用于检测未知种类的分子的标记状态的方法与流程

本发明涉及当样品暴露于无变化同位素标记过程时，用于通过质谱法检测样品中未知分子m的标记状态的方法。

背景技术：

人们对科学、医学和如制药等几个行业抱有很大兴趣，想了解包括一定含量的各种类的分子的复杂样品中的化学反应过程。此类样品具体地可以是生物化学样品，如细胞、血液、组织和细菌。具体地说，为了解化学反应和反应途径，可以通过同位素标记技术将同位素标记物提供给感兴趣的样品。同位素标记过程的同位素标记物可以至少包括一个种类的分子，所述分子可以包括各种元素。此种类的分子，在本专利申请中被称为同位素标记物标记的种类的分子，可以通过富集分子的至少一个特定元素e的特定同位素^xe(即，标记用同位素)来标记，所述同位素的天然丰度低。例如，在包括碳原子的分子中，可以富集同位素¹³c。在另一个实例中，标记种类的分子可以通过富集元素e1的特定同位素^xe1和元素e2的特定同位素^ye2来标记，其中元素e1和e2都包括在标记种类的分子中。

在标记种类的分子中富集特定同位素^xe通常意味着在标记种类的分子中特定元素e的一个或几个原子被特定的同位素^xe替换。

在同位素标记过程的一个特定实施例(在此专利申请中被称为单个富集同位素标记过程)中，这种富集通过仅将标记分子的特定元素e的一个原子与特定同位素^xe交换来完成。

在特定的标记过程(在此专利申请中被称为单个同位素标记过程)中，所提供的同位素标记物仅包括以下标记种类的分子，其中仅富集仅一种特定元素e的特定同位素^xe。这种富集可以用特定的同位素^xe替换特定元素e的一个或几个原子。

优选地，同位素标记物仅包括一种标记种类的分子，但其也可以是几种不同种类的分子。则在所有这些分子中，通过仅替换分子中元素e的原子来富集同位素^xe。

在其它特定同位素标记过程中，所提供的同位素标记物仅包括以下标记种类的分子，其中至少一种特定元素e的特定同位素^xe被富集，并且这种富集通过仅将标记分子中的特定元素e的少量原子与特定同位素^xe交换来完成。在这些标记过程的一个实施例中，这种富集通过仅将标记分子的特定元素e的至多4个原子与特定同位素^xe交换来完成。在这些标记过程的另一个实施例中，这种富集通过仅将标记分子的特定元素e的至多3个原子与特定同位素^xe交换来完成。在这些标记过程的一个优选实施例中，这种富集通过仅将标记分子的特定元素e的至多2个原子与特定同位素^xe交换来完成。优选地，同位素标记物仅包括一种标记种类的分子，但其也可以是几种不同种类的分子。则在所有这些分子中，通过仅替换分子中的少量原子e来富集同位素^xe。优选地，在更多标记种类的分子中，通过仅替换分子中的一个原子e来富集同位素^xe。

优选地使用标记过程中的同位素标记物，其中标记种类的分子的某一部分分子被标记。通常，此部分分子高于分子的量的50％，但其可以在75％到95％的范围内。例如，标记分子的种类的80％或90％可以被标记。

如果可以将此类特定同位素标记物施用于可以为生物体的样品或所述样品的来源，则可以发生不同的同位素标记过程。在一些同位素标记过程(在下文被称为无变化同位素标记过程)中，由于同位素标记物的施用，不会产生新的分子。由于同位素标记物在样品分子中的施用，仅可以增加标记用同位素^xe的出现。

从现有技术中已知用无变化同位素标记过程标记样品的不同方法。

在特定的同位素标记过程(在此专利申请中被称为无变化单个同位素标记过程)中，所提供的同位素标记物仅包括以下标记种类的分子，其中仅富集仅一种特定元素e的特定同位素^xe，并且这种富集通过仅将标记分子的特定元素e的原子与特定同位素^xe交换来完成，并且由于同位素标记的施用不会产生新的分子。在这种同位素标记过程中，标记样品的分子可以仅用特定同位素^xe标记，并且其中样品中的分子中的特定同位素^xe的每个富集基于化学反应，其中涉及同位素标记物的标记分子，并且当至少两个分子已经通过包括特定同位素^xe被标记时，可以进一步基于样品分子的化学反应。

在特定的同位素标记过程(在此专利申请中被称为部分同位素标记过程)中，样品中的分子中的至少特定元素e的特定同位素^xe的富集仅基于化学反应，其中涉及同位素标记物的标记分子，其中标记分子不将其中至少特定元素e的所有特定同位素^xe转移到样品中的所得分子。

当无变化同位素标记过程时，已知有不同的方式来检测样品中含有的各种类的分子的标记状态。具体地说，标记状态可以通过质谱仪检测的样品的质谱图来检测。

一种方式是仅考虑样品中的某一种类的分子，从中已知其以一定量含在样品中，使得其在样品的质谱图中可检测为质量峰。

在整个说明书中，当解释质谱图和质谱仪的测量结果时，将使用术语“质量”。此术语将以还涵盖术语质荷比m/z的广义使用。质谱通常显示检测到的信号i(p)的强度，其与具有特定质荷比m/z的检测离子的数量相关，其与质谱图中的峰值位置p相关。峰值位置可以是质荷比m/z，也可以是其它参数，如频率ω(例如在orbitrap中)或飞行时间(例如在飞行时间质谱仪中)。只有当所有检测到的离子都具有电荷状态z＝1时，峰值位置才直接与离子质量有关。否则，当离子具有电荷状态z＝n时，在特定的m/z值处不仅检测到质量m的离子，而且还检测质量为n×m的离子。对于本发明的讨论，不再详细描述不同电荷状态z的离子的检测，但仍可以在质谱仪的任何测量中进行检测。

对于已知其含在样品中的样品中的某一种类的分子，可以通过靶向模式检测所述种类的分子的标记状态，以检测已知种类的分子的标记状态。用于检测标记状态的这种靶向模式是本领域技术人员从现有技术中已知的。研究人员已知某一种类的分子，其拥有以下可靠的信息，所述种类的分子含在样品中。其可以从其之前为研究样品所做的其它实验的所调查样品的种类中获得这些知识。

另一种方式不基于所述知识，具体而言所述知识即仅考虑样品中含有的某一种类的分子。通过这种“非靶向方法”，可以检测样品中含有的任何种类的分子的标记状态。具体地说，可以检测样品中包含的此类种类的分子的标记状态，所述此类种类的分子是未知的。在调查样品的人员未获得表明样品中含有某一种类的分子的确信信息的情况下，所述样品中含有的所述种类的分子是所述样品中含有的未知种类的分子。因此，如果样品中含有特定种类的分子，那么还需要进一步的实验来提供具有高度可靠性的信息。

而且，用于检测标记状态的这种非靶向模式是本领域技术人员从现有技术中已知的，并且其可以仅检测样品中未知种类的分子的标记状态。但是这种方式存在很多不确定性，并且所使用的评估过程非常复杂且难懂。

已知使用质谱法识别样品中未知种类的分子的元素组成的方法。特别是在申请人的未公开的欧洲专利申请18156903.9中公开了这种方法，所述专利申请以其全部公开内容特此并入。

本发明的目的在于提供一种改进的方法，用于在对样品应用无变化标记过程时检测样品中含有的某一种类的分子的标记状态，所述种类的分子是未知种类的分子。特别地所述方法应提供更可靠的结果，并应减少评估过程的工作量。本发明的进一步的目的在于当对复杂样品应用无变化同位素标记过程时，提升复杂样品中化学反应过程的反应通量分析的可靠性。

技术实现要素：

上述目的通过一种用于检测暴露于无变化单个同位素标记过程的样品中含有的未知种类的分子m的标记状态的新型方法解决，所述过程使用根据权利要求1所述的质谱仪。

无变化单个同位素标记过程使用特定元素e的特定同位素^xe来标记样品中的分子。所述方法包括以下可以以不同顺序执行的过程。

在所述方法的过程中，用质谱仪测量参考样品的至少一个质谱图iul(pul)。此参考样品尚未暴露于样品所暴露于的无变化单个同位素标记过程，或仅在标记过程开始时暴露于所述无变化单个同位素标记过程中，其中在至少一个质谱图iul(pul)测量之前，样品暴露于其中。

参考样品的所测量质谱iul(pul)(“ul”意指未标记的样品)显示由所测量的强度i给出的取决于其质量m的离子化离子的丰度(如上正确解释的质荷比)m/z，其中此比例与所测量的质谱图imeas(p)的峰值位置p相似或相关。因此，所测量的质谱图iul(pul)含有关于参考样品中含有的所有种类的分子m的质量m的信息。具体地说，其包含关于所述种类的分子m的所有同位素异构体的质量m的信息。

参考样品与研究样品相关，其中含有未知分子。本发明方法的意图是通过观察由于应用的无变化单个同位素标记过程而在样品中富集标记用同位素^xe来理解化学反应过程。为理解分子标记的进展以及相应的也是由于标记用同位素^xe从样品的一个分子转移到另一个分子的反应路径，因此在将无变化单个同位素标记过程应用于样品之前，了解样品中含有何种类的分子仍然很重要。因此参考样品应提供此信息。

在优选的实施例中，样品本身可以用作参考样品。然后用质谱仪测量样品的至少一个质谱图iul(pul)，然后将其暴露于无变化单个同位素标记过程或仅在标记过程开始后暴露于无变化单个同位素标记过程。

在另一个优选实施例中，参考样品和暴露于无变化同位素标记过程的样品是普通原始样品(优选地为生化样品)的不同部分。因此，参考样品和样品是原始样品的子集。优选地，原始样品是均相系统，其分子组成提供至多非常小的变化。在原始样品仅在标记过程开始时暴露于无变化同位素标记过程之后，可以从原始样品中取出参考样品。

在本发明方法的另一个实施例中，暴露于无变化标记过程的样品和参考样品可以是不同的样品。但其可以由相同的来源提供，例如活有机体、如河流或岩石等自然资源、工业来源或农业来源。其也可以由不同但相关的来源提供，如相同的活有机体或相同的工业生产过程。

如果测量参考样品的至少一个质谱图，其仅在无变化单个同位素标记过程开始时暴露所述过程，则参考样品暴露于标记过程的时间很短，没有发生用特定同位素^xe进行的分子的相关标记，其至少一个所测量质谱图已经可被检测到。因此，没有可检测到的另外的质量峰，也没有峰的强度变化。通常，如果已经可检测到的标记与执行测量的质谱仪的分辨力相关。在具有高分辨力和/或所测量质谱图的高信噪比的仪器中，可以更早地检测开始标记。因此，在参考样品中，只有少量分子已被标记。通常参考样品中不超过5％的分子被标记，优选地参考样品中仅1％的分子被标记，并且特别优选地参考样品中仅0.2％的分子被标记。

通常，当测量参考样品的质谱图以拥有代表未标记样品(参考样品)的质谱图时，目标是能够从质谱图中识别未标记样品的分子的元素组成。

在优选的实施例中，用lc/ms仪器测量参考样品的质谱图。然后通过液相色谱系统，特别是液相色谱柱，将参考样品提供给质谱仪，特别是其离子源。然后通过质谱测量液相色谱系统的流出物的一系列质谱图。这意味着在流出物洗脱的不同时间将流出物提供给质谱仪，特别是其离子源，以测量特定洗脱时间的质谱图。然后可以从一系列质谱图中得到质量迹线。根据色谱过程，可以在特定的洗脱时间检测色谱峰，也称作根据色谱过程保留时间，针对每个种类的分子进行检测，此时可以将其显示为质量迹线。通常，质量迹线是在某一种类的分子的同位素物质的质量下检测到的，但是为了聚结效应，质量可能在测量一系列质谱图的某些时间段偏离。在申请人的未公开的欧洲专利申请18170779.5中描述了考虑聚结效应的这种质量迹线的检测，所述专利申请以其全部公开内容特此并入。

通常，测量至少参考样品的质谱图可以重复几次，并且例如，然后可以将质谱图平均以拥有用于利用本发明的方法确定参考样品中含有的某一种类的分子的元素组成的经改进的基础。可以重复单次测量或完成一系列测量，例如，在重复色谱实验期间。

参考样品的至少一个质谱图iul(pul)可以通过一种质谱仪测量，与其分辨力无关。具体地说，优选使用高分辨率的质谱仪，例如具有质量分析仪或其它静电离子阱作为质量分析仪的质谱仪、傅立叶变换(ft)质谱仪、离子回旋加速器(icr)质谱仪或多反射飞行时间(mr-tof)质谱仪。可以优选使用的其它质谱仪特别是飞行时间(tof)质谱仪和具有hr四极质量分析仪的质谱仪，以测量参考样品的至少一个质谱图。

在本发明方法的进一步过程中，将待研究的样品暴露于无变化同位素标记过程，其中目的是在样品的分子中富集至少一种特定元素e的标记用同位素^xe。除此之外，所使用的无变化同位素标记过程不会改变样品中的分子种类。仅将同位素标记中含有的某一种类的分子添加到样品中。因此，除了这些种类的分子之外，可以在参考样品和样品中观察到相同种类的分子。在样品中，当样品已暴露于无变化同位素标记过程时，可以标记分子。因此，在样品的分子中，可以观察到由无变化同位素标记过程的同位素标记物提供的至少特定元素e的特定同位素^xe的相应富集。

特别是在无变化同位素标记过程中可以使用同位素标记物，其不向样品添加新种类的分子。因此，可以在参考样品和样品中观察到相同种类的分子。这具有以下优点：由于施用同位素标记物，在样品的质谱图中不会检测到与添加到样品中的某一种类的分子无关的另外的质量峰。进一步地，这种同位素标记物的施用不会影响样品中的反应。在样品中，当样品已暴露于无变化同位素标记过程时，可以标记分子。因此，在样品的分子中，可以观察到由无变化同位素标记过程的同位素标记物提供的至少特定元素e的特定同位素^xe的相应富集。

进一步地，在本发明方法的优选实施例中，使用无变化单个同位素标记过程，其中所提供的同位素标记物可以包括标记种类的分子，其中仅一个特定元素e的仅一个特定同位素^xe被富集。这种标记过程提供了以可控方式跟踪样品中的标记过程的优点，因为参考样品中含有相同种类的分子，并且样品暴露于无变化单个同位素标记过程中，并且标记仅用所提供的标记用同位素^xe才会发生，所述同位素仅由标记分子上的同位素标记物提供。

进一步地，在本发明方法的另一个优选实施例中，使用无变化单个富集同位素标记过程，其中通过仅将标记分子的特定元素e的一个原子与特定同位素^xe交换来进行富集。这种标记过程提供了以可控方式跟踪样品中的标记过程的优点，因为参考样品中含有相同种类的分子，并且样品暴露于无变化单个同位素标记过程中，并且标记仅用所提供的标记用同位素^xe才会发生，所述同位素仅由标记分子上的同位素标记物提供，其中元素e的仅一个单个原子与标记用同位素^xe交换。

所使用的同位素标记过程的选择降低了样品分子标记的复杂性。由于所述选择，本发明人可以在考虑到无变化同位素标记过程的特定特征的情况下找到本发明的方法。在本发明方法的一个优选实施例中，无变化同位素标记过程所提供的同位素标记物包括标记种类的分子，其中至少一个特定元素e的仅一个特定同位素^xe被富集，而非所有标记分子的种类的所有分子被标记。样品中只有人工丰富的标记分子。通常，标记分子的种类的所有分子中多于50％在同位素标记物中被标记(标记率为50％)，优选地是标记分子的种类的所有分子的多于80％，并且特别是多于90％，更优选的是标记度多于95％、多于98％甚至多于99％。所述种类的所有分子都是标记分子。同位素标记物的这种标记率降低了其生产成本，并且对于检测样品中的某一种类的分子的标记状态并不具决定性，因为在如下所描述的本发明方法中考虑了标记率。

在本发明方法的进一步的过程中，在样品的无变化同位素标记过程开始之后，用质谱仪测量样品的质谱图il(pl)。

这些测量的意图是观察样品中含有的分子的标记过程。通过标记过程，随着时间的推移，分子中的越来越多含有至少一个元素e的特定同位素^xe，其在分子中根据其天然存在替换至少一个元素e的原子。因此应该提到的是，大多数情况下，实际上没有发生原子e与特定同位素^xe的交换。包括特定同位素^xe的样品中含有的标记分子是化学反应的结果，其中涉及同位素标记物的标记种类导致样品的标记分子的组成中特定同位素^xe的原子的增加，或其中涉及样品的前标记分子导致样品的标记分子的组成中特定同位素^xe的原子增加到在标记过程前样品的分子中含有的特定元素e的原子的数目。因此，通过这些反应，产生了之前反应中已经存在的分子，其中现在特定同位素^xe的原子数增加。因此，随着在无变化单个同位素标记过程期间样品中的时间推移，样品的分子中的特定同位素^xe的原子数增加。对于样品中含有每个种类的分子，这种增加可能不同，并且对于某些分子，可以观察到随着特定同位素^xe的原子的数木减少而增加。在单个富集同位素标记过程中，在此专利申请中，将包括特定同位素^xe的n个原子的分子m称为n倍标记分子ml。对于样品中的每个分子，如果不考虑特定同位素^xe的富集，则其标记过程可以通过具有与样品的未标记分子m相同的元素组成的所有分子的n倍标记分子ml的强度贡献lm(n)或相对丰度cm(n)来描述。样品的未标记分子m或所谓的0倍标记分子m具有强度贡献lm(0)和相对丰度cm(0)。如果在未标记分子m的元素组成中含有元素e的k个原子，则最高可能的标记分子是具有相对丰度cm(k)的n倍标记分子ml。如果不考虑特定同位素^xe的富集，则样品中具有与样品的未标记分子m相同的元素组成的某一种类的分子的所有相对丰度的总和等于1。

cm(0)+cm(1)+cm(2)+…+cm(k-1)+cm(k)＝1

因此，当标记分子ml和未标记分子m的所有变体的强度贡献lm(n)的总和归一化为1并且描述标记分子的每种变体ml与具有相同元素组成的分子总数的比例时，相对丰度cm(n)是n倍标记分子ml的强度贡献lm(n)，所述总数是标记分子ml和未标记分子m的所有变体的数目。

某一种类的分子m的标记状态由其n倍标记分子ml的强度贡献lm(n)，特别是相对丰度cm(n)定义。n介于0(未标记分子)与n之间。在一些具体的实施例中，并未考虑所有标记的分子ml，特别是当其具有非常小的相对丰度时。通常，当元素e的大量原子被特定同位素^xe替换时，会发生这种情况。然后仅考虑比k更少的数量的标记分子ml。

通常，在同位素标记过程中，在此专利申请中，将包括w个不同元素ei的特定同位素^xei的ni个原子的分子m称为(n1,n2,...,nw)倍标记分子ml。对于样品中的每个分子，如果不考虑特定同位素^xei的富集，则其标记过程可以通过与样品的未标记分子ml具有相同的元素组成的所有分子的(n1,n2,...,nw)倍标记分子的强度贡献lm(n1,n2,...,nw)或相对丰度cm(n1,n2,...,nw)来描述。样品的未标记分子m或所谓的(0,0,…,0)倍标记分子m具有强度贡献lm(0,0,…,0)和相对丰度cm(0,0,…,0)。如果在未标记分子m的元素组成中含有元素ei的ki个原子，则最高可能的标记分子是具有相对丰度cm(n1,n2,...,ni＝ki,nw)的n倍标记分子ml。如果不考虑特定同位素^xe的富集，则样品中具有与样品的未标记分子m相同的元素组成的某一种类的分子的所有相对丰度的总和等于1。

因此，当标记分子ml和未标记分子m的所有变体的强度贡献lm(n1,n2,...,nw)的总和归一化为1并且描述标记分子ml的每种变体与具有相同元素组成的分子总数的比例时，相对丰度cm(n1,n2,...,nw)是(n1,n2,...,nw)倍标记分子ml的强度贡献lm(n1,n2,...,nw)，所述总数是标记分子ml和未标记分子m的所有变体的数目。

样品的至少一个质谱图il(pl)可以通过一种质谱仪测量，与其分辨力无关。具体地说，优选使用高分辨率的质谱仪，例如具有质量分析仪或其它静电离子阱作为质量分析仪的质谱仪、傅立叶变换(ft)质谱仪、离子回旋加速器(icr)质谱仪或多反射飞行时间(mr-tof)质谱仪。可以优选使用的其它质谱仪特别是飞行时间(tof)质谱仪和具有hr四极质量分析仪的质谱仪，以测量参考样品的至少一个质谱图。

在本发明方法的优选实施例中，可以用同一类型的质谱仪测量参考样品的至少一个质谱图iul(pul)和样品的至少一个质谱图il(pl)。进一步优选用同一类型的质谱仪测量参考样品的至少一个质谱图iul(pul)和样品的至少一个质谱图il(pl)。具体地说，优选用同一个质谱仪测量参考样品的至少一个质谱图iul(pul)和样品的至少一个质谱图il(pl)。

在优选的实施例中，用lc/ms仪器测量样品的质谱图。然后通过液相色谱系统，特别是液相色谱柱，将样品提供给质谱仪，特别是其离子源。然后通过质谱测量液相色谱系统的流出物的一系列质谱图。这意味着在流出物洗脱的不同时间将流出物提供给质谱仪，特别是其离子源，以测量特定洗脱时间的质谱图。然后可以从一系列质谱图中得到质量迹线。根据色谱过程，可以在特定的洗脱时间检测色谱峰，也称作根据色谱过程保留时间，针对每个种类的分子进行检测，此时可以将其显示为质量迹线。通常，质量迹线是在某一种类的分子的同位素物质的质量下检测到的，但是为了聚结效应，质量可能在测量一系列质谱图的某些时间段偏离。在申请人的未公开的欧洲专利申请18170779.5中描述了考虑聚结效应的这种质量迹线的检测，所述专利申请以其全部公开内容特此并入。

通常，测量至少参考样品的质谱图可以重复几次，并且例如，然后可以将质谱图平均以拥有用于利用本发明的方法确定参考样品中含有的某一种类的分子的元素组成的经改进的基础。可以重复单次测量或完成一系列测量，例如，在重复色谱实验期间。

通常，在无变化同位素标记过程开始之后，在一段时间内测量样品的质谱图il(pl)，以观察标记样品中含有的某一种类的分子m的过程。此时，可以观察到特定同位素^xe的时间依赖性富集，其可以通过其n倍标记的分子ml的时间依赖性相对丰度cm(n,t)来表示，所述丰度描述了在特定时间t的某一种类的分子m的标记状态，所述时间可以在样品的无变化单个同位素标记过程开始之后。

在本发明方法的进一步的过程中，基于参考样品的至少一个所测量质谱图iul(pul)确定参考样品中含有的至少一个未知种类的分子m的一种或多种最可能的元素组成cm,i(+0)。本领域技术人员已知各种方法来执行此确定过程。

某一种类的分子被定义为具有相同分子式的一类分子(例如，水具有分子式h2o，并且苯具有分子式为c6h6)。通过某一种类的分子的分子式描述所述种类的分子的元素组成。分子式通过指示根据iupac化学元素周期表的元素的符号列出分子中含有的所有元素，并通过元素符号右侧的索引列出由何数量的元素的原子组成所述分子。因此，举简单的例子，具有分子式c6h6的苯分子由6个碳原子(符号c)和6个氢原子(符号h)组成。具有相同的分子式的分子可能由于不同的异构形式而具有不同的结构式，其具有不同的对映体结构，导致不同的物理、化学和生物学性质。

在参考样品中，未发生用特定同位素进行的标记或未发生可检测到的用特定同位素进行的标记。因此，参考样品中含有的某一种类的分子m的每种元素组成由表达式cm,i(+0)描述，其中+0意指，对于所有w个元素没有标记，通过应用的无变化同位素标记过程(n1＝0,n2＝0….,nw＝0)可以进行标记。此标记在整个专利申请期间用于未标记种类的分子和未标记分子(避免长期为0)。

进一步地，表达式cm,i(+0)中的指数m识别某一种类的分子m，并且指数i与不同的所研究的最可能的元素组成相关。通常，cm,i(+0)是元素组成的分子式。

考虑多少最可能的元素组成可以取决于元素组成的确定过程的分辨率。在本发明方法的一个优选实施例中，仅考虑一种最可能的元素组成。然后对于所有所确定某一种类的分子，指数i仅为1。在另一个实施例中，所述方法中进一步使用的最可能组成的数量可以取决于元素组成的可能性的标准。特别是一些具有比其它元素组成高得多的可能性的可能的元素组成，可以仅考虑更高可能性的元素组成。然后，在本发明方法的以下过程中使用的所确定的元素组成的数量可以针对每个种类的分子而变化。

必须明确的是，通过确定元素组成的过程，还可以验证参考样品的已知分子的组成。本发明的方法仍然能够检测样品中已知种类的分子m的标记状态。具体地说，当本发明方法是分析基于无变化同位素标记过程的样品中分子的标记进程的方法的一部分时，也可以使用这些结果。这种方法通常被称为通量分析过程。此术语还将用于此专利申请中。

在本发明方法的一个优选实施例中，使用确定至少一个种类的分子m的一种或多种最可能的元素组成cm,i(+0)的过程，其在申请人的未公开的欧洲专利申请18156903.9中公开，所述申请以其全部公开内容特此并入。

在本发明方法的另一个过程中，对于参考样品中含有的至少一种未知种类的分子m的每种所确定的一种或多种最可能的元素组成cm,i(+0)，在样品的所测量的质谱图il(pl)中检测样品中含有的对应种类的分子ml。

此过程包括以下三个子步骤，其针对参考样品中含有的至少一种未知种类的分子m的每种所识别的一种或多种最可能的元素组成cm,i(+0)执行。

在检测样品中含有的对应种类的分子ml的元素组成cm,i(+0)检测和所述元素组成cm,i(+0)的至少一个离散标记状态cm,i(+n1,+n2,...,+nw)的过程的第一个子步骤中，确定同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i。

应用本领域技术人员已知的方法来确定同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i。优选地考虑了测量样品的质谱图il(pl)的质谱仪的分辨力以确定同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i。

在本发明方法的一个优选实施例中，对于确定同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i，进一步考虑了以下：在无变化同位素标记过程期间使用的同位素标记物中，标记分子的种类的所有分子都被标记。因此，考虑了同位素标记物的标记率。

在一个特别优选的实施例中，同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i以这样的方式确定：对于使用元素ev的特定同位素^xev的离散标记状态的uv倍标记，某一种类的分子中的元素ev的uv个原子以元素ev的标记率被特定同位素^xev替换。因此，例如，如果碳的标记率是80％的碳原子被特定的同位素¹³c替换，并且离散标记状态是用碳3倍标记，则对于标记种类的分子中的3个原子，80％天然丰富的c原子被特定的同位素¹³c替换。

在检测样品中含有的对应种类的分子ml的过程的第二子步骤中，使用元素组成cm,i(+0)的同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i和所述元素组成cm,i(+0)的至少一个离散标记状态cm,i(+n1,+n2,...,+nw)确定对应种类的分子ml的元素组成cm,i(+0)的可检测质量mml,m。

在元素组成cm,i(+0)的同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i和所述元素组成cm,i(+0)的至少一个离散标记状态cm,i(+n1,+n2,...,+nw)中，可以观察到未标记元素组成cm,i(+0)的同位素异构体的强度峰和所述元素组成cm,i(+0)的每个离散标记状态cm,i(+n1,+n2,...,+nw)。当所有所确定的同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i的所有强度峰被质谱仪同时检测到时，如果可以通过测量样品的质谱图il(pl)的质谱仪将其彼此分辨，则将其进行比较。由此考虑所使用的质谱仪的分辨力和/或质量容差，特别是在测量样品的质谱图il(pl)时，考虑所使用的质谱仪的分辨力和质量容差。对于无法分辨的峰，通过考虑强度峰的中心的质量值和/或强度峰的顶部值处的质量值和/或优于强度峰的归一化最大强度的强度峰的最大强度，将其定义为质量mml,m的公共中心。在优选的实施例中，强度峰的顶部值处的质量值通过强度峰的归一化最大强度加权，然后进行平均以确定质量mml,m的公共中心。根据质谱仪的分辨力，当测量样品的质谱图il(pl)时，可以区分同位素异构体的精细结构。如果是这种情况，对于精细结构的每种不同的同位素异构体，可以识别单独的可检测质量mml,m，以在随后的第三个子步骤中检测样品中含有的对应种类的分子ml。

在检测样品中含有的对应种类的分子ml的过程的此第三个子步骤中，在对应种类的分子ml的所确定的可检测质量mml,m下从样品的至少一个所测量质谱图il(pl)确定对应种类的分子ml的元素组成cm,i(+0)的同位素峰模式iml,m。

为获得对应种类的分子ml的同位素峰模式iml,m，对于所确定的可检测质量，质量窗口被限定在可检测质量mml,m周围，优选地其中心处于可检测质量mml,m，其在此专利申请中被称为每个可检测质量mml,m的质量通道。当质谱仪测量样品的至少一个所测量质谱图il(pl)时，质量窗口由质谱仪的分辨力和/或质量准确度限定。当测量样品的至少一个测量的质谱图il(pl)时，质量窗口优选地被限定为质谱仪的分辨率和质量准确度的总和。然后，如果在质量通道中可以识别样品的所测量质谱图il(pl)的质量峰，则通过寻找每个可检测质量mml,m的质量通道来确定对应种类的分子ml的同位素峰模式iml,m。优选地，如果质量峰具有高于特定值的非常高的信噪比，则识别质量峰值，所述特定值优选地为1.5，特别优选地为3(以供检验)。对应种类的分子ml的同位素峰模式iml,m由所识别的质量峰给出。根据实验，可以针对单个质谱图、一组质谱图或完整色谱的质谱图或色谱图中的质量迹线检测对应种类的分子ml的同位素峰图案iml,m。具体地说，同位素峰模式iml,m可以在标记过程的特定时间确定，以研究特定时间的标记过程的过程(也称为通量分析)，并从此反应路径得出样品中的过程，例如，细胞中的自然过程或向细胞提供药物的过程。

在本发明方法的进一步的过程中，对于参考样品中含有的至少一种未知种类的分子m的每种所识别的一种或多种最可能的元素组成，从样品的所测量的质谱图il(pl)中确定样品中的对应种类的分子ml的标记状态。

样品中的对应种类的分子ml的标记状态可以描述为其(n1,n2,...,nw)倍标记分子ml和未标记分子m的强度贡献lm(n1,n2,...,nw)或相对丰度cm(n1,n2,...,nw)。

在此过程中，所述同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i被确定的所述元素组成cm,i(+0)的样品中的所述对应种类的分子ml的标记状态通过以下确定：确定所述元素组成cm,i(+0)的未标记状态和所述离散标记状态cm,i(+n1,+n2,...,+nw)的强度贡献lm,i(n1,n2,...,nw)，其通过以下确定：针对所述对应种类的分子ml的每个所确定的可检测质量mml,m，将所述对应种类的分子ml的所述所确定的所述同位素峰模式iml,m中的处于所确定的可检测质量mml,m下的峰强度与所述同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i被确定的所述元素组成cm,i(+0)和所述离散标记状态cm,i(+n1,+n2,...,+nw)的所述同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i中的所述所确定的可检测质量mml,m的峰强度进行比较。

优选地，同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i被确定的元素组成cm,i(+0)和离散标记状态cm,i(+n1,+n2,...,+nw)的同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i在比较前被归一化。这种归一化通常必须以这种方式完成：整个同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i的整体强度对于所有同位素峰模式具有相同的值，优选地为1。

在本发明方法的优选实施例中，针对参考样品中含有的至少一种未知物质分子m的每种所识别的一种或多种最可能的元素组成，根据对应种类的分子ml的每个所确定的可检测质量mml,m的所测量质谱图il(pl)确定样品中的对应种类的分子ml的标记状态，比较通过以下进行：将所述对应种类的分子ml的所述所确定同位素峰模式iml,m中的处于所确定的可检测质量mml,m下的峰强度与所述与所述元素组成cm,i(+0)的未标记状态和所述离散标记状态cm,i(+n1,+n2,...,+nw)的强度贡献lm,i(n1,n2,...,nw)和所述同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i被确定的所述元素组成cm,i(+0)和所述离散标记状态cm,i(+n1,+n2,...,+nw)的所述同位素峰模式im(+u),i中的处于预期可检测质量mml,m下的峰强度的线性组合进行比较。

通常，通过比较确定元素组成cm,i(+0)的未标记状态和离散未标记状态cm,i(+n1,+n2,...,+nw)的强度贡献lm,i(n1,n2,...,nw)会陷入超定问题，对此必须使用优化方法以找到强度贡献lm,i(n1,n2,...,nw)的最可能值。优选地，可以使用约束优化的方法。用于确定的特别优选的方法是非负最小二乘拟合。根据于标记实验，其它优化方式可能更适合于确定强度贡献lm,i(n1,n2,...,nw)。

只要不同的过程不使用本发明方法的另一个过程的结果，本发明方法的所有过程都可以按过程的任何顺序执行，并且任何这些过程序列都应涵盖在说明书和要求保护的本发明方法中。

本发明方法的过程的一些可以由计算机和处理器支持，可以是独立的，也可以是连接的，或者是在云系统中，也可以是由软件来执行这些过程。

在本申请中描述的实施例中，给出了本发明方法的实例。因此，可以通过单独的每个实施例或通过所描述的实施例的一些或所有特征的组合来实现本发明而没有任何限制。

附图说明

图1示出了说明本发明方法的流程图。

图2示出了应用于具有限定的标记状态的测试样品的本发明方法的结果。

图3示出了测试样品中两种特定分子的限定标记状态。

具体实施方式

图1以一种顺序的流程图示出了如何可以执行本发明方法的过程。这仅是本发明方法的一个实例。

现在将描述使用不同顺序的过程的本发明方法的另一个实例。

在此实例中，由于使用标记过程，单个无变化单个富集同位素标记过程使用仅用特定同位素^xe标记的同位素标记。

在此实例中，同源原始样品可以是细菌培养物，在开始时分成相关物、参考样品和样品，其应被标记。

在所述方法的第一步骤中，用质谱仪测量参考样品的质谱图iul(pul)。

用lc/ms仪器测量参考样品的质谱图。通过液相色谱系统，特别是液相色谱柱，将参考样品提供给质谱仪，特别是其离子源。然后通过质谱测量液相色谱系统的流出物的一系列质谱图。然后可以从一系列质谱图中得到质量迹线。根据色谱过程，可以在特定的洗脱时间检测色谱峰，也称作根据色谱过程保留时间，针对每个种类的分子进行检测，此时可以将其显示为质量迹线。通常，质量迹线是在某一种类的分子的同位素物质的质量下检测到的，但是为了聚结效应，质量可能在测量一系列质谱图的某些时间段偏离。在申请人的未公开的欧洲专利申请18170779.5中描述了考虑聚结效应的这种质量迹线的检测，所述专利申请以其全部公开内容特此并入。

参考样品的至少一个质谱图iul(pul)可以通过一种质谱仪测量，与其分辨力无关。具体地说，优选使用高分辨率的质谱仪，如具有质量分析仪的质谱仪。

在本发明方法的进一步的步骤中，将待研究的样品暴露于无变化单个富集同位素标记过程持续特定时间段。

在所述方法的下一步骤中，使用质谱仪，如具有质量分析仪的质谱仪在样品的无变化单个富集同位素标记过程开始之后测量样品的质谱图il(pl)。

用lc/ms仪器测量样品的质谱图。然后通过液相色谱系统，特别是液相色谱柱，将样品提供给质谱仪，特别是其离子源。然后通过质谱测量液相色谱系统的流出物的一系列质谱图。这意味着在流出物洗脱的不同时间将流出物提供给质谱仪，特别是其离子源，以测量特定洗脱时间的质谱图。然后可以从一系列质谱图中得到质量迹线。根据色谱过程，可以在特定的洗脱时间检测色谱峰，也称作根据色谱过程保留时间，针对每个种类的分子进行检测，此时可以将其显示为质量迹线。通常，质量迹线是在某一种类的分子的同位素物质的质量下检测到的，但是为了聚结效应，质量可能在测量一系列质谱图的某些时间段偏离。在申请人的未公开的欧洲专利申请18170779.5中描述了考虑聚结效应的这种质量迹线的检测，所述专利申请以其全部公开内容特此并入。

通常，在无变化同位素标记过程开始之后，在一段时间内测量样品的质谱图il(pl)，以观察标记样品中含有的某一种类的分子m的过程。此时，可以观察到特定同位素^xe的时间依赖性富集，其可以通过其n倍标记的分子ml的时间依赖性相对丰度cm(n,t)来表示，所述丰度描述了在特定时间t的某一种类的分子m的标记状态，所述时间可以在样品的无变化单个同位素标记过程开始之后。

在本发明方法的下一步骤中，基于参考样品的至少一个所测量质谱图iul(pul)确定参考样品中含有的至少一个未知种类的分子m的一种或多种最可能的元素组成cm,i(+0)。

在所述方法中，仅用所述过程确定至少一个种类的分子m的最可能的元素组成cm(+0)，所述过程在申请人的未公开的欧洲专利申请18156903.9中公开。

在所述方法的下一步骤中，针对参考样品中含有的至少一种未知种类的分子m的每种所确定的最可能的元素组成cm(+0)，在样品的所测量的质谱图il(pl)中检测样品中含有的对应种类的分子ml。

此过程包括以下三个子步骤，其针对参考样品中含有的至少一种未知种类的分子m的每种所识别的最可能的元素组成cm,i(+0)执行。

在检测样品中含有的对应种类的分子ml的元素组成cm(+0)和所述元素组成cm(+0)的所有可能的离散标记状态cm(+n)的此过程的第一个子步骤中，确定同位素峰模式im(+u)。

应用本领域技术人员已知的方法来确定同位素峰模式im(+u1,+u2,…,+uw),i。考虑了测量样品的质谱图il(pl)的质谱仪的分辨力以确定同位素峰模式im(+u)。

进一步地，在此确定中考虑了同位素标记的标记率。

在检测样品中含有的对应种类的分子ml的过程的第二个子步骤中，使用元素组成cm(+0)的同位素峰模式im(+u)和所述元素组成cm(+0)的所有离散标记状态cm(+n)确定对应种类的分子ml的元素组成cm(+0)的可检测质量mml,m。

特此考虑了所使用的质谱仪的分辨力和质量容差。

针对无法分辨的峰，通过考虑强度峰的顶部值处的质量值和优于强度峰的归一化最大强度的强度峰的最大强度，将其定义为质量mml,m的公共中心。强度峰的顶部值处的质量值通过强度峰的归一化最大强度加权，然后进行平均以确定质量mml,m的公共中心。

在检测样品中含有的对应种类的分子ml的过程的此第三个子步骤中，在对应种类的分子ml的所确定的可检测质量mml,m下从样品的所测量质谱图il(pl)确定对应种类的分子ml的元素组成cm(+0)的同位素峰模式iml,m。

在所述方法的下一步骤中，针对参考样品中含有的至少一种未知种类的分子m的每种所识别的最可能的元素组成，从样品的所测量的质谱图il(pl)中确定样品中的对应种类的分子ml的标记状态。

对于此方法，样品中的对应种类的分子ml的标记状态可以描述为其n倍标记分子ml和未标记分子m的强度贡献lm(n)或相对丰度cm(n)。

在此过程中，元素组成cm(+0)的样品中的对应种类的分子ml的标记状态通过以下确定：确定元素组成cm(+0)的未标记状态和所述离散未标记状态cm(+n)的强度贡献lm(n)，其通过以下确定：将对应种类的分子ml的所确定同位素峰模式iml,m中的处于所确定的可检测mml,m下的峰强度与元素组成cm(+0)的未标记状态和离散标记状态cm(+n)的强度贡献lm(n)和所述元素组成cm(+0)和所有离散标记状态cm(+n1)的同位素峰模式的im(+u)中的处于所预期可检测质量mml,m下的峰强度的线性组合相比较。

针对元素组成cm(+0)的未标记状态和离散标记状态cm(+n)的强度贡献lm(n)的确定，使用非负最小二乘拟合方法。

在图2和图3中示出了证明本发明方法的有效性的测试结果。用特定同位素¹³c标记的同位素标记物标记包括若干分子的测试样品。如图2底部处的表格的右栏所示，对不同的测试样品研究了几种标记状态(0％、25％、50％、75％、100％)。如样品的中间所示，测试样品包括若干种类的分子。一个种类是葡萄糖。对于标题为“状态交换率”的列中分子量为88.1094的分子，显示了用本发明方法确定标记状态的结果。分子的离散标记状态的强度贡献显示为百分比值。在分子量为88.1094的分子中含有一个或多个特定同位素¹³c时，在三个柱的左侧显示未标记分子的百分比，并且在每个相邻列中显示百分比。

在图3中，对于葡萄糖，相同的结果显示在上表中，并且对于用本发明的方法第一次发现的另一种分子，显示在下表中，所述方法识别了未知分子并确定了其标记状态。未知分子可以被识别为葡萄糖与hcl的加合物。

结果清楚地表明，本发明的方法能够识别所示分子的标记测试样品的标记状态。