一种人源视网膜色素上皮细胞注射液中二甲基亚砜残留的测定方法与流程

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种人源视网膜色素细胞注射液中二甲基亚砜残留测定的方法。
背景技术：
：视网膜色素上皮(rpe)是位于视网膜外部的连续单层细胞，因其筛子状的形态和胞质内丰富的黑色素而得名，它们在视网膜细胞的维持和自我更新上发挥重要功能，如：吞噬消化脱落的光感受器细胞的os；促进视循环中重要的介质11-顺视黄醛的再生；调节眼内的免疫反应；参与形成视网膜-血管屏障等。rpe细胞的这一生理功能异常被认为与相关眼科疾病的发生密切相关，如rpe细胞屏障功能异常则易导致best卵黄样黄斑营养不良(bestvitelliformmaculardystrophy，bvmd)和成人卵黄样黄斑营养不良(adult-onsetvitelliformmaculardystrophy，avmd)。rpe基底膜与bruch＇smembrane之间的连接或功能异常被认为与年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，amd)和sorsby’s眼底营养不良的发生相关。amd主要表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排除沉积于bruch膜，形成玻璃膜疣。amd分为干性和湿性两种，其中，干性amd更为常见，它是由于rpe进行性营养不良造成的脉络膜毛细血管和光受体缺失的一种疾病。湿性amd的典型特征是有脉络膜新生血管(choroidalneovascularization，cnv)生成，从而造成严重的视力丧失。除了细胞替代治疗，目前尚无逆转这一退行性过程并恢复视力的有效办法。rpe细胞治疗amd的试验显示通过在视网膜下腔移植正常rpe细胞，能够延缓进行性的视觉功能丧失。rpe细胞移植在rpe遗传缺陷动物模型和amd患者上的试验，都显示能够延缓视网膜的退行性病变，改善视觉功能。rpe细胞在视网膜下腔的自体移植比较稳定，且具有长期的疗效。药品中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中，以及在制剂制备过程中使用的，但在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂。人源视网膜色素上皮细胞注射液中二甲基亚砜，在ichq3c(r7)残留溶剂的指导原则中，归为第三类溶剂，属于对人体具有潜在毒性的溶剂。现有技术中采用多种不同分析方法实现对已知药物中有机溶剂的残留进行测定。如气相色谱法、液相色谱法以及质谱检测等方法。文献《毛细管气相色谱法测定加替沙星中二甲基亚砜残留量》(2008年第17卷第10期)，采用毛细管气相色谱法实现对加替沙星中二甲基亚砜的定量检测。文献《gc法测定棕榈哌泊嗪中残留溶剂二甲基亚砜》(2011年第14卷第12期)采用gc法实现对棕榈哌泊嗪中二甲基亚砜的定量测定。然而上述两种方法在应用到实际生物样品中时，由于二甲基亚砜浓度低，存在内源性的干扰，且提供检测的样本量较少，导致上述方法运用到此类产品中时，其准确度、精密度和灵敏度等将无法达到法规要求。因此开发一种对实现人源视网膜色素上皮细胞注射液中二甲基亚砜残留的检测具有重要的意义。技术实现要素：针对现有技术中存在的上述等问题，迫切需要研发一种能实现可简单快速、准确的对人源视网膜色素上皮细胞注射液中的二甲基亚砜(dmso)残留进行检测分析的技术方案。现有技术中未有关于细胞类产品中二甲基亚砜残留的测定，化药中有少量文献报到了关于二甲基亚砜残留测定的技术，主要是用毛细管气相色谱法测定。本发明主要是涉及细胞产品，现有技术无法获得相同/相近的检测方法，加之残留限度较低，气相色谱的检测限无法满足其要求，故采用气相色谱与质谱联用的方法，进而摸索最佳的色谱条件进行检测。本发明提供了一种对人源视网膜色素上皮细胞注射液中的二甲基亚砜残留进行检测分析的方法，所述方法采用了气相色谱与质谱联用技术进行分析检测，同时采用有机溶剂对实际样品(人源视网膜色素上皮细胞注射液)进行稀释溶解，减小了基质的干扰效应，显著提高了检测的灵敏度和准确度，从而符合相关法规要求，即符合《中国药典》2015年版第四部中药品质量标准分析方法验证指导原则。本发明提供了一种人源视网膜色素上皮细胞注射液中二甲基亚砜残留测定分析方法，以有机类试剂作为样品稀释溶剂，以人源视网膜色素上皮细胞注射液离心后取得的离心上清液作为待测样品，以二甲基亚砜对照品作为外标，对实际待测样品和对照品进行稀释，经滤膜过滤后，利用气相色谱与质谱联用技术进行分析检测。本发明采用以外标法计算检测结果。其中，外标法是指：取一定量的对照品制成对照品溶液，与待测样品平行地进行样品处理和检测，测量对照品溶液和待测样品溶液中待测物质的峰面积，按公式计算含量：含量(cx)＝ax/ar(其中ax是指供试品(待测样品)的峰面积，ar是对照品的峰面积，cx是供试品(待测样品)浓度)其中，所述有机类试剂包括甲醇、乙腈、乙醇等中的一种或几种。本发明人源视网膜色素上皮细胞注射液中二甲基亚砜残留的测定方法，包括以下步骤：(1)待测样品的制备：将人源视网膜色素上皮细胞注射液转移至离心管中，离心，取离心后的上清液，加稀释剂进行稀释即得待测样品；(2)对照品溶液的制备：称取二甲基亚砜对照品至容量瓶中，加稀释剂进行梯度稀释，得到对照品溶液；(3)分析检测：首先，将步骤(2)得到的对照品溶液经滤膜过滤，然后利用气相色谱与质谱联用技术进行测定，得到标准校准曲线；然后将步骤(1)得到的待测样品经滤膜过滤后，利用气相色谱与质谱联用技术进行分析检测，然后通过所述的标准校准曲线及计算公式计算待测样品中二甲基亚砜的残留量；若测定过程在，所述待测样品的浓度超出对照品的线性范围，则需要对待测品进行稀释。步骤(1)中，所述待测样品中含有无机盐，包括氯化镁、氯化钙、醋酸钠、柠檬酸钠、等中的一种或几种。步骤(1)中，所述离心的条件为500g-1500g离心2分钟-15分钟；优选地，为702g离心5分钟。步骤(1)中，所述离心的目的为去除细胞和大颗粒物质，防止堵塞仪器管路。步骤(1)中，所述稀释剂为甲醇、乙腈、乙醇等中的一种或几种；优选地，所述稀释剂为乙醇。步骤(1)中，所述稀释条件优选为取离心后样品约25mg，于5ml量瓶中，加稀释剂稀释并定容。本发明步骤(1)进行稀释的目的为降低无机盐及水对色谱柱的损伤。步骤(2)中，所述对照品为二甲基亚砜对照品；所述梯度稀释为：对照品储备液1：精密称取二甲基亚砜50.00mg置于10ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，即得。对照品储备液2：精密移取0.5ml对照品储备液1置于50ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，即得。对照品储备液3：精密移取2.0ml对照品储备液2置于20ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，即得。对照品溶液：精密移取1.0ml对照品储备液3置于10ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，即得。步骤(2)中，所述稀释剂为甲醇、乙腈、乙醇等中的一种或几种。步骤(3)中，所述滤膜包括尼龙膜、聚四氟乙烯膜、聚偏二氟乙烯膜等中的一种或几种；优选地，为尼龙膜。步骤(3)中，所述滤膜的孔径为0.22μm、0.3μm、0.45μm或0.65μm；优选地，为0.22μm。步骤(3)中，所述利用气相色谱与质谱联用技术进行分析检测的条件为：气相色谱的条件：在毛细管色谱柱中vf-waxms、supelcowax10，superoxⅱ，cb-wax，stabilwax，bp-20，007-cw，carbowax，rtx-wax毛细管色谱柱，进样量为0.5μl-2μl，进样口温度160℃-260℃，流速：0.5ml/min-1.5ml/min，分流比(15-25)：1，载气为氦气，采用程序升温；检测仪为质谱检测仪：采集模式为sim模式，定量离子：61/65/78，溶剂延迟1分钟-5分钟，检测器关闭时间：6分钟-20分钟。其中，所述毛细管色谱柱为vf-waxms、supelcowax10，superoxⅱ，cb-wax，stabilwax，bp-20，007-cw，carbowax，rtx-wax毛细管色谱柱。优选地，采用100％聚乙二醇为固定相的毛细管色谱柱：(agilentvf-waxms，30m×0.25mm×0.25μm)，进样量为1μl，进样口温度为200℃，流速：1.0ml/min，分流比20：1，载气为氦气；采用程序升温；检测器为质谱检测器：采集模式为sim模式，定量离子：61/65/78，溶剂延迟3min，检测器关闭时间：9分钟。其中，所述程序升温的条件为：70℃-120℃运行3分钟-10分钟，然后以20℃-35℃每分钟升至170℃-240℃，运行1分钟-5分钟；然后在200℃-280℃下运行2分钟-6分钟。优选地，所述程序升温的条件为：90℃运行5分钟，以25℃每分钟升至210℃，运行2.2分钟；230℃下运行2分钟。在一个具体实施方式中，利用气相色谱与质谱联用技术进行分析检测的步骤如下：采用100％聚乙二醇为固定相的毛细管色谱柱：(agilentvf-waxms，30m×0.25mm×0.25μm)，进样口温度为200℃；升温程序为：90℃运行5分钟，以25℃每分钟升至210℃，运行2.2分钟；流速为1.0ml/min；230℃下运行2分钟；进样量为1μl；分流比为20：1；载气为氦气；检测器为质谱检测器：采集模式为sim模式；定量离子：61/65/78；溶剂延迟3min；检测器关闭时间：9分钟。本发明方法所涉及的反应机理为：待测样品在汽化室汽化后被惰性气体(即载气，也叫流动相)带入色谱柱，柱内含有液体或固体固定相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气为流动相，很难建立分配或吸附平衡。也正是由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/解吸附，使得在载气中浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后，立即进入质谱检测器。质谱检测器能够将样品组分转变为电信号，而电信号的大小与被测组分的量或浓度成正比，最终计算待测样品的结果。本发明在检测过程中，二甲基亚砜(dmso)含量计算公式如下：式中：wstd＝对照品中dmso质量(mg)wspl＝待测样品的质量(mg)bstd＝对照品中dmso的平均峰面积aspl＝待测样品中dmso的峰面积vspl＝待测样品稀释体积(ml)vstd＝对照品稀释体积(ml)pstd＝对照品的含量(％)本发明还提出了所述测定方法在测定细胞类产品中二甲基亚砜残留中的应用。本发明核心发明点包括以下：1、本发明提供了一种用于检测生物制剂及相关产品中二甲基亚砜残留的方法，即气相色谱与质谱联用技术。2、本发明提出了气相色谱与质谱联用技术的最佳检测条件，可以检测到微量的二甲基亚砜的残留，本发明方法最低可以检测到含0.01ug/ml二甲基亚砜的残留量，显著提高了检测的灵敏度和准确度。本发明创新研发过程中克服了：1、样品本身所含的无机盐及水对色谱柱的损伤。2、样品属于微量贵重药品，所以能提供检测的样品量非常少。3、样品中二甲基亚砜残留非常低，其标准为0.01％(m/m)，使用气相色谱无法进行准确定量。在一具体实施方案中，所述测定方法具体包括以下步骤：(1)离心上清液的收集：将人源视网膜色素上皮细胞注射液转移至离心管中，在500g-1500g的条件下离心2分钟-15分钟，取离心后的上清液，即得待测样品。(2)待测样品稀释：取上述离心后的待测样品25mg-50mg(离心后的上清液以质量计)置于5ml-25ml容量瓶中，加稀释剂甲醇或乙腈或乙醇稀释定容，摇匀即得经稀释的待测样品溶液。(3)对照品溶液的制备：称取二甲基亚砜对照品50mg-100mg至容量瓶中，加稀释剂甲醇/乙腈/乙醇逐级稀释，得到浓度为0.5μg/ml-2.0μg/ml的对照品溶液。(4)分析检测：将上述步骤(2)得到的经稀释的待测样品溶液和经步骤(3)得到的对照品溶液经滤膜过滤后，利用气相色谱与质谱联用技术进行分析检测。本发明测定方法中，所述气相色谱与质谱联用技术中的测定条件同上。在一具体实施方案中，本发明方法中所采用的气相色谱与质谱联用技术，由安捷伦7890b气相色谱仪，配备安捷伦5977b串联质谱仪组成。本发明的优点及有益效果包括：本发明采用有机试剂对待测样品进行稀释，不仅避免了样品中水对毛细管柱的损伤，同时也降低了样品本底对色谱分离的干扰。因为含水的稀释剂对色谱柱有损伤，只能使用有机试剂；选择有机试剂的种类主要是考虑目标物在色谱柱中的分离效果。使用气相色谱与质谱联用技术进行检测的分析方法，优选的色谱条件为：采用100％聚乙二醇为固定相的毛细管色谱柱：(agilentvf-waxms，30m×0.25mm×0.25μm)，进样量为1μl，进样口温度200℃，流速：1.0ml/min，分流比20：1，载气为氦气。采用程序升温，条件为：90℃运行5分钟，以25℃每分钟升至210℃，运行2.2分钟，然后在230℃下运行2分钟。检测器为质谱检测器：采集模式为sim模式，定量离子61/65/78，溶剂延迟3分钟，检测器关闭时间9分钟。本发明方法具有简单快速、高灵敏度和高准确度优点，回收率达到98％，所述方法的重复性为：6份样品的回收率均值为103％，检测限为0.01μg/ml，线性范围为0.0501μg/ml-1.0018μg/ml，精密度为6份样品的回收率均值为97％，定量限为(loq)0.0501μg/ml，)对人源视网膜色素上皮细胞注射液的检测展现了较好的适用性、专属性、定量限及检测限、线性与范围、准确度、溶液稳定性、中间精密度和耐用性。附图说明图1为实施例2-4中空白溶液质谱图。图2为实施例2-4中二甲基亚砜对照品1质谱检测分析图。图3为实施例2-4中二甲基亚砜对照品2质谱检测分析图。图4为实施例2中人源视网膜色素上皮细胞注射液(批号201708093rcy-1)spl-1的质谱检测分析图。图5为实施例2中人源视网膜色素上皮细胞注射液(批号201708093rcy-1)spl-2的质谱检测分析图。图6为实施例3中人源视网膜色素上皮细胞注射液(批号201710097rcy-1)spl-3的质谱检测分析图。图7为实施例3中人源视网膜色素上皮细胞注射液(批号201710097rcy-1)spl-4的质谱检测分析图。图8为实施例4中人源视网膜色素上皮细胞注射液(批号201712121rcy-4)spl-5的质谱检测分析图。图9为实施例4中人源视网膜色素上皮细胞注射液(批号201712121rcy-4)spl-6的质谱检测分析图。具体实施方式结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公共常识，本发明没有特别限制内容。以下实施例仅用于进一步阐述本发明，但不应理解为对本发明的限制。本发明方法的准确性、精密度、重复性等均在方法学验证里得到证实。本发明所用的稀释剂如甲醇、乙醇、乙腈等化学试剂均为色谱纯，水为超纯水。本发明测定方法中，样品处理液经0.22um尼龙膜滤过后利用气相色谱与质谱联用技术进行分析检测。实施例1人源视网膜色素上皮细胞注射液中残留溶剂二甲基亚砜含量测定的方法验证：二甲基亚砜对照品和人源视网膜色素上皮细胞注射液(201805029rcy-qc1)，注射液使用前需离心取上清，然后用乙醇做溶剂配制，分别制备系统适用性、专属性、定量限及检测限、线性与范围、准确度、重复性、溶液稳定性、中间精密度和耐用性试验样品。各个验证项目按照既定的标准进样检测，具体操作如下：(1)对照品溶液(平行配置两份)稀释剂/空白溶液：乙醇对照品储备液1-1：精密称取50.19mgdmso置于10ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，即得。对照品储备液1-2：精密称取50.21mgdmso置于10ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，即得。对照品储备液2-1：精密移取0.5ml对照品储备液1-1置于50ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，即得。对照品储备液2-2：精密移取0.5ml对照品储备液1-2置于50ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，即得。对照品储备液3-1：精密移取2.0ml对照品储备液2-1置于20ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，即得。对照品储备液3-2：精密移取2.0ml对照品储备液2-2置于20ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，即得。对照品溶液1：(系统适用性溶液1，std1)：精密移取1.0ml对照品储备液3-1置于10ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，即得。对照品溶液2：(系统适用性溶液2，std2)：精密移取1.0ml对照品储备液3-2置于10ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，即得。(2)专属性溶液稀释剂/空白溶液：乙醇对照品溶液：取“(1)对照品溶液”项下对照品溶液1。样品空白溶液：称取24.67mg样品(批号201805029rcy-qc1)置于5ml容量瓶中，加稀释剂溶解并定容，摇匀，用0.22um尼龙膜滤过，即得。样品加标溶液：称取24.82mg样品(批号201805029rcy-qc1)置于5ml容量瓶中，向其中加入0.5ml对照品储备液3-1，加稀释剂溶解并定容，摇匀，用0.22um尼龙膜滤过，即得。(3)检测限和定量限溶液定量限溶液：精密移取1.0ml“(1)对照品溶液”项下对照品溶液1置于10ml容量瓶中，加稀释剂稀释并定容，摇匀，即得。检测限溶液：精密移取2.0ml上述定量限溶液(dmso用乙醇稀释溶解后的溶液)置于10ml容量瓶中，加稀释剂稀释定容，摇匀即得。(4)线性溶液l-200％：精密移取2.0ml“(1)对照品溶液”项下的对照品储备液3-1到10ml容量瓶，以稀释剂稀释并定容，摇匀，即得。l-150％：精密移取1.5ml“(1)对照品溶液”项下的对照品储备液3-1到10ml容量瓶，以稀释剂稀释并定容，摇匀，即得。l-100％：精密移取1.0ml“(1)对照品溶液”项下的对照品储备液3-1到10ml容量瓶，以稀释剂稀释并定容，摇匀，即得。l-80％：精密移取0.8ml“(1)对照品溶液”项下的对照品储备液3-1到10ml容量瓶，以稀释剂稀释并定容，摇匀，即得。l-50％：精密移取0.5ml“(1)对照品溶液”项下的对照品储备液3-1到10ml容量瓶，以稀释剂稀释并定容，摇匀，即得。l-loq：“取(3)检测限和定量限溶液”项下的定量限溶液，即得。将上述溶液经0.22um尼龙膜滤过后进样1ul，按下述(5)的色谱条件进行气相色谱与质谱联用技术进行检测分析。(5)色谱条件采用以100％聚乙二醇为固定相的毛细管柱(安捷伦vf-waxms，30m×0.25mm×0.25μm)，进样口温度200℃，升温程序：90℃运行5分钟，以25℃每分钟升温至210℃，运行2.2分钟，流速为1.0ml/min，在230℃条件下运行2分钟，进样量为1ul，分流比为20：1，载气为氦气，检测器为质谱检测器，采集模式为：sim模式，定量离子61/65/78，溶剂延迟3分钟，检测器关闭时间9分钟。表1中，所述空白溶剂具体指乙醇溶液；所述供试品具体指人源视网膜色素上皮细胞注射液(批号201805029rcy-qc1)，经离心后取上清；所述9份溶液具体是指：1、精密称取供试品约25mg，置于5ml容量瓶中，向其中加入0.25ml“(1)对照品溶液”项下的对照品储备液3-1，加稀释剂溶解并定容，摇匀，用0.22um尼龙膜滤过，即得，平行配制三份。2、精密称取供试品约25mg，置于5ml容量瓶中，向其中加入0.5ml“(1)对照品溶液”项下的对照品储备液3-1，加稀释剂溶解并定容，摇匀，用0.22um尼龙膜滤过，即得，平行配制三份。3、精密称取供试品约25mg，置于5ml容量瓶中，向其中加入0.75ml“(1)对照品溶液”项下的对照品储备液3-1，加稀释剂溶解并定容，摇匀，用0.22um尼龙膜滤过，即得，平行配制三份。所述6份溶液具体是指：精密称取供试品约25mg，置于5ml容量瓶中，向其中加入0.5ml“(1)对照品溶液”项下的对照品储备液3-1，加稀释剂溶解并定容，摇匀，用0.22um尼龙膜滤过，即得，平行配制6份；所述供试品加标溶液具体是指：配置好的供试品溶液加入一定量的对照品储备液；所述rsd为相对标准偏差，就是指标准偏差(sd)/计算结果的算术平均值×100％；所述c(ug/ml)为样品的浓度单位；所述s/n为色谱图基线的信噪比；所述初始温度为：检测器采用程序升温的方式，其初是温度为程序升温一开始时的温度。最终通过计算得出检测限、定量限、线性范围等验证结果，见表1(验证结果表)表1验证结果表从表1的数据中可以看出：检测限和定量限极低，分别达到0.0100ug/ml和0.0501ug/ml，从而能够灵敏地检测出样品中残留的二甲基亚砜。线性方程的相关系数r达到0.9999，9份溶液的回收率均值为104％并且其rsd为2％，更加证明了本方法的准确度高。用6份溶液重复测量并且运用不同设备、不同人员进行重复测量比对，其回收率的均值与rsd分别达到103％、1％和97％、4％，更加证明了本方法的重现性好，精密度高。供试品和对照品放置时间的研究，说明了其在放置时间内二甲基亚砜测成分不会降解，可以在放置的时间内进行测试。因气相色谱与质谱仪属精密检测系统，受外界影响较大，如温度、湿度、震动、电压不稳等因素的因素，现通过小幅度改变色谱条件，该检测方法仍然能够达到检测的要求，说明该方法的耐用性好。实施例2人源视网膜色素上皮细胞注射液，生产厂家为江苏艾尔康生物医药科技有限公司，批号：201708093rcy-1；采用二甲基亚砜色谱分离和质谱定性定量分析方法：二甲基亚砜对照品用乙醇做溶剂进行配置对照品储备液1-1：取二甲基亚砜对照品51.36mg置于10ml容量瓶中，用乙醇定容，并摇匀。对照品储备液1-2：取二甲基亚砜对照品50.48mg置于10ml容量瓶中，用乙醇定容，并摇匀。对照品储备液2-1：分别精密移取0.5ml对照品储备液1-1于50ml容量瓶中，用乙醇定容，并摇匀。对照品储备液2-2：分别精密移取0.5ml对照品储备液1-2于50ml容量瓶中，用乙醇定容，并摇匀。对照品储备液3-1：分别精密移取2.0ml对照品储备液2-1于20ml容量瓶中，用乙醇定容，并摇匀。对照品储备液3-2：分别精密移取2.0ml对照品储备液2-2于20ml容量瓶中，用乙醇定容，并摇匀。对照品溶液配置：对照品溶液1：精密移取1.0ml对照品储备液3-1置10ml容量瓶中，用乙醇定容，并摇匀，即得对照品溶液1(std1)。对照品溶液2：精密移取1.0ml对照品储备液3-2置10ml容量瓶中，用乙醇定容，并摇匀，即得对照品溶液2(std2)。供试品溶液配置：取人源视网膜色素上皮细胞注射液至离心管中，在702g的条件下离心5分钟，取离心后的上清液，即得待测样品。供试品溶液spl-1：精密称取待测样品25.39mg至5ml容量瓶中，用乙醇定容，摇匀即得。供试品溶液spl-2：精密称取待测样品26.68mg至5ml容量瓶中，用乙醇定容，摇匀即得。将上述供试品溶液spl-1、spl-2和对照品溶液1、2经0.22um尼龙膜滤过后进样1ul，用气相色谱与质谱联用技术进行分析检测。依照对照品峰面积、对照品浓度、供试品峰面积、供试品取样量和稀释倍数来计算供试品中二甲基亚砜的含量。其色谱条件为：采用以100％聚乙二醇为固定相的毛细管柱(安捷伦vf-waxms，30m×0.25mm×0.25μm)，进样口温度200℃，升温程序：90℃运行5分钟，以25℃每分钟升温至210℃，运行2.2分钟，流速为1.0ml/min，在230℃条件下运行2分钟，进样量为1μl，分流比为20：1，载气为氦气，检测器为质谱检测器，采集模式为：sim模式，定量离子61/65/78，溶剂延迟3分钟，检测器关闭时间9分钟。实施例3人源视网膜色素上皮细胞注射液，生产厂家为江苏艾尔康生物医药科技有限公司，批号：201710097rcy-1，采用二甲基亚砜色谱分离和质谱定性定量分析方法：对照品溶液1、2的配置过程同实施例2供试品溶液配置：取人源视网膜色素上皮细胞注射液至离心管中，在702g的条件下离心5分钟，取离心后的上清液，即得待测样品。供试品溶液spl-3：精密称取待测样品24.08mg至5ml容量瓶中，用乙醇定容，摇匀即得。供试品溶液spl-4：精密称取待测样品25.31mg至5ml容量瓶中，用乙醇定容，摇匀即得。将上述供试品溶液spl-3、spl-4和对照品溶液1、2经0.22um尼龙膜滤过后进样1ul，用气相色谱与质谱联用技术进行分析检测。依照对照品峰面积、对照品浓度、供试品峰面积、供试品取样量和稀释倍数来计算供试品中二甲基亚砜的含量。色谱条件同实施例2，仅spl-3、spl-4不同于实施例2。实施例4人源视网膜色素上皮细胞注射液，生产厂家为江苏艾尔康生物医药科技有限公司，批号：201712121rcy-4，采用二甲基亚砜色谱分离和质谱定性定量分析方法：对照品溶液1、2的配置过程同实施例2。供试品溶液配置：取人源视网膜色素上皮细胞注射液至离心管中，在702g的条件下离心5分钟，取离心后的上清液，即得待测样品。供试品溶液spl-5：精密称取待测样品26.00mg至5ml容量瓶中，用乙醇定容，摇匀即得。供试品溶液spl-6：精密称取待测样品25.89mg至5ml容量瓶中，用乙醇定容，摇匀即得。将上述供试品溶液spl-5、spl-6和对照品溶液1、2经0.22um尼龙膜滤过后进样1ul，用气相色谱与质谱联用技术进行分析检测。依照对照品峰面积、对照品浓度、供试品峰面积、供试品取样量和稀释倍数来计算供试品中二甲基亚砜的含量。色谱条件同实施例2，仅spl-5、spl-6不同于实施例2。检测不同批次的人源视网膜色素上皮细胞注射液中二甲基亚砜的含量如表2所示表2不同批次人源视网膜色素上皮细胞注射液二甲基亚砜含量批次201708093rcy-1201710097rcy-1201712121rcy-4含量0.0001％小于loq未检出未检出本发明方法的优点主要在于其检测限和定量限非常低，是一般方法所无法达到的。从表2中三批次样品的检测结果来看，只要有极微量的二甲基亚砜残留存在，即能被准确地检测出来。本发明分析方法对人源视网膜色素上皮细胞注射液中二甲基亚砜含量检测的线性范围、准确度、精密度、检测限和定量限等试验结果表明，所建立的分析方法能够很好的应用于不同的实际生物样本中二甲基亚砜含量的测定。当前第1页12