一种多通道流动腔及磁镊复合检测系统和方法与流程

本发明属于显微测控和单分子力谱测量领域，涉及一种多通道流动腔及磁镊复合检测系统和方法。

背景技术：

磁镊、光镊是近年来备受关注的单分子操纵技术，主要用于研究单分子力谱、分子动力学特征等。至今为止，使用该技术的大多数研究都是在静态条件下进行，以避免流体扰动破坏单分子与磁珠结合状态，因此，关于溶液变换过程中单分子的构象变化和化学反应动力学的研究很难得到展开。开发新药物、酶等新材料，测量单分子力谱通常会采用很多种类的溶剂(介质)来处理，观察研究对象结构和结合状态的具体变化，而目前所用单分子操纵技术如磁镊、光镊等只能进行单次单试剂测量，效率较低。

平行平板流动腔技术是研究细胞表面分子相互作用的重要方法，其对单分子或者细胞施加的是平行于平板的剪切力，很难实现施加垂直于平板方向的力，无法从三维空间操控单分子或者细胞。

荧光检测技术也是研究单分子的强有力工具，将其与磁镊结合，是单分子测量领域的热门方向，目前国内已有实验室利用荧光标记生物大分子于横向磁镊进行观察。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种多通道流动腔，包括：a通道、b通道和c通道，各通道上分别设有一腔室，在a通道的腔室上构建微槽阵列，通过毛细管将b通道的腔室与a通道与c通道的前端连接，对每个腔室与通道进行圆滑顺接，减小通道涡流效应。

本发明还提供一种基于多通道流动腔的磁镊复合检测系统，基于传统磁镊系统，结合荧光检测单元和泵压控速单元对单分子进行多维度操控及成像显示。

本发明还提供一种基于多通道流动腔的磁镊复合检测方法。

本发明的多通道流动腔采用如下技术方案实现：

一种多通道流动腔，包括：a通道、b通道和c通道，各通道上分别设有一腔室，在a通道的腔室上构建微槽阵列，通过毛细管将b通道的腔室与a通道和c通道的前端连接，对每个腔室与通道进行圆滑顺接，减小通道涡流效应。

进一步地，所述a通道采用无扰动换液方法，在a通道的腔室中实现无干扰和快速换液二者平衡，结合实验对象单分子的长度，对微槽尺寸进行精细设计；设计过程借用软件模拟以及实际实验获得微槽的最佳尺寸值及h/d比值。

进一步地，b通道腔室为多试剂反应发生室；其他试剂添加方式为关闭a、c通道出口阀，打开b通道出口阀，关闭b通道入口阀，打开a或者c通道入口阀，借助泵压控速单元通过a或c通道及与其相连接的毛细管添加其他反应试剂。

进一步地，c通道提供多方向力共同作用磁珠，结合荧光技术观察：①单分子在不同剪切力下的构象变化；②撤销剪切力后单分子的松弛运动特征。

优选地，c通道施加剪切力和/或磁力共同作用微珠，磁珠所受拉力用剪切力和磁力通过勾股定理计算而得，或通过三角形定理进行修正；磁珠所连单分子长度通过观察有无剪切力下微珠水平相对位置以及距离底板的高度计算而得。

本发明的多通道流动腔磁镊复合检测系统采用如下技术方案实现：

一种多通道流动腔磁镊复合检测系统，包括：磁路单元、显微成像单元、数据采集和分析单元、载物台和样品池，设有泵压控速单元和荧光检测单元。其中：样品池基于多通道流动腔构成，泵压控速单元包括注射泵和控制注射泵活塞移动的马达，荧光检测单元包括激发光路、荧光光路及控制程序。

进一步地，复合检测系统实现泵压控速单元、荧光检测单元及磁路单元复合应用；泵压控速单元对多通道流动腔内溶剂流速及剪切力进行控制；荧光检测单元直接标记单分子；磁路单元调节磁铁位置控制磁力大小；泵压控速单元和磁路单元从三维空间对磁珠进行控制，荧光检测单元为单分子提供更直观的可视化成像。

进一步地，泵压控速单元对多通道流动腔内溶剂流速及剪切力进行控制，具体为：对a通道的腔室内通过控制换液速度，使得换液过程对微槽底部单分子与磁珠的连接没有干扰；b通道的腔室通过阀门控制，利用泵压将a通道和c通道试剂泵入腔内，形成多反应发生室；c通道的腔室通过调整流速，控制其对磁珠施加的剪切力大小。

进一步地，荧光检测单元结合泵压控速单元复合应用：在c通道中，先将单分子进行荧光标记，然后将其一端系在底板上，利用荧光显微镜观察不同剪切力下单分子的构象变化以及撤销剪切力后其自由构象变化。

本发明的多通道流动腔磁镊复合检测方法采用如下技术方案实现：

一种多通道流动腔磁镊复合检测方法，包括以下步骤：

样品制备，与正常磁镊实验中单分子样品处理方案一样，将单分子一端连在玻片上，另一端连接磁珠，于磁镊显微镜下观察；

构建及安装多通道流动腔，将多通道流动腔头部与缓冲池连接，尾部通过管子与注射泵连接，通过管道吸入液体并排出通道中气体；

设置磁镊参数，调节物镜位置，使a通道微槽内或者b通道多试剂反应室内单分子所连磁珠显示在屏幕上，控制支撑磁铁的马达，对单分子进行恒力拉伸、恒加载力拉伸以及扭转等实验；

改变参数以及测量模式，观察腔室内微珠图像或者单分子的荧光信号；

通过注射泵换液，重复上述实验操作，比较前后图像差异；

记录数据，分析结果。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、本发明的多通道流动腔a通道构建微槽阵列，单分子和磁珠连接在微槽底部里面，溶液更换的时候对它不造成影响，实现无干扰更换溶液；a通道的设计不仅可以研究换药过程单分子的初始构象和结合动力学，还可减少制样时间，大大提高研发效率；b通道的设计可实现构建多试剂反应发生室，从单分子角度观察不同试剂中目标药物分子的构象变化等药效特征；c通道的设计可以在3维空间操控单分子，也可结合荧光技术研究单分子在剪切力作用下的构象特征，模拟更复杂的生理环境。

2、多通道流动腔的a通道能够实现单次多溶剂测样，大大节省制样程序步骤，提高新药、新材料开发效率；a通道通过无扰动快速更换溶剂的手段，实现静态地观察不同溶液介质中单分子特征差异，基于其快速换液的特征，可从时间上达到高通量效果。

3、多通道流动腔能够结合其他单分子操纵技术来使用，如光镊。

4、磁镊复合检测系统中泵压控速单元控制多通道流动腔，可从静态、动态以及多试剂作用等多个角度分析单分子构象变化。

5、磁镊复合检测系统中荧光检测单元结合泵压控速单元，可观察到不同剪切力下，自由单分子的构象变化，以及磁珠所受拉力作用于磁珠后磁珠所系单分子的构象变化。

6、本发明的磁镊复合检测方法，通过观察不同种类的试剂共同作用于单分子，在不同条件下进行对比，观察其构象差异，对分析其功能是否能正常发挥，尤其是对药物分子在不同混合试剂中的效果研究具有重要意义。

附图说明

图1为本发明一个实施例中多通道流动腔结构示意图；

图2为本发明一个实施例中多通道流动腔的a通道、c通道原理图；

图3为本发明一个实施例中磁镊复合检测系统结构示意图；

图4为本发明一个实施例中磁镊复合检测方法流程图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

一种多通道流动腔，如图1所示，包括：a通道4、b通道5和c通道8，a、b、c通道上分别设有a腔室9、b腔室7、c腔室11，在a通道的a腔室构建微槽阵列10，通过毛细管道6将b通道的b腔室7与a通道与c通道的前端连接，对每个腔室与通道进行圆滑顺接，减小通道涡流效应。a、b、c通道通过入口连接管1-3、出口连接管12-14和缓冲贮存室16与外部相接，三个通道上覆盖有盖玻片15。

a通道采用无扰动换液方法，在a腔室中实现无干扰和快速换液二者平衡，结合实验对象单分子的长度为0.01-100μm，需要对微槽尺寸进行精细设计；设计过程借用软件模拟以及实际实验获得微槽的最佳尺寸值及h/d比值(2:1)

无扰动换液方法通过控制同一个体，本实施例中为a通道，可大大减少制样步骤，节省制样时间，从时间上达到高通量测量的效果；时间上实现高通量测量方法是新药、新材料研发效率提高的一个重要手段。

b通道腔室为多试剂反应发生室；其他试剂添加方式为关闭a、c通道出口阀，打开b通道出口阀，借助注射泵通过a、c通道及与其相连接的毛细管添加其他反应试剂。

c通道结合荧光技术观察：①单分子在剪切力下的构象变化；②撤销剪切力后单分子的松弛运动特征。

c通道施加剪切力和(或)磁力共同作用微珠，其中剪切力可通过流体速度、粘度等参数进行计算，微珠所受合力可通过勾股定理计算；单分子长度可通过观察有无剪切力下微珠水平相对位置x以及距离底板的高度(h+r)计算而得。

多通道流动腔结构与功能示意图如图1、2所示；下面就各个通道的功能及实现原理予以说明。

a通道能够实现单次多溶剂测样，大大节省制样程序步骤，提高新药、新材料开发效率；并且能够控制测样时溶剂介质状态，在对单分子所系磁珠无干扰的前提下进行快速换液，可模拟更复杂的生理环境，探索换液过程中单分子的初始构象以及结合动力学。

在结构上，a通道最大的特点是特定尺寸微槽阵列的构建。通过软件包模拟此换液过程，通过仿真实验，获得微槽的最佳h/d比值及尺寸值，本实例中，微槽的最佳尺寸值为0.2mm/0.1mm，h/d比值为2:1。基于此尺寸设计，可在a通道的腔室中实现无干扰和快速换液的平衡；本实施例中，a通道换液速度最快可达到16cm/s。

b通道可实现多试剂反应发生条件下，从单分子角度观察不同混合试剂中目标药物分子的构象等药效特征，实现观察单分子在多试剂反应前后的特征差异。

在结构上，b通道最大的特点是通过毛细管与a通道和c通道前端连接，关闭a、c通道出口阀，打开b通道出口阀，再关闭b通道入口阀，分别打开a通道或者c通道的入口阀，借助注射泵通过毛细管添加其他反应试剂，形成多试剂反应发生室。

c通道提供多方向力共同作用磁珠方法，提高磁镊施加拉力上限，观察单分子力谱性质；除此以外，结合荧光技术，c通道还能直接观察单分子在剪切力作用下的构象变化；c通道通过给磁珠施加剪切力，动态地观察多方向力共同作用磁珠，再借助荧光技术多角度观察单分子构象变化。

在原理上，图2中c-1为多方向力共同作用磁珠方法介绍。

c通道磁珠所连单分子长度l测量方法为：测量剪切力施加前后磁珠相对水平位置x，测量目标磁珠相对参考磁珠高度h，再利用勾股定理计算单分子长度(l+r)²＝x²+(h+r)²，其中r为磁珠半径；可利用公式tanθ＝(r+h)/x，计算出θ值，其中θ是单分子被底板和磁珠所系两点连线与底板的夹角。

c通道磁珠所受拉力ft测量方法为：通过马达控制注射泵塞移速，从而控制溶液流速v，计算出剪切速率γ以及剪切力fs；c通道中磁珠所受拉力ft可用剪切力fs和磁力fm通过勾股定理计算而得；也可通过三角形定理由ft＝fs/cosθ进行修正。

在原理上，图2中c-2为剪切力下单分子结构荧光检测方法介绍。流体剪切速率为γ＝dv/dy，其中dv是流动腔横截面方向流体流速的变化量，dy是横截面上距离底板的距离变化量；流体剪应力为τ＝γ×μ，其中μ为液体粘度。将单分子一端系于底板，通过控制流量大小，改变剪切力，可观察单分子在不同剪切力下的构象变化。

一种多通道流动腔磁镊复合检测系统如图3所示，包括：磁路单元、显微成像单元、数据采集和分析单元、载物台和样品池，设有泵压控速单元和荧光检测单元。其中：样品池基于多通道流动腔构成，泵压控速单元包括注射泵和控制注射泵活塞移动的马达，荧光检测单元包括激发光路、荧光光路以及控制程序。

泵压控速单元、荧光检测单元以及磁路单元实现复合应用；泵压控速单元对多通道流动腔内溶剂流速以及剪切力进行控制；荧光检测单元直接标记单分子；磁路单元调节磁铁位置控制磁力大小；泵压控速单元和磁路单元从三维空间对磁珠进行控制，而荧光检测单元为单分子提供更直观的可视化成像效果。

泵压控速单元能准确控制流动腔各个通道的换液速度；多通道流动腔头部尾部各设计一个缓冲贮存室，可起到提供溶剂和密封作用；多通道流动腔尾部各个出口通过管子分别与注射泵连接；借助计算机控制注射泵活塞移动来控制流量及流速。

泵压控速单元对多通道流动腔内溶剂流速及剪切力进行控制，具体为：对a通道的腔室内通过控制换液速度，使得换液过程对单分子与磁珠的连接没有干扰；b通道的腔室通过阀门控制，利用泵压将a通道和c通道试剂泵入腔内，形成多反应发生室；c通道的腔室通过调整流速，控制其对磁珠施加的剪切力大小，也可通过荧光成像技术直接观察不同剪切力对单分子构象的影响。

泵压控速单元控制原理为：泵压控速单元通过泵控制流量，从而控制溶液流速v；泵压控速单元可使a通道达到换液效果；给b通道的腔室中添加不同的反应试剂；通过计算得到剪切速率γ以及剪切力fs。荧光检测单元结合泵压控速单元复合应用：在c通道中，先将单分子进行荧光标记，然后将其一端系在底板上，利用荧光显微镜观察不同剪切力下单分子的构象变化以及撤销剪切力后其自由构象变化。

荧光检测单元为单分子提供更好的成像效果，具体为激发光通过激发滤镜筛选出最佳波段的激发光，由分光镜反射，经物镜落射到被荧光标记的样品上，样品产生的荧光和反射的激发光经分光镜分开，再由阻断滤镜滤去残余激发光，最终荧光传送到相机，通过压电陶瓷调节焦距、磁铁改变磁力、注射泵控制剪切力，相机将不同条件下观测到的图像传送到计算机进行显示、储存。

一种多通道流动腔磁镊复合检测方法，其流程如图4所示，包括以下步骤：

s1、样品制备，与正常磁镊实验中单分子样品处理方案一样，将单分子一端连在玻片上，另一端连接磁珠，于磁镊显微镜下观察；

s2、构建及安装多通道流动腔，将多通道流动腔头部与缓冲池连接，尾部通过管子与注射泵连接，通过管道吸入液体并排出通道中气体；

s3、设置磁镊参数，调节物镜位置，使a通道微槽内或者b通道多试剂反应室内单分子所连磁珠显示在屏幕上，控制支撑磁铁的马达，对单分子进行恒力拉伸、恒加载力拉伸以及扭转等实验；

s4、改变参数以及测量模式，观察腔室内微珠图像或者单分子的荧光信号；

s5、通过注射泵换液，重复上述实验操作，比较前后图像差异；

s6、记录数据，分析结果。

上述实施例仅为本发明专利较佳的实施例，但本发明专利的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明专利所公开的范围内，根据本发明专利的技术方案及其发明专利构思加以等同替换或改变，都属于本发明专利的保护范围。