本发明涉及疫苗效力检测方法，具体涉及一种利用小鼠或豚鼠检验猪圆环病毒疫苗效力的方法。
背景技术：
现在公认的猪圆环病毒疫苗效力检验所用动物为35日龄断奶仔猪，这种检验方法虽用本动物进行检测，但也存在两个弊端：1、阴性猪找寻困难，现地猪圆环病毒抗原、抗体阳性率非常高，这给阴性猪的寻找工作带来了很大困难，而如果用spf仔猪成本极高，spf猪的普及率又很低，无法广泛实行。2、成本问题，按市场价估算，一头断奶仔猪价格大概600元，而效力检验要求一批成品疫苗数量为十头，这样无形当中提高了疫苗生产企业的生产成本。3、猪只个体差异很大，对试验结果有影响。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种利用小鼠或豚鼠检验猪圆环病毒疫苗效力的方法，具体为：(1)取小鼠或豚鼠，随机分为免疫组和对照组；(2)免疫组小鼠或豚鼠进行猪圆环病毒疫苗免疫，对照组同时注射等量的nacl溶液或pbs等缓冲液；(3)免疫组和对照组实验动物逐个采血，分离血清；(4)通过检测免疫组和对照组实验动物的血清抗体，根据血清抗体效价判定疫苗的效力。
步骤(1)所述小鼠或豚鼠为猪圆环病毒抗原与抗体双阴性的健康小鼠或豚鼠。
步骤(1)所述免疫组和对照组，当免疫组实验动物为小鼠时，相应的对照组实验动物为小鼠；当免疫组实验动物为豚鼠时，相应的对照组实验动物为豚鼠。
步骤(1)所述免疫组和对照组，实验动物随机分配，但免疫组与对照组实验动物数量相等，且每组实验动物个体数量应大于等于3只。
作为本发明的优选方案之一，
步骤(2)所述免疫具体为：首次免疫猪圆环病毒疫苗后，间隔14～28天加强免疫1次，即再次免疫猪圆环病毒疫苗。
步骤(3)所述采血，在步骤(2)所述免疫结束后12～18天进行，对免疫组和对照组的所有实验动物逐个采血，分离血清。
步骤(4)所述检测免疫组和对照组血清抗体的检测方法为ipma法或其他免疫学方法。
步骤(3)所述分离出血清，具体为：采血完毕，待血清析出后，将血清离心分离，吸取上清即为处理好的待检测血清样品。
步骤(4)所述的判定方法为：免疫组至少80％以上实验动物个体血清抗体效价≥800倍，对照组全部实验动物个体血清抗体效价≤50倍；同时满足以上两个条件时判定疫苗的效力有效。
有益效果
本发明利用效力检验动物豚鼠或小鼠，在原有ipma或其他免疫学检测方法不变的基础上，进行猪圆环病毒疫苗效力检验，达到与本动物仔猪检验效果相同的目的,判定猪圆环病毒疫苗的有效性，进而替代仔猪作为检验疫苗效力的唯一动物。其优势有三，其一，所用小鼠或豚鼠几乎不存在猪圆环病毒抗原、抗体阳性问题。其二，豚鼠价格100元左右一只，而小鼠的成本则更加低，因此，采用本发明提供的方法进行猪圆环病毒疫苗效力检验成本将大大降低。其三，小鼠或豚鼠个体差异较小，同仔猪相比，对试验数据的影响较小。
具体实施方式
实施例1
取个体体重300-400g健康豚鼠(ipma检测免疫猪血清抗体＜50)10只，随机分为2组，每组5只，分别为免疫组和对照组，免疫豚鼠经腿部肌肉注射疫苗0.5ml/只，间隔21日采血并加强免疫1次，剂量为0.5ml/只，于二免后14日采血，所采血样分离血清(采用发明内容中阐述的方法)，用ipma法检测血清抗体，疫苗免疫组5只中至少有4只抗体效价≥800倍，对照组抗体效价应≤50倍，则判定为疫苗的效力有效。
实施例2
取5～9周健康小鼠(ipma检测免疫猪血清抗体＜50)10只，随机分为2组，每组5只，分别为免疫组和对照组，免疫小鼠经腿部肌肉注射疫苗0.3ml/只，间隔21日采血并加强免疫1次，剂量为0.3ml/只，于二免后14日采血，所采血样分离血清(采用发明内容中阐述的方法)，用ipma法检测血清抗体，疫苗免疫组5只中至少有4只抗体效价≥800倍，对照组抗体效价应≤50倍，则判定为疫苗的效力有效。
对比例1
取30-40日龄健康猪(ipma检测免疫猪血清抗体＜50)10头，随机分为2组，每组5头，分别为免疫组和对照组，免疫猪经颈部肌肉注射疫苗1ml/头，间隔21日采血并加强免疫1次，剂量为1ml/头，于二免后14日采血，所采血样分离血清(采用发明内容中阐述的方法)，用ipma法检测免疫猪血清抗体，疫苗免疫猪5头中至少有4头抗体效价≥800倍，对照猪抗体效价应≤50倍，则判定为疫苗的效力有效。
本试验采用不同批次疫苗进行了2次试验，根据2批次比对试验研究结果表明，小鼠或豚鼠完全可以替代仔猪作为猪圆环病毒灭活疫苗的效力检验的靶动物。具体结果见表1、表2。
表1第一批猪圆环病毒灭活疫苗对比猪和豚鼠、小鼠血清ipma抗体结果
表2第二批猪圆环病毒灭活疫苗猪和豚鼠35d血清ipma抗体结果
附：ipma法检测猪圆环病毒血清抗体操作规范(ipma法为免疫过氧化物酶单层细胞染色试验)
从上述实验结果可以看出：小鼠或豚鼠完全可以作为替代动物替代仔猪来检测猪圆环病毒疫苗的效力。对于猪圆环病毒抗体结果，首先不论用仔猪还是小鼠或豚鼠检测方法没有改变，都是规程要求的ipma方法，检测所需的试剂也没有改变，改变的只是血清样品，其次，通过结果可以看到第二批仔猪有一只可能由于个体差异原因，未产生猪圆环病毒的特异性抗体，而两批次小鼠豚鼠均未出现此情况，这样就避免了由于动物个体原因导致的疫苗无效的问题，通过实验结果也可以证明小鼠或豚鼠相对于仔猪更加敏感。再次，作为一种合格的疫苗产品，其免疫效力是衡量其质量的重要依据，而本试验小鼠或豚鼠抗体平均水平均不低于仔猪抗体平均水平，也可以证明猪圆环病毒疫苗应用于小鼠或豚鼠是可行的。猪圆环病毒抗原抗体双阴性猪只很少，符合要求的实验动物难寻，采用小鼠和豚鼠替代仔猪检测，解决了实验动物紧缺影响试验进程的问题。最后，小鼠或豚鼠的成本相对于仔猪便宜的多，对于疫苗生产厂家也确实降低了成本。综上所述，小鼠或豚鼠检测猪圆环病毒疫苗的效力是完全可行的，并且能够实现本发明的发明目的。
说明：
ipma法检测猪圆环病毒血清抗体操作规范(ipma法为免疫过氧化物酶单层细胞染色试验)
在猪圆环病毒疫苗安全性及免疫效力试验中，检测试验猪血清中病毒抗体效价是评价疫苗免疫效果的标准之一，本规程对猪圆环病毒抗体检测采用ipma法，操作程序如下：
1、血清样品准备采自同一动物免疫前和疫苗免疫后双份血清，单份血清也可以用于抗体检测，血清样品使用前置-20℃备用，无需补体灭活。
2、ipma反应板的制备用pcv2毒种稀释成104.0tcid50/ml，同步接种于新消化的pk15细胞悬液(2×105/ml)，以100μl/孔分注于96孔板的奇数列，偶数列设未接种病毒细胞对照，置37℃5％co2条件下培养形成单层，按附录1方法进行丙酮-pbs液固定，干燥后将反应板经真空密封袋内，置－20℃备用。
3、ipma反应操作程序临用前将ipma反应板放于室温，用pbs浸洗1次。将待检猪血清用pbs液从1：50起作2倍系列稀释，以pcv2阳、阴性血清作对照，每份稀释的血清分别加入1个抗原孔和1个细胞对照孔(100μl/孔)，置37℃湿盒孵育1小时，pbs洗涤3次，加入1：3000稀释的hrp-spa液(100μl/孔)，置37℃湿盒孵育1小时，pbs洗涤3次，加aec反应液显色，用光学显微镜判定结果。
4、结果判定pcv2阳性血清与病毒感染细胞染色呈棕红色,与细胞对照孔染色无着色判为阳性；用pcv2阴性血清与细胞对照和抗原感染细胞孔均无着色反应判定为阴性。以检测血清阳性终点时最高稀释度的倒数表示抗体效价。
5、溶液配制：
(1)0.01mol/lpbs(ph值为7.4)称取2.9gna2hpo4.12h2o，0.2gkh2po4，0.2gkcl,8gnacl加蒸馏水定容至1升，高压灭菌备用。
(2)aec底物储液加200mg的aec(9-amianoethylcarbazole)溶解于50ml二甲基甲酰胺，2-8℃避光保存。
(3)0.1mol/l乙酸盐缓冲液称无水乙酸钠8.2g，加蒸馏水至1升，用冰醋酸调ph为5。
(4)底物显色液0.1mol/l乙酸盐缓冲液5ml加蒸馏水5ml，滴加aec储存液500μl和30％h2o213μl。