一种大脑组织冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法与流程

本发明涉及动物解剖学领域，尤其是涉及一种大脑组织冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法。

背景技术：

甲苯胺蓝是常用的人工合成染料，其中的阳离子有染色作用组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝染色属于尼氏染色的一种，因其染色后尼氏体清晰可辨，核、核仁明显，且可区分轴突与树突，故在神经元的染色方面应用较为广泛，常规的甲苯胺蓝染色方法需要通过石蜡切片完成。

石蜡切片甲苯胺蓝染色的一般步骤需要将组织提前固定，通过脱水、透明、浸腊等步骤获得石蜡切片，随后进行脱蜡，才能进行染色处理，主要优点是能保持脑组织原有的形态和结构，可制作较薄切片。而主要缺点是石蜡切片的制作过程周期长从组织固定到切片观察往往需要5～6天，且石蜡切片的制作操作繁杂，某一环节出错就可能造成切片制作失败，且石蜡切片进行甲苯胺蓝染色时间长不易控制，容易造成背景染色过度或树突轴突结构不明显。

因此，需要研究一种大脑组织冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法既可以避免石蜡切片制作周期长，步骤繁琐等缺点，也可解决解决甲苯胺蓝染色时间与分色时间不易控制，显微照片背景过深的问题。

技术实现要素：

本发明针对现有技术不足，提出一种大脑组织冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法，借助冰冻切片技术抛弃了传统石蜡切片，固定，脱水，透明，包埋等一系列繁杂步骤，同时大大缩短了甲苯胺蓝的染色时间。

以鸟类为例，本发明大脑组织冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法，包括以下步骤：

1、大脑冰冻切片的制备：

（1）实验用鸟经3.5%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在实验用鸟一侧颈动脉灌注室温生理盐水，由另一侧静脉输出，至流出液为淡红色或透明为止，灌注完成后取出实验鸟类大脑，根据需要对大脑进行适当修整后，将大脑以需要的方向摆放至样品托上利用锡纸将组织包埋成圆柱体，滴入otc包埋胶，放于-80℃冰箱快速冷冻2min；

（2）取出包埋好的组织放于冰冻切片机内切片，片厚10μm，贴片后立即放入af固定液中固定3分钟。

在贴片步骤直接用洁净的载玻片将切下的冰冻切片迅速贴片，由于新鲜组织含有组织液，因此，载玻片可不用粘片剂处理直接贴片。贴片后应迅速放入af固定液中固定。

2、甲苯胺蓝快速染色方法如下：

（1）水洗：将固定后的冰冻切片放入蒸馏水中洗7s；

（2）甲苯胺蓝染色：将水洗后的切片放入预热至60℃的甲苯胺蓝溶液中染色2min；

（3）水洗：将染色后的切片放入蒸馏水中，水洗15s；

（4）脱水：切片放入80%酒精脱水1min；

（5）分色：将脱水后的切片放入95%的酒精中分色25s，具体时间通过镜检确定；

（6）脱水：分色后的切片迅速放入无水酒精中脱水20s；

（7）透明与封片：将切片放入二甲苯酒精混合液中3s后放入纯二甲苯中5s后封片。

上述技术方案，步骤1中鸟类生理盐水浓度为0.75%，将0.75gnacl加入100ml蒸馏水中配置而成。3.5%的戊巴比妥钠配置方法为，3.5g戊巴比妥钠加入100ml生理盐水中配制而成。af固定液由无水酒精：甲醛=9:1配置而成。其中冷冻切片机到头温度为-19℃，冷冻箱温度为-21℃。

上述技术方案，甲苯胺蓝染色液浓度为1.5%，配方为1.5g甲苯胺蓝加入100ml蒸馏水中配置而成。80%酒精溶液由80ml无水酒精与20ml蒸馏水混合配置而成，95%酒精溶液由95ml无水酒精与5ml蒸馏水混合配置而成。酒精与二甲苯混合溶液由无水酒精：二甲苯=1：1混合配置而成。

发明有益效果：由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明中通过oct包埋胶支撑组织，可增加组织在冰冻切片过程中的连续性，减少褶皱和破碎，且oct包埋胶溶于水，在染色过程中不会增加背景染色。

2、本发明采用-80℃超低温冰箱快速冷冻使组织硬化，与液氮法相比，避免了组织因温度骤降而产生裂纹，且不用复温。

3、本发明使用af固定液对冰冻切片快速固定相较与传统的丙酮固定而言尼氏体与细胞核染色更加清晰。

4、发明大脑冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法，借助冰冻切片技术抛弃了传统石蜡切片，固定，脱水，透明，包埋，等一系列繁杂步骤，同时大大缩短了甲苯胺蓝的染色时间。实验表明，本发明冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法，染色成功率远高于普通石蜡切片，且染色后尼氏体呈现深蓝色，细胞核为淡蓝色，背景无色，对于大脑神经核团和神经元的显现方面具有明显优势。

5、本发明中大脑冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法制作快速、简便，适合观察动物大脑神经的形态和细微结构从脑组织的包埋到切片观察只需30分钟即可完成。

附图说明

图1所示为斑胸草雀小脑冰冻切片甲苯胺蓝快速染色法染色后的结果，其中箭头所指为小脑；

图2所示为斑胸草雀中脑视顶盖（teotectumopticum）和视束（tro，tractusopticus）的甲苯胺蓝快速染色法染色后的结果；

图3所示为斑胸草雀大脑冰冻切片甲苯胺蓝快速染色法染色后放大1000倍的结果图。

具体实施方式

下面主要以鸟类为例对本发明技术方案做进一步的详细描述。以下各实施例仅用于说明本发明，不应当构成对本发明保护范围的限定。可以预见，本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。

实施例1

大脑冰冻切片的制备：

（1）实验用鸟经3.5%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉；

（2）在实验用鸟一侧颈动脉灌注室温生理盐水，由另一侧静脉输出，至流出液为淡红色或透明为止；

（3）灌注完成后取出实验鸟类大脑，根据需要对大脑进行适当修整后，将大脑以需要的方向摆放至样品托上；

（4）利用锡纸将组织包埋成圆柱体，滴入otc包埋胶，放于-80℃冰箱快速冷冻2min；

（5）取出（4）包埋好的组织放于冰冻切片机内切片，片厚10μm，贴片后立即放入af固定液中固定3分钟。

鸟类生理盐水浓度为0.75%，将0.75gnacl加入100ml蒸馏水中配置而成。3.5%的戊巴比妥钠配置方法为，3.5g戊巴比妥钠加入100ml生理盐水中配制而成。af固定液由无水酒精：甲醛=9:1配置而成。其中冷冻切片机到头温度为-19℃，冷冻箱温度为-21℃。

甲苯胺蓝快速染色方法如下：

（1）水洗：将固定后的冰冻切片放入蒸馏水中洗6s；

（2）甲苯胺蓝染色：将水洗后的切片放入预热至55℃的甲苯胺蓝溶液中染色2min；

（3）水洗：将染色后的切片放入蒸馏水中，水洗10s；

（4）脱水：切片放入80%酒精脱水1min；

（5）分色：将脱水后的切片放入95%的酒精中分色20s；

（6）脱水：分色后的切片迅速放入无水酒精中脱水15s；

（7）透明与封片：将切片放入二甲苯酒精混合液中3s后放入纯二甲苯中5s后封片。

甲苯胺蓝染色液浓度为1.5%，配方为1.5g甲苯胺蓝加入100ml蒸馏水中配置而成。80%酒精溶液由80ml无水酒精与20ml蒸馏水混合配置而成，95%酒精溶液由95ml无水酒精与5ml蒸馏水混合配置而成。酒精与二甲苯混合溶液由。无水酒精：二甲苯=1：1混合配置而成。

封片后，进行显微观察和拍照，如图1。

结果显示，通过本实施列提供的冰冻切片甲苯胺蓝快速染色方法制得的切片无冰晶，核团清晰，染色效果好，适用于动物脑组织切片的快速制作和脑组织的观察。

实施例2

本实施例，和实施例1的不同之处在于进一步的减小切片厚度，优化甲苯胺蓝浓度，缩短染色时间。

大脑冰冻切片的制备：

（1）实验用鸟经4%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉；

（2）在实验用鸟一侧颈动脉灌注室温生理盐水，由另一侧静脉输出，至流出液为淡红色或透明为止；

（3）灌注完成后取出实验鸟类大脑，根据需要对大脑进行适当修整后，将大脑以需要的方向摆放至样品托上；

（4）利用锡纸将组织包埋成圆柱体，滴入otc包埋胶，放于-80℃冰箱快速冷冻2min；

（5）取出（4）包埋好的组织放于冰冻切片机内切片，片厚6μm，贴片后立即放入af固定液中固定2分钟。

鸟类生理盐水浓度为0.75%，将0.75gnacl加入100ml蒸馏水中配置而成。4%的戊巴比妥钠配置方法为，4g戊巴比妥钠加入100ml生理盐水中配制而成。af固定液由无水酒精：甲醛=9:1配置而成。其中冷冻切片机到头温度为-21℃，冷冻箱温度为-23℃。

甲苯胺蓝快速染色方法如下：

（1）水洗：将固定后的冰冻切片放入蒸馏水中洗4s；

（2）甲苯胺蓝染色：将水洗后的切片放入预热至50℃的甲苯胺蓝溶液中染色1.5min；

（3）水洗：将染色后的切片放入蒸馏水中，水洗s7，至洗去浮色为止；

（4）脱水：切片放入80%酒精脱水30s；

（5）分色：将脱水后的切片放入95%的酒精中分色15s；

（6）脱水：分色后的切片迅速放入无水酒精中脱水8s；

（7）透明与封片：将切片放入二甲苯酒精混合液中3s后放入纯二甲苯中8s后封片。

甲苯胺蓝染色液浓度为2%，配方为2g甲苯胺蓝加入100ml蒸馏水中配置而成。80%酒精溶液由80ml无水酒精与20ml蒸馏水混合配置而成，95%酒精溶液由95ml无水酒精与5ml蒸馏水混合配置而成。酒精与二甲苯混合溶液由无水酒精：二甲苯=1：1混合配置而成。

封片后，进行显微观察和拍照，如图2。

结果显示，通过本实施列提供的冰冻切片甲苯胺蓝快速染色方法制得的切片完整，无褶皱，同时对于脑组织中各个神经核团的区分明显，适用于脑组织中神经核团的快速鉴定。

实施例3

本实施例和实施例1的不同之处在于：由于某些动物脑组织较小，进行较薄的冰冻切片时容易造成切片皱缩和卷曲，因此本实施案例优化了甲苯胺蓝染色的温度，使得较厚的冰冻切片也可在染色时间不变的情况下，获得更好的染色效果。

大脑冰冻切片的制备：

（1）实验用鸟经3.5%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉；

（2）在实验用鸟一侧颈动脉灌注室温生理盐水，由另一侧静脉输出，至流出液为淡红色或透明为止；

（3）灌注完成后取出实验鸟类大脑，根据需要对大脑进行适当修整后，将大脑以需要的方向摆放至样品托上；

（4）利用锡纸将组织包埋成圆柱体，滴入otc包埋胶，放于-80℃冰箱快速冷冻2min；

（5）取出（4）包埋好的组织放于冰冻切片机内切片，片厚15μm，贴片后立即放入af固定液中固定3.5分钟。

鸟类大脑生理盐水浓度为0.75%，将0.75gnacl加入100ml蒸馏水中配置而成。3.5%的戊巴比妥钠配置方法为，3.5g戊巴比妥钠加入100ml生理盐水中配制而成。af固定液由无水酒精：甲醛=9:1配置而成。其中冷冻切片机到头温度-17℃，冷冻箱温度为-20℃。

甲苯胺蓝快速染色方法如下：

（1）水洗：将固定后的冰冻切片放入蒸馏水中洗6s；

（2）甲苯胺蓝染色：将水洗后的切片放入预热至60℃的甲苯胺蓝溶液中染色2min；

（3）水洗：将染色后的切片放入蒸馏水中，水洗12s，至洗去浮色为止；

（4）脱水：切片放入80%酒精脱水1min；

（5）分色：将脱水后的切片放入95%的酒精中分色20~30s，具体时间通过镜检大脑细胞染为蓝色确定；

（6）脱水：分色后的切片迅速放入无水酒精中脱水20s；

（7）透明与封片：将切片放入二甲苯酒精混合液中8s后放入纯二甲苯中10s后封片。

其中甲苯胺蓝染色液浓度为1.5%，配方为1.5g甲苯胺蓝加入100ml蒸馏水中配置而成。80%酒精溶液由80ml无水酒精与20ml蒸馏水混合配置而成，95%酒精溶液由95ml无水酒精与5ml蒸馏水混合配置而成。酒精与二甲苯混合溶液由。无水酒精：二甲苯=1：1混合配置而成。

封片后，在高倍镜下进行显微观察和拍照，如图3。

结果显示，通过本实施列提供的冰冻切片甲苯胺蓝快速染色方法对较厚的冰冻切片染色效果较好，轴突以及树突结构明显，尼氏体和细胞核染色清晰，适用于神经元的还书观察和较厚冰冻切片的快速染色。

实施例4

一种大脑组织冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法，包括如下步骤：

1）将处理后的鸟类或其它动物大脑组织适当修整后，以需要的方向摆放至样品托上，利用锡纸将组织包埋成圆柱体，滴入otc包埋胶，放入-80冰箱快速冷冻，冷冻时间2分钟左右；

2）取出冷冻好的组织放于冰冻切片机内切片，片厚7～15μm，贴片后立即放入af固定液中固定；

3）水洗：将固定后的冰冻切片放入蒸馏水中洗5～7s；

4）甲苯胺蓝染色：将水洗后的冰冻切片放入预热至50～60的甲苯胺蓝溶液中染色2～4min；

5）水洗：将染色后的切片放入蒸馏水中，水洗8～14s，至洗去浮色为止；

6）脱水：切片放入80%酒精脱水1min；

7）分色：将脱水后的切片放入95%的酒精中分色20～30s，具体时间通过镜检大脑细胞染为蓝色确定；

8）脱水：将分色后的切片迅速放入无水酒精中脱水10到20s；

9）透明与封片：将切片放入二甲苯酒精混合液中3～8s后放入纯二甲苯中5～10s后封片。

其中，甲苯胺蓝染色液浓度为1.5～2.0%，配方为1.5～2.0g甲苯胺蓝加入100ml蒸馏水中配置而成。透明与封片过程中，酒精与二甲苯混合溶液由无水酒精和二甲苯按照1：1的比例混合配置而成。

实施例5

本实施例的大脑组织冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法，与实施例4不同的是，进一步公开了大脑冰冻切片的前期处理过程，所述前期处理过程包括以下步骤：

（1）实验用活体（鸟类或其它动物）使用3.5的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉；

（2）在实验用活体一侧颈动脉灌注室温生理盐水，由另一侧静脉输出，至流出液为淡红色或透明为止；

（3）灌注完成后取出实验用活体大脑组织，根据需要进行适当修整。

所述的af固定液，由无水酒精和甲醛安装9:1的比例配置而成。af固定液中冰冻切片固定时间为2～4分钟。冷冻切片机刀头温度为-19℃～-21℃，冷冻切片机冷冻箱温度为-21℃～-25℃。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。