如下：

(1)cofe2o4mnps的制备：称取0.2gcucl2·2h2o和0.54gfecl3·6h2o溶于16.0ml乙二醇，加入磁子，剧烈搅拌10min，然后加入1.44g醋酸钠、1.2g尿素和0.4g聚乙二醇4000，剧烈搅拌混合物45min，然后密封在高压釜中；将高压釜加热至200℃并保持10h，然后冷却至室温，用超纯水离心洗涤并重新分散；

(2)aunps@cofe2o4mnps的制备：搅拌的条件下，将1.2ml、0.1mol/l硼氢化钠加入到40.0ml含0.25mmol/l柠檬酸钠·二水，0.25mmol/lhaucl4和0.5mg/mlcofe2o4mnps的混合溶液中，老化6h，利用磁铁分离、洗涤，得到aunps@cofe2o4mnps复合材料；

4.所述的一种基于硫代胆碱共反应促进剂电致化学发光适配体传感器的制备方法，其制备步骤如下：

（1）将8.0μl、10^-7mol/l毒死蜱互补链cdna滴涂到cds@aunps@rgo/gce表面，置于冰箱冷藏过夜，用ph7.4的pbs清洗。之后滴涂4.0μl、10μmol/l6-巯基己醇，在37°c下孵化60min，再用ph7.4的pbs缓冲液冲洗，得cdna/cds@aunps@rgo/gce；

（2）将200.0µl、250µg/ml乙酰胆碱酯酶、100.0µl、1.0µmol/l毒死蜱适配体apt加入到300.0µlaunps@cofe2o4mnps混合溶液中孵化过夜，离心洗涤，得apt/ache-aunps@cofe2o4，分散到1.0mltris-hcl中存储备用；

（3）将8.0μlapt/ache-aunps@cofe2o4滴涂到cdna/cds@aunps@rgo/gce表面，在37°c下孵化60min再用ph7.4的pbs缓冲液冲洗，置于4°c存储备用；

5.农残毒死蜱的检测步骤如下：

（1）将不同浓度的毒死蜱滴涂于上述构建的适配体传感器的表面，在37°c下孵化60min，再用ph7.4的pbs缓冲液冲洗；

（2）在含有0.4mol/l氯化乙酰胆碱和0.1mol/lk2s2o8的ph7.4pbs缓冲溶液中，以制备的适配体传感器为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在-1.5~0.0v电位区间内进行循环伏安扫描，光电倍增管800v，记录得到的光强结果；

（3）检测一系列不同浓度毒死蜱标准溶液孵化后的光强，绘制工作曲线；同时测定传感器线性范围和检测限；

(4)将待测样品溶液代替毒死蜱标准溶液，按步骤（1）、（2）方法记录光强，根据线性方程计算待测样品中毒死蜱含量。

本发明的有益效果

(1)首次以酶生硫代胆碱作为cds+k2s2o8体系的共反应促进剂，显著提高了cds发光强度；

(2)结合适配体，克服了单纯酶抑制生物传感器抗干扰能力较差的缺陷，提高了毒死蜱检测的选择性；

(3)磁性cofe2o4mnps具有较好的生物活性，既可以负载更多酶和适配体，又利于保持酶的生物活性；同时利用磁铁，简化了制备过程中固液分离过程；

(4)本发明传感器具有检测速度快，灵敏度高，选择性好特点；可以实现对毒死蜱的简单、快速、高灵敏检测；线性范围为1.0×10^-6~1.0×10^-12mg/l，检出限为6.0×10^-13mg/l。

附图说明：

图1为不同修饰电极的电位-光强图

其中，1--裸gce，2--cds@aunps@rgo/gce，

3--cdna/cds@aunps@rgo/gce，4--mch/cdna/cds@aunps@rgo/gce，

5--apt/ache-aunps@cofe2o4/mch/cdna/cds@aunps@rgo/gce，

6--毒死蜱/apt/ache-aunps@cofe2o4/mch/cdna/cds@aunps@rgo/gce；

图2为不同浓度毒死蜱的电致化学发光强度（a）及线性拟合图（b）

其中，1-8分别代表毒死蜱的浓度为：0，10^-12，10^-11，10^-10，10^-9，10^-8，10^-7，10^-6mg/l。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例1cds@aunps@rgo/gce的制备：

（1）石墨烯(rgo)的合成：先将120.0ml浓硫酸缓慢加入到6.8g高锰酸钾中并持续搅拌混匀；接着，分别将15.0ml磷酸和1.0g石墨粉加入上述混合溶液中；将上述混合溶液转移至250ml三口烧瓶中，在50℃水浴中持续搅拌12h，之后加入到140.0ml冰水中；逐滴加入30%h2o2，可看到混合物变为土黄色；待溶液冷却后超声1.5h；在6000rpm下，用二次水离心洗涤至中性，所得到的产物即为氧化石墨烯；

将制备好的氧化石墨烯稀释成0.5mg/ml，然后取20.0ml稀释好的上述溶液，放入三口烧瓶内，在搅拌下加入300.0μl氨水和20.0μl水合肼，快速搅拌10min以上，然后在60℃左右的水浴中，继续搅拌3.5h，形成类似黑色的悬浊物再去除水分，即得石墨烯rgo；

(2)aunps@rgo复合材料的制备：搅拌的条件下，将1.2ml、0.1mol/l硼氢化钠加入到40ml含0.25mmol/l柠檬酸钠·二水，0.25mmol/lhaucl4和1mg/mlrgo的混合溶液中，老化6h，得到aunps@rgo复合材料；

(3)cds@aunps@rgo复合材料的制备：首先，将aunps@rgo重新分散在30.0ml超纯水中；其次，将cd(no3)2·4h2o(0.1861g)溶解于aunps@rgo溶液中并在搅拌下加热到70°c；接着，将na2s·9h2o(0.5960g)溶解于30ml超纯水中并缓慢加入到上述混合溶液中，在70°c下持续搅拌3h；最后，离心洗涤上述未反应完全的反应物，并重新分散在超纯水中备用；

（4）取8.0μlcds@aunps@rgo分散液滴涂到处理好的玻碳电极表面，自然晾干，得cds@aunps@rgo/gce，备用。

实施例2aunps@cofe2o4mnps的制备方法：

(1)cofe2o4mnps的制备：称取0.2gcucl2·2h2o和0.54gfecl3·6h2o溶于16.0ml乙二醇，加入磁子，剧烈搅拌10min，然后加入1.44g醋酸钠、1.2g尿素和0.4g聚乙二醇4000，剧烈搅拌混合物45min，然后密封在高压釜中；将高压釜加热至200℃并保持10h，然后冷却至室温，用超纯水离心洗涤并重新分散；

(2)aunps@cofe2o4mnps的制备：搅拌的条件下，将1.2ml、0.1mol/l硼氢化钠加入到40.0ml含0.25mmol/l柠檬酸钠·二水，0.25mmol/lhaucl4和0.5mg/mlcofe2o4mnps的混合溶液中，老化6h，利用磁铁分离、洗涤，得到aunps@cofe2o4mnps复合材料。

实施例3基于硫代胆碱共反应促进剂电致化学发光适配体传感器的制备：

（1）将8.0μl、10^-7mol/l毒死蜱互补链cdna滴涂到cds@aunps@rgo/gce表面，置于冰箱冷藏过夜，用ph7.4的pbs清洗。之后滴涂4.0μl、10μmol/l6-巯基己醇，在37°c下孵化60min，再用ph7.4的pbs缓冲液冲洗，得cdna/cds@aunps@rgo/gce；

（2）将200.0µl、250µg/ml乙酰胆碱酯酶、100.0µl、1.0µmol/l毒死蜱适配体apt加入到300.0µlaunps@cofe2o4mnps混合溶液中孵化过夜，离心洗涤，得apt/ache-aunps@cofe2o4，分散到1.0mltris-hcl中存储备用；

（3）将8.0μlapt/ache-aunps@cofe2o4滴涂到cdna/cds@aunps@rgo/gce表面，在37°c下孵化60min再用ph7.4的pbs缓冲液冲洗，置于4°c存储备用。

实施例4农残毒死蜱的检测：

（1）将不同浓度的毒死蜱滴涂于上述构建的适配体传感器的表面，在37°c下孵化60min，再用ph7.4的pbs缓冲液冲洗；

（2）在含有0.4mol/l氯化乙酰胆碱和0.1mol/lk2s2o8的ph7.4pbs缓冲溶液中，以制备的适配体传感器为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，通过mpi-b型多参数化学发光分析测试系统，在-1.5~0.0v电位区间内进行循环伏安扫描，光电倍增管800v，记录得到的光强结果；

（3）检测一系列不同浓度毒死蜱标准溶液孵化后的光强，绘制工作曲线；同时测定传感器线性范围和检测限；结果如图2所示，电致化学发光强度随毒死蜱浓度增加而降低，与其浓度对数呈负相关，线性方程为i=978.3-1254lgc，相关系数r=0.9941，线性范围为1.0×10^-6~1.0×10^-12mg/l，检出限为6.0×10^-13mg/l；

(4)将待测样品溶液代替毒死蜱标准溶液，按步骤（1）、（2）方法记录光强，根据线性方程计算待测样品中毒死蜱含量。

实施例5实验条件的优化

实验了过硫酸钾的浓度、检测底液的ph及氯化乙酰胆碱的浓度对发光强度的影响；当过硫酸钾浓度为0.10mol/l时，反应达到饱和；当ph低于7.4时，电致化学发光强度随着ph的增大而增大；当ph高于7.4时，电致化学发光强度随着ph的增大而减小；底液中氯化乙酰胆碱的浓度是影响酶解反应的一个重要条件，当其浓度低于0.4mol/l时，光强随浓度升高而升高；大于0.4mol/l后，光强不再变化。最优条件为：0.10mol/l过硫酸钾，ph7.4，0.4mol/l氯化乙酰胆碱。

实施例6不同修饰电极发光性能对比

按照实施例3传感器层层组装制备方法，制备各修饰电极，在含有0.4mol/l氯化乙酰胆碱和0.1mol/lk2s2o8的ph7.4pbs缓冲溶液中，测定了各电极发光强度，如图1所示。结果表明，含有乙酰胆碱酯酶的修饰电极apt/ache-aunps@cofe2o4/mch/cdna/cds@aunps@rgo/gce发光强度显著提高（图1，曲线5），这是因为酶解产生了硫代胆碱共反应促进剂，提高了cds发光效率；当0.1ng/l毒死蜱滴涂到电极表面后，一部分酶脱落，酶生硫代胆碱量减少，随之发光强度降低（图1，曲线6）。

实施例7毒死蜱电致化学发光传感器的重现性、选择性和稳定性

将0.1ng/l毒死蜱滴涂于上述制备的传感器表面，连续扫描12圈，得到的相对标准偏差(rsd)为4.9%；做了多菌灵、啶虫脒、氯氰菊酯、涕灭威和甲胺磷的干扰性测试，测量了0.1ng/l的毒死蜱和10.0ng/l各种干扰物质混合溶液相对于未滴涂农药时电极的电致化学发光强度，实验表明，只含有毒死蜱的电极才产生发光光强的显著降低。对毒死蜱浓度为0.1ng/l的十根修饰电极做了平行实验。记录了十次平行试验结果，计算rsd为7.2%；上述结果表明该传感器具有较好的稳定性、选择性和重现性。