一种测定叶绿素铁钠盐的方法与流程

本发明属于分析化学领域，更具体地，涉及一种测定叶绿素铁钠盐的方法。

背景技术：

叶绿素铁钠盐是一种叶绿素的衍生物混合物，从天然蚕沙等物质中经过皂化、酸化、铁代、成盐步骤得到墨绿色固体或晶体。用于治疗缺铁性贫血和食品添加剂。目前叶绿素铁钠盐检测方法有分光光度法、荧光光度法、高效液相色谱法、核磁共振等方法。分光光度法和荧光光度法中由于叶绿素铁钠盐中的混合叶绿素和其他衍生物在相同的光谱区域具有相同的吸收峰，干扰叶绿素铁钠盐的准确定量，方法准确度和检测限较低的。核磁共振法由于仪器昂贵，普及率不高。本发明通过提供一种高效液相色谱法准确定量检测方法，弥补叶绿素铁钠盐的检测手段的不足，能够取得较好的分离效果，提高方法准确度和精确度。建立叶绿素铁钠盐的高效液相色谱的测定方法，为相关研究领域的测定方法提供分析检测方法。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种测定叶绿素铁钠盐的方法，其中通过对测定方法整体流程工艺设计等进行改进，先确定出紫外检测最大吸收波长，在此基础上再得到液相色谱图，并通过液相色谱、质谱联用确认叶绿素铁钠盐色谱峰的位置，通过已知浓度的、浓度呈梯度分布的标准品构建峰面积随叶绿素铁钠盐浓度的标准变化关系，根据待测样品的峰面积，求解测定得出待测样品所含叶绿素铁钠盐的浓度，可有效解决叶绿素铁钠盐定量测定的技术问题。本发明还进一步对色谱检测所采用的参数设置进行优选控制，使叶绿素铁钠盐与其他叶绿素衍生物较好的分离，从而能够避免其他叶绿素衍生物的干扰，进一步提高该测定方法的准确度和精确度。

为实现上述目的，按照本发明，提供了一种测定叶绿素铁钠盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)标准曲线方程的建立：

对于多个浓度已知、且彼此之间浓度存在差异的叶绿素铁钠盐溶液标准品，首先以其中任意一个叶绿素铁钠盐溶液标准品作为对象，在紫外分光光度计下进行230-900nm的全波长扫描，确定最大吸收波长；接着，将所述最大吸收波长作为液相色谱仪中紫外检测波长，利用该液相色谱仪以全部叶绿素铁钠盐溶液标准品分别作为对象进行检测，得到各个已知浓度的叶绿素铁钠盐溶液标准品它们所对应的液相色谱图；然后，通过质谱检测确认其中任意一个液相色谱图中叶绿素铁钠盐的出峰位置；再对于任意一个液相色谱图，在叶绿素铁钠盐出峰位置进行积分，得到与该液相色谱图对应的叶绿素铁钠盐的峰面积，如此针对全部液相色谱图，即可得到峰面积随叶绿素铁钠盐浓度的标准变化关系，即，峰面积-叶绿素铁钠盐浓度的标准曲线方程；

(2)对待测样品的浓度测定：

以待测叶绿素铁钠盐浓度的待测样品为对象，利用所述液相色谱仪进行检测，得到该待测样品的液相色谱图；接着，对该待测样品的液相色谱图，在叶绿素铁钠盐出峰位置进行积分，得到叶绿素铁钠盐的峰面积；然后，将该峰面积带入所述步骤(1)得到的峰面积-叶绿素铁钠盐浓度的标准曲线方程中，计算得到相应的叶绿素铁钠盐浓度值，该叶绿素铁钠盐浓度值也即所述待测样品的叶绿素铁钠盐浓度值，由此实现叶绿素铁钠盐的浓度测定；

并且，所述步骤(1)中所述液相色谱仪与所述步骤(2)中所述液相色谱仪的参数设置完全保持一致。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，所述液相色谱仪的参数设置同时包括进样量、检测器、柱温箱温度、色谱柱选择、流动相及流动相流速的设置；

优选的，进样量设置为10ul，检测器设置为紫外检测器，柱温箱温度设置为30℃，色谱柱选为poroshell120ec-c184μm，流速设置为1.0ml/min；

所述流动相包括配合使用的流动相a和流动相b，其中，所述流动相a是由甲醇、水及乙酸按70：20：10的体积比配比混合而成，所述流动相b是由甲醇、丙酮、水及乙酸按60：25：5：10的体积比配比混合而成；相应梯度洗脱程序为：第0min时，流动相a占比100％、流动相b占比0％；第5min时，流动相a占比0％、流动相b占比100％；第25min时，流动相a占比100％、流动相b占比0％；进样间隔平衡时间为5min；

或者，所述流动相a是由甲醇、水及乙酸按60：30：10的体积比配比混合而成，所述流动相b是由甲醇、乙腈、水及乙酸按50：25：15：10的体积比配比混合而成；相应梯度洗脱程序为：第0min时，流动相a占比100％、流动相b占比0％；第15min时，流动相a占比0％、流动相b占比100％；第25min时，流动相a占比100％、流动相b占比0％；进样间隔平衡时间为5min；

并且，所述流动相所采用的试剂均为色谱纯，所述乙酸是质量分数为0.2％的乙酸溶液，水为超纯水。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，所述通过质谱检测确认其中任意一个液相色谱图中叶绿素铁钠盐的出峰位置，具体是先设置质谱检测参数，运行仪器得到叶绿素铁钠盐溶液的质谱图，通过质谱库确认叶绿素铁钠盐的位置，同时分析目标峰的纯度。

作为本发明的进一步优选，所述质谱检测参数如下：质谱操作条件esi离子源，分子量扫描范围650-750。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，所述待测叶绿素铁钠盐浓度的待测样品为固体样品、液体样品或悬浊液样品；

当所述待测样品为固体样品或悬浊液样品时，所述待测样品还经过了预处理工艺；当所述待测样品为固体样品时，所述预处理工艺具体为先将固体样品溶解于水中，再通过离心和过滤，最后取滤液放置于不透光的试剂瓶中保存在4℃的条件下于30天内作为待测样品进行检测；当所述待测样品为悬浊液样品时，所述预处理工艺具体包括离心和过滤，最后取滤液放置于不透光的试剂瓶中保存在4℃的条件下于30天内作为待测样品进行检测；

优选的，当所述待测样品中目标物质含量低于5mg/l时，在离心处理前，需先通过萃取进行浓缩处理。

作为本发明的进一步优选，所述过滤是采用微孔过滤膜抽滤或微孔过滤头，过滤膜具体是孔径为0.22μm的滤膜，滤膜材质为聚醚砜(pes)、聚四氟乙烯(ptfe)或聚偏氟乙烯(pvdf)；

所述不透光的试剂瓶优选为棕色液相瓶。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，所述多个浓度已知、且彼此之间浓度存在差异的叶绿素铁钠盐溶液标准品，具体是配置浓度为5mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l标准溶液。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，所述峰面积随叶绿素铁钠盐浓度的标准变化关系，具体是建立以峰面积为纵坐标、叶绿素铁钠盐浓度为横坐标的坐标系，然后针对全部液相色谱图，在该坐标系中标出对应的点，接着再拟合出标准曲线图，即可得到峰面积-叶绿素铁钠盐浓度的标准曲线方程。

作为本发明的进一步优选，所述拟合为线性拟合。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，所述待测样品的体积不少于0.2ml。

通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，先基于浓度已知的叶绿素铁钠盐溶液标准品，确定紫外检测最大吸收波长，配合液相色谱仪得到液相色谱图，再利用色谱、质谱联用确定出液相色谱图中叶绿素铁钠盐的出峰位置(以及峰的纯度)，通过计算各个浓度已知叶绿素铁钠盐溶液液相色谱图中叶绿素铁钠盐的峰面积，得到峰面积随叶绿素铁钠盐浓度的标准变化关系；再基于待测样品的液相色谱图，将相应叶绿素铁钠盐的峰面积代入标准变化关系中即可得到未知样品中叶绿素铁钠盐的浓度。

本发明还通过对液相色谱仪的参数，尤其是流动相的配比和梯度洗脱程序，进行优选控制，配合色谱柱，能够有效克服叶绿素铁钠盐中几种主要成分结构相似、分子量相近造成液相色谱仪单一流动相无法进行分离的缺陷。本发明优选将流动相a和流动相b配合使用作为流动相，可将流动相a控制为由甲醇、水及乙酸按70：20：10的体积比配比混合而成，流动相b控制为由甲醇、丙酮、水及乙酸按60：25：5：10的体积比配比混合而成，相应梯度洗脱程序为：第0min时，流动相a占比100％、流动相b占比0％，第5min时，流动相a占比0％、流动相b占比100％，第25min时，流动相a占比100％、流动相b占比0％；或者，流动相a控制为由甲醇、水及乙酸按60：30：10的体积比配比混合而成，流动相b是由甲醇、乙腈、水及乙酸按50：25：15：10的体积比配比混合而成，相应梯度洗脱程序为：第0min时，流动相a占比100％、流动相b占比0％，第15min时，流动相a占比0％、流动相b占比100％，第25min时，流动相a占比100％、流动相b占比0％，进样间隔平衡时间为5min，实现了分离效果较好的梯度洗脱程序，使叶绿素铁钠盐与其他叶绿素衍生物较好的分离，从而能够避免其他叶绿素衍生物的干扰，提高测定方法的准确度和精确度。本发明通过合适的流动相和仪器参数使叶绿素铁钠盐尽可能的与其他衍生物分离开，在不同的时间出峰。另外，本发明可通过进一步分析目标峰的纯度，能够分析出叶绿素铁钠盐，让叶绿素铁钠盐与其他衍生物分离开，实现精确的定量分析。

本发明中标准品的浓度可优选配置范围在5mg/l到1000mg/l，浓度太低了，仪器检测数来的峰会很小，甚至没有，浓度太高又容易损害液相柱。本发明检测叶绿素铁钠盐的检测范围为0.1-25mg/l，叶绿素铁钠盐衍生物检测范围为5-1000mg/l，加标回收率的相对标准偏差(rsd)为98.23％-101.45％，能够取得检测准确度和精密度均提高的有益效果。

本发明方法适用于各种待测样品，例如可以是来自于环境领域污水、污泥等含有叶绿素铁钠盐的待测物，化学和生物领域的化学合成过程中涉及的叶绿素铁钠盐的含量的定量测定过程的样品，尤其适用于叶绿素铁钠盐水溶液的测定。

附图说明

图1是流动相为丙酮时0.005％叶绿素铁钠盐分离液相色谱图。

图2是流动相为丙酮时叶绿素铁钠盐的标准曲线(浓度范围1-20mg/l)。

图3是流动相为乙腈时0.01％叶绿素铁钠盐分离液相色谱图。

图4是流动相为乙腈时叶绿素铁钠盐的标准曲线(浓度范围1-20mg/l)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明规定了高效液相色谱法测定叶绿素铁钠盐的适用范围、样品采集和保存、试剂和材料、仪器设备、分析步骤、计算结果。

本发明测定叶绿素铁钠盐的方法，总体来说，主要包括样品预处理、确定紫外检测最大吸收波长、液相色谱仪检测、液相色谱质谱联用确认峰位置、作标准曲线、样品测定及计算过程。具体的，该方法包括以下几个步骤：

(ⅰ)样品预处理：萃取、离心、过滤后保存在棕色或者不透光的试剂瓶中。

(ⅱ)确定紫外检测最大吸收波长：配置一定浓度的叶绿素铁钠盐溶液，在紫外分光光度计下进行全波长扫描，确定最大吸收波长。

(ⅲ)液相色谱仪检测：仪器参数设置包括进样量、检测器、柱温箱温度、色谱柱选择、流动相的设置。将步骤(ⅱ)中得到的最大紫外检测吸收波长设置为液相色谱仪中紫外检测波长。得到叶绿素铁钠盐溶液的液相色谱图。

(ⅳ)液相色谱质谱联用确认峰位置：将步骤(ⅲ)中得到的色谱图进一步进行质谱分析。设置质谱参数，运行仪器得到叶绿素铁钠盐溶液的质谱图，通过质谱图结果分析(如可通过离子流谱上的核质比来分析确定)确认叶绿素铁钠盐的位置，同时分析目标峰的纯度。

(ⅴ)作标准曲线：配置系列梯度的叶绿素铁钠盐溶液，按照步骤(ⅲ)参数进行检测，得到色谱图，以峰面积为纵坐标，叶绿素铁钠盐浓度为横坐标，作出标准曲线图，得到标准曲线方程。

(ⅵ)样品测定及计算过程：经过步骤(ⅱ)预处理后的样品放置，棕色液相瓶中，设置液相色谱仪参数，得到色谱图，在叶绿素铁钠盐出峰位置进行积分，得到叶绿素铁钠盐的峰面积，代入标准曲线方程中得到未知样品中叶绿素铁钠盐的浓度。

以下为具体实施例：

实施例1：

(ⅰ)确定紫外检测最大吸收波长：购买叶绿素铁钠盐试剂，配置0.005％叶绿素铁钠盐溶液，称取叶绿素铁钠盐固体5mg，溶解于100ml超纯水中，过0.22μm聚偏氟乙烯(pvdf)滤膜，将叶绿素铁钠盐溶液保存在棕色试剂瓶中(叶绿素铁钠盐是一种水溶性的物质)。在岛津紫外分光光度计下240-900nm以步长为1nm进行扫描，确定最大吸收波长为392nm。

(ⅱ)液相色谱仪检测：将步骤(ⅰ)中配置的0.005％叶绿素铁钠盐溶液在进样量为10ul，紫外检测器波长392nm，柱温箱温度设置为30℃，色谱柱为poroshell120ec-c184μm，流速为1.0ml/min，流动相：a：甲醇：水：乙酸＝70：20：10，b：甲醇：丙酮：水：乙酸＝60：25：5：10，梯度洗脱程序为0min，a％＝100％、b％＝0％；5min，a％＝0％、b％＝100％；25min，a％＝100％、b％＝0％，进样间隔平衡时间为5min的条件下进行检测，得到叶绿素铁钠盐溶液的色谱图(见图1)。

(ⅲ)液相色谱质谱联用确认峰位置：将步骤(ⅱ)中得到的色谱图进一步进行质谱分析，利用液相检测的参数等到质谱图，通过质谱库确认叶绿素铁钠盐的位置，同时分析目标峰的纯度。质谱操作条件esi离子源，分子量扫描范围500-750。

(ⅳ)作标准曲线：配置浓度为1、2、4、5、10、20mg/l的叶绿素铁钠盐溶液，按照步骤(ⅱ)参数进行检测，得到色谱图，以峰面积为纵坐标，叶绿素铁钠盐浓度为横坐标，作出标准曲线图，得到标准曲线方程(见图2)。

实施例2：

(ⅰ)确定紫外检测最大吸收波长：购买叶绿素铁钠盐试剂，配置0.01％叶绿素铁钠盐溶液，称取叶绿素铁钠盐固体10mg，溶解于100ml超纯水中，过0.22μm聚偏氟乙烯(pvdf)滤膜，将叶绿素铁钠盐溶液保存在棕色试剂瓶中。在美普达紫外分光光度计下220-900nm以步长为1nm进行扫描，确定最大吸收波长为395nm。

(ⅱ)液相色谱仪检测：将步骤(ⅰ)中配置的0.01％叶绿素铁钠盐溶液在进样量为10ul，紫外检测器波长395nm，柱温箱温度设置为30℃，色谱柱为poroshell120ec-c184μm，流速为1.0ml/min，流动相：a：甲醇：水：乙酸＝60：30：10，b：甲醇：乙腈：水：乙酸＝50：25：15：10，梯度洗脱程序为0min，a％＝100％、b％＝0％，15min；a％＝0％、b％＝100％；25min，a％＝100％、b％＝0％。进样间隔平衡时间为5min的条件下进行检测，得到叶绿素铁钠盐溶液的色谱图(见图3)。

(ⅲ)液相色谱质谱联用确认峰位置：将步骤(ⅱ)中得到的色谱图进一步进行质谱分析，利用液相检测的参数等到质谱图，通过质谱库确认叶绿素铁钠盐的位置，同时分析目标峰的纯度。质谱操作条件esi离子源，分子量扫描范围650-750。

(ⅳ)作标准曲线：配置浓度为1、2、4、5、10、20mg/l的叶绿素铁钠盐溶液，按照步骤(ⅱ)参数进行检测，得到色谱图，以峰面积为纵坐标，叶绿素铁钠盐浓度为横坐标，作出标准曲线图，得到标准曲线方程(见图4)。

实施例3：

(ⅰ)样品预处理：天然蚕沙提取合成的叶绿素铁钠盐经过萃取、离心、和过0.22μm聚偏氟乙烯(pvdf)滤膜后，放置棕色试剂瓶中4℃保存。

(ⅱ)确定紫外检测最大吸收波长：取1ml叶绿素铁钠盐溶液稀释10被。在哈希dr3900型分光光度计下300-900nm以步长为1nm进行扫描，确定最大吸收波长为395nm。

(ⅲ)液相色谱仪检测：量取1ml叶绿素铁钠盐溶液于棕色液相瓶中(体积2ml)。在进样量为10ul，紫外检测器波长395nm，柱温箱温度设置为30℃，色谱柱为poroshell120ec-c184μm，流速为1.0ml/min，流动相：a：甲醇：水：乙酸＝70：20：10，b：甲醇：丙酮：水：乙酸＝60：25：5：10，梯度洗脱程序为0min，a％＝100％、b％＝0％；5min，a％＝0％、b％＝100％；25min，a％＝100％、b％＝0％，进样间隔平衡时间为5min的条件下进行检测，得到叶绿素铁钠盐溶液的色谱图。

(ⅳ)样品测定及计算过程：在叶绿素铁钠盐出峰位置进行积分，得到叶绿素铁钠盐的峰面积，代入重新测定的标准曲线方程中(由于本实施例中叶绿素铁钠盐的来源与实施例1、实施例2均不相同，因此标准曲线方程需要重新测定)，得到未知样品中叶绿素铁钠盐的浓度。

实施例4：

(ⅰ)样品预处理：将购置的最大吸收波长为392nm叶绿素铁钠盐试剂添加至剩余污泥中，进行调理，调理完成后的混合液高速离心后，过0.22μm聚偏氟乙烯(pvdf)滤膜。对于含量非常低的样品，可以通过先萃取富集再过滤处理便于检测。

(ⅱ)液相色谱仪检测：量取1ml调理后含叶绿素铁钠盐溶液于棕色液相瓶中(体积2ml)，在进样量为10ul，紫外检测器波长392nm，柱温箱温度设置为30℃，色谱柱为poroshell120ec-c184μm，流动相：a：甲醇：水：乙酸＝60：30：10，b：甲醇：乙腈：水：乙酸＝50：25：15：10，梯度洗脱程序为0min，a％＝100％、b％＝0％，15min；a％＝0％、b％＝100％；25min，a％＝100％、b％＝0％。进样间隔平衡时间为5min的条件下进行检测，得到叶绿素铁钠盐溶液的色谱图。

(ⅲ)样品测定及计算过程：在叶绿素铁钠盐出峰位置进行积分，得到叶绿素铁钠盐的峰面积，代入实施例1得到的标准曲线方程中得到未知样品中叶绿素铁钠盐的浓度。

上述实施例中，流动相各组分的比例均是指它们的体积比。液相色谱仪品牌型号可以采用安捷伦、岛津、福立等。另外，作标准曲线时，横、纵坐标也可以互换。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。