一种用于评价子宫内膜腺癌恶性程度的试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于评价子宫内膜腺癌恶性程度的试剂盒及其使用方法。

背景技术：

子宫内膜样腺癌是子宫内膜癌中最常见的病理类型(约占80％以上)。近年来发病率逐渐上升并呈现年轻化趋势，其中约80％以上患者未曾生育或仍有生育愿望。虽然早期的子宫内膜样腺癌患者经过以手术为主的综合治疗，可以获得良好的生存率，却使年轻患者丧失了生育能力和赖以维持女性生理特征的卵巢内分泌功能，从而引起全身代谢紊乱及其相关并发症的发生，严重地降低了患者的生活质量。如何既提高疗效又保留患者的生育功能成为临床工作者及科研人员关注的热点。

研究者基于子宫内膜样腺癌的发生与长期无孕激素拮抗的雌激素刺激有关的机制提出了孕激素治疗的方法，已被多年临床实践证明具有一定疗效。然而孕激素治疗疗效与肿瘤组织中的pr表达情况密切相关，pr表达阳性的患者对孕激素治疗效果好；pr阴性患者对孕激素治疗效果差，而且pr的缺失与肿瘤恶性程度上升，侵袭度增加及向非激素依赖型肿瘤转化相关，提示预后不良。针对pr阴性早期子宫内膜样腺癌患者，目前尚无保留生育功能的有效疗法。

cd146是一种细胞黏附分子，属于免疫超家族成员，主要表达于上皮细胞表面。最近研究表明cd146的功能不仅是参与细胞与细胞、细胞与间质间黏附过程，而且还参与了体内众多事件，如机体发育、信号传导、细胞迁移、间充质干细胞分化、血管生成及免疫应答。研究还发现cd146在多种恶性肿瘤组织表达上调，如黑色素瘤、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌等，在肿瘤发生与发展过程中起着重要作用。目前cd146已被认定为多种恶性肿瘤转移及血管内皮细胞的生物标记，其重要性已逐渐得到国内外研究者认可，以cd146为靶点的肿瘤生物免疫治疗研究已在国内外开展。

术后标本的免疫组织化学技术检测结果可指导肿瘤的诊断和治疗，但多重免疫组织化学的研究在甲醛周定的石蜡包埋组织中的应用受到限制，而在传统的免疫荧光双标染色法中，因为有机染料必须在不同的波长下才能激发，然后利用图像处理软件对图像进行覆加，才能得到最后合成的荧光双标染色结果。早在20世纪70年代就曾经引起科学家关注的量子点由于独特的光电性能再次引起了人们极大的重视,开始在免疫荧光标记中得到最初的应用，并取得了令人满意的效果。因为量子点拥有狭窄和均衡的发射谱带，可以不受激发光谱的影响，使用单一激发光源就可以同时激发所有颜色的量子点。使其能够对亚细胞分子同时进行多种标记。量子点荧光双标染色在医学检测中开始受到重视。

从目前的研究表明pr阳性和pr阴性子宫内膜样腺癌可能为子宫内膜样腺癌的两种不同亚型，二者具有不同的发生机制，cd146可能涉及到pr阴性子宫内膜样腺癌的发生与发展，同时也表明pr和cd146共表达可能是判断子宫内膜样腺癌患者预后的指标。

技术实现要素：

针对现有技术中的问题，本发明提供了一种用于评价子宫内膜腺癌恶性程度的试剂盒，通过量子点免疫荧光双标法检测组织样品中pr及cd146共表达情况对子宫内膜样腺癌恶性程度的进行评价。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种用于评价子宫内膜腺癌恶性程度的试剂盒，所述试剂盒包括pr抗体、cd146抗体、生物素化二抗、qds-sa和qds-igg。

进一步地，在上述技术方案中，所述pr抗体为鼠抗人pr抗体，所述cd146抗体为兔抗人cd146单克隆抗体，所述生物素化二抗为羊抗鼠igg，

进一步地，在上述技术方案中，所述试剂盒还包括修复液、封闭液、pbs+0.05％tween、pbs液、缓冲甘油封固剂。

本发明还提供了所述试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：

s1、将pr抗体、cd146抗体和生物素化二抗分别按一定比例稀释成工作液a1、a2和a3；

s2、将子宫内膜腺样品制备成组织芯片，脱蜡、水化后，采用抗原修复液修复，待冷却至室温，依次用自来水、ddh2o和pbs洗涤；

s3、滴加封闭液，37℃孵育10min，甩去封闭液后，滴加a1和a2的混合液，37℃孵育2h；

s4、用pbs+0.05％tween多次洗涤，滴加a3，37℃孵育45min；

s5、用pbs+0.05％tween多次洗涤，滴加加qds-sa和qds-igg的混合液，37℃孵育2h；

s6、依次用pbs+0.05％tween和pbs多次洗涤，待组织芯片干燥后，用缓冲甘油封固剂封片；

s7、荧光显微镜下观察成像，然后分析pr与cd146的表达情况。

进一步地，步骤s1采用0.3％triton-100pbs液作为稀释剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)量子点具有很强的光稳定性，使其荧光寿命很长，不易被光解或漂白而且可以反复多次激发，为标记物进行长时间的观察提供了便利，还能定量分析不同蛋白表达的量。

(2)通过分析子宫内膜样腺癌组织制成组织芯片中pr及cd146蛋白共表达情况，可以快速判断子宫内膜样腺癌的恶性程度和临床特征，为子宫内膜样腺癌提供了新的标记物和预后参考指标。且通过临床数据统计结果标明，该方法准确可靠。

附图说明

图1：子宫内膜样腺癌标本中pr及cd146表达示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步阐述，应该说明的是，下述说明是为了解释本发明，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1试剂盒

试剂盒包括鼠抗人pr抗体，兔抗人cd146单克隆抗体，羊抗鼠igg，qds-sa-525，qds-igg-605，抗原修复液，封闭液，pbs+0.05％tween，pbs液，缓冲甘油封固剂。

实施例2试剂盒的使用方法

采用实施例1提供的试剂盒，对子宫内膜样腺癌样品进行检测，具体包括以下步骤：

(1)试剂准备阶段：将pr抗体、cd146抗体和生物素化二抗分别按一定比例稀释成工作液a1、a2和a3，其中，稀释剂为0.3％triton-100pbs液，a1由鼠抗人pr抗体按稀释度1：50稀释制得，a2由兔抗人cd146单克隆抗体按稀释度1：400稀释制得，a3由羊抗鼠igg按稀释度稀释度1：300稀释制得。

(2)组织芯片制作与处理：将子宫内膜样腺癌标本石蜡中切割出圆柱形小组织，以点阵方式排列并附于片基之上，所述片基是经过防脱片处理。点的直径为1.5mm，点之间的间距为2mm；将组织芯片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中过夜；在采用二甲苯进行多次拖拉处理，每次10min；切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95％乙醇2次，每次2min，85％乙醇2min；75％乙醇2min，自来水冲洗，ddh2o洗2×2min；采用高压修复法，修复液为0.01medtaph9.0，将抗原修复液在不锈钢高压锅内加热至沸腾，将组织切片置于耐高温切片架上，浸没于沸腾的修复液中，盖上锅盖，修复时间为喷气后计时2min，室温自然冷却，自来水冲洗，ddh2o洗2min×2次，pbs洗涤2min×2次。

(3)每张切片滴加1滴(50μl)2％bsa封闭，37℃湿盒中孵育10min；甩去bsa后每张切片滴加a1和a2的混合液，37℃湿盒孵育2h。

(4)采用pbs+0.05％tween洗涤5min×3次，滴加a3，37℃湿盒中孵育45min；

(5)采用pbs+0.05％tween洗涤5min×3次，滴加qds-sa-525复合物和qds-igg-605复合物的混合液，37℃湿盒中孵育2h。其中，qds-sa-525复合物为qds-sa-525由0.3％triton-100pbs液按稀释度1：30稀释而成，qds-igg-605复合物为qds-igg-605由0.3％triton-100pbs液按稀释度1：50稀释而成。

(6)用pbs+0.05％tween洗涤5min×3次，再用pbs洗涤5min×2次，待组织标本干后，用缓冲甘油封固剂封片。

(7)荧光显微镜下紫外光激发观察成像，olympusbx51紫外激发波长为330-385nm，紫外激发条件下背景呈蓝色，其中，pr阳性表达呈绿色，cd146阳性表达呈红色，然后分析pr与cd146的表达情况。

结果分析，紫外光激发显示：背景呈蓝色，绿色荧光信号代表子宫内膜样腺癌组织中pr的表达，阳性信号定位在正常腺上皮和肿瘤细胞胞核；红色荧光信号代表子宫内膜样腺癌组织中cd146的表达，阳性信号定位于肿瘤细胞、间质的血管内皮细胞和成纤维细胞的胞膜和或胞质。如图1所示，左边为pr，cd146均为阳性表达，右边为cd146阳性，pr阴性表达。当标本中pr阴性cd146阳性表达时，即可判断出该肿瘤组织分化程度越低，肿瘤分期越晚，淋巴转移概率也越大

实施例3临床验证

采用实施例1提供的试剂盒，并采用实施例2提供的使用方法，通过选取2009年6月至2015年6月在长江大学附属第一医院手术切除诊断为子宫内膜样腺癌的的石蜡标本140例制作组织芯片。对制作好的组织芯片进行量子点免疫荧光双标法检测，所有数据采用spss17.0进行处理(计数资料间率的比较采用卡方检验，相关性分析采用spearman相关分析法)，以p<0.05表示差异有统计学意义，同时结合临床数据进行分析，检测分析结果详见表1。

表1

最后，采用spss17.0对所有数据并结合临床特征进行统计分析。结果表明pr阴性cd146阳性组的表达与子宫内膜样腺癌的组织学分级显著相关(p＜0.05)，呈正相关，即肿瘤组织分化程度越低，pr阴性cd146阳性组所占比例越高；同时与子宫内膜样腺癌的figo显著相关(p＜0.05)，呈正相关，即肿瘤分期越晚，pr阴性cd146阳性所占比例越高；且与子宫内膜样腺癌的淋巴转移显著相关(p＜0.05)，呈正相关，在淋巴转移中，pr阴性cd146阳性所占比例也最高。

综上所述，可以间接通过检测pr及cd146共表达情况来判断肿瘤的恶性程度和临床特征，此评价方法为子宫内膜样腺癌提供了新的标记物和预后参考指标。

上述结合图表说明是为了解释本发明，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。