一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法与流程

本发明属于化学分析领域，尤其是涉及一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法。
背景技术：
：4，4-偶氮吡啶是由吡啶通过联合反应制得的一类产物，橙色全状晶体，丙磺舒是白色结晶性粉末；无臭，味微苦，具有一定的药用价值，4，4-偶氮吡啶和丙璜舒在一定的反应条件下二者通过氢键结合，形成共晶，共晶的形成对于新型材料的研发有推动作用。由于不同的反应条件，加入的4，4-偶氮吡啶和丙璜舒不同的比例，转化共晶效率不同，其中可以通过测定反应液中残余的4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的浓度来计算出二者形成共晶的转化率，从而选择出一种可行的工艺方法。目前对于单纯的丙磺舒的测定方法在中国药典有所记载：采用高效液相色谱法，流动相为0.05mol/l磷酸二氢钾（加入1%醋酸，用磷酸调ph为3）：乙腈（50:50）（中华人民共和国药典，hplc法，2010），但此方法配置过程繁琐，且缓冲盐浓度过高，不方便清洗，操作不当容易堵塞管路，所以有必要开发一种新的丙磺舒的分析方法。为了方便分析4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的含量，进而对不同条件共晶的转化率进行有效检测，有必要开发一种新的适用于同时测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明旨在提出一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，操作简单，稳定和重复性好，能够实现准确、快速的测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的含量。为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，包括如下步骤：（1）采用有机溶剂对反应液进行萃取，得到萃取液；（2）将步骤（1）中得到的萃取液进行高效液相色谱分析，分别得到所述的4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的含量；所述的高效液相色谱的操作条件为：流动相：流动相包括流动相a和流动相b，其中，流动相a为ph值为4的醋酸水溶液，流动相b为乙腈，所述的流动相a与流动相b的体积比为4：6；流速为1ml/min；检测器：vwd检测器；检测波长为258nm；进样量：5μl。进一步，所述的高效液相色谱分析时所采用的色谱柱为c18柱，规格为4.6×250mm，填料粒径为5μm；柱温为30℃。进一步，所述的萃取步骤为固相萃取。进一步，所述的有机溶剂为乙腈和甲苯的混合物，所述的乙腈和苯的体积比为（2-2.5）：1。进一步，所述的有机溶剂与反应液的体积比为1：（1.5-2.0）。相对于现有技术，本发明所述的测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法具有以下优势：（1）本发明所述的测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法灵敏度高、选择性和分离效果好，分析速度快（总检测时间为8min左右）。（2）本发明所述的测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法操作简单，稳定和重复性好，能够实现准确、快速的测定4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的含量，实用性强、应用范围广，能够指导行业内4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的测定。附图说明图1为4，4-偶氮吡啶标准样品的色谱图；图2为丙璜舒标准样品的色谱图；图3为反应液样品中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的色谱图；图4为流动相a为超纯水条件下采用高效液相色谱对反应液样品中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒色谱图；图5为为流动相a为ph=4的醋酸水溶液，流动相b为甲醇条件下采用高效液相色谱对反应液样品中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒色谱图；图6为流动相a为ph=4的醋酸水溶液，流动相b为乙腈条件下采用高效液相色谱对反应液样品中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒色谱图；图7为流动相a为ph=6的醋酸水溶液条件下采用高效液相色谱对丙璜舒进行测试色谱图；图8为流动相a为ph=5的醋酸水溶液条件下采用高效液相色谱对丙璜舒进行测试色谱图；图9为流动相a为ph=4.5的醋酸水溶液条件下采用高效液相色谱对丙璜舒进行测试色谱图；图10为流动相a为ph=4的醋酸水溶液条件下采用高效液相色谱对丙璜舒进行测试色谱图；图11为流动相a为ph=3.5的醋酸水溶液条件下采用高效液相色谱对丙璜舒进行测试色谱图。具体实施方式除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下面结合实施例及附图来详细说明本发明。实施例1一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，包括如下步骤：（1）在进行所述固相萃取前，先对反应液进行预处理，以对反应液进行初步提取，去除其中的固体杂质等，预处理的方法包括如下步骤：取200ml反应液置于10个50ml离心管中（即每个离心管中有20ml反应液），然后向每个离心管中加入5ml水、2g氯化钠和20ml乙腈，于3000r/min条件下离心5min，将上层清液转移至另一支离心管；再用20ml乙腈重复上述提取过程，合并提取液进行后续萃取处理；（2）采用有机溶剂对所述的提取液进行萃取，得到萃取液，有机溶剂包括乙腈和甲苯，乙腈和甲苯的体积比为2：1，采用乙腈和甲苯作为萃取剂，能够实现目标待测物的充分提取，为准确检测其含量提供基础，有机溶剂与反应液的体积比为1：1.8，萃取为固相萃取；固相萃取包括如下步骤：在固相萃取小柱（c18柱，规格为500mg，3ml）的上端装入1cm高的无水硫酸钠（起到干燥作用），先用萃取剂（乙腈-甲苯混合溶液，乙腈和甲苯的体积比为2：1，预淋洗所述固相萃取小柱，弃去淋洗液；然后将提取液过柱，并用萃取剂洗脱，控制流速为0.5ml/min，之后用旋转蒸发仪将所得洗脱液浓缩，剩余物用乙腈定容，过0.45μm有机相微孔滤膜后，得到萃取液供后续色谱检测；（3）将萃取液进行高效液相色谱分析，根据液相色谱的4，4-偶氮吡啶和丙璜舒标准曲线与所得色谱图，得到反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的含量，高效液相色谱操作条件如下：流动相：流动相包括流动相a和流动相b，其中，流动相a为ph值为4的醋酸水溶液，流动相b为乙腈，所述流动相a与流动相b的体积比为4：6；流速为1ml/min；进样量：5μl；检测器：vwd检测器；检测波长为258nm；进行所述高效液相色谱分析时所采用的色谱柱为c18柱，规格为4.6×250mm，填料粒径为5μm；柱温为30℃。乙腈：色谱级；甲苯：分析纯；乙酸：色谱纯；氯化钠：分析纯；无水硫酸钠，分析纯，经650℃灼烧4h，置于干燥器内备用；4，4-偶氮吡啶，分析纯；丙璜舒，分析纯。固相萃取小柱为c18柱，规格为500mg，3ml；分析天平，感量0.1mg；离心机；agilent1260高效液相色谱仪，配紫外检测器（vwd），高效液相色谱柱为poroshell120ecc18柱，规格为4.6×250mm，填料粒径为5µm；1.2标准溶液的配制将萃取液进行高效液相色谱分析后，根据4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的标准曲线与所得色谱图，得到反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量，4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的标准曲线为4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的质量浓度与色谱峰面积的线性回归方程。建立所述4，4-偶氮吡啶含量的标准曲线的方法包括如下步骤：提供系列浓度的4，4-偶氮吡啶标准溶液；将所述系列浓度的4，4-偶氮吡啶标准溶液分别进行高效液相色谱分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，峰面积对浓度作线性方程，得到4，4-偶氮吡啶含量的标准曲线；首先提供系列浓度的4，4-偶氮吡啶标准溶液。4，4-偶氮吡啶标准溶液的浓度范围为1-10mg/l。称取标准品4，4-偶氮吡啶10mg，精确至0.1mg，用适量乙腈溶解后转移至100ml容量瓶并定容，振荡摇匀，所得溶液为4，4-偶氮吡啶标准储备液；分别准确移取4，4-偶氮吡啶标准储备液1ml、2ml、4ml、6ml、10ml于5个100ml容量瓶中，用乙腈定容，得到系列浓度的4，4-偶氮吡啶标准溶液；得到系列浓度的4，4-偶氮吡啶标准溶液后，将系列浓度的4，4-偶氮吡啶标准溶液分别进行高效液相色谱分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，峰面积对浓度作线性方程，得到4，4-偶氮吡啶含量的标准曲线。高效液相色谱分析的条件与上述技术方案中测定萃取液时采用的高效液相色谱分析的条件一致，4，4-偶氮吡啶含量的标准曲线和相关系数分别为y=165.34x-1.698，r2=0.9987（y为峰面积；x为质量浓度，mg/l；r2为相关系数）；建立丙璜舒含量的标准曲线的方法与建立所述丙璜舒的标准曲线的方法一致，不同之处在于，丙璜舒标准溶液的浓度范围优选为1-20mg/l；丙璜舒含量的标准曲线和相关系数分别为y=115.42x-1.749，r2=0.9992（y为峰面积；x为质量浓度，mg/l；r2为相关系数）；根据4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的标准曲线与萃取液的色谱图，可以得到萃取液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的含量，进而得到4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的含量。1、样品检测：得到反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的含量；取两次平行测定得到的含量的平均值作为最终测试结果，结果如表1所示。表1反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的含量化合物种类含量（mg/l)4，4偶氮吡啶5.35丙璜舒11.722、加标回收率：采用标准物质添加法测定4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的样品回收率，以测定6次的平均值作为样品的原始值，添加不同质量的标样，按上述方法进行实验测定，计算回收率。结果如表2所示。从表2可以看出，样品回收率在98-102%之间，分析误差较小，操作过程损失较少，方法准确可靠。表24，4-偶氮吡啶和丙璜舒的样品回收率3、精密度：进行方法重复性实验，在重复性条件下测定了4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的平均值与变异系数，每个样品每天平行测定6次，进行6天重复，每个样品共36个重复性数据。结果如表3所示。由表3可以看出，重复性变异系数在1.16-2.19%，精密度较好。表34，4-偶氮吡啶和丙璜舒的平均值与变异系数对比例1一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于有机溶剂采用甲苯进行萃取。对比例2一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于有机溶剂采用乙腈进行萃取。为保证反应液萃取完全，选择合适的萃取剂是非常必要的。实施例1、对比例1-2分别采用乙腈-甲苯混合溶液（乙腈和甲苯的体积比为2：1）、甲苯、乙腈作为萃取剂进行萃取，检测结果如表4所示。从表4可以看出，几种萃取剂对4，4-偶氮吡啶和丙璜舒的萃取效果差异明显，乙腈-甲苯混合溶液萃取效果较好，可为首选萃取剂。表4不同萃取剂对检测结果的影响含量（mg/l)乙腈-甲苯混合溶液（乙腈与甲苯体积比2：1）甲苯乙腈4，4-偶氮吡啶5.355.343.98丙璜舒11.7210.2211.63对比例3一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于有机溶剂与反应液的体积比为1:10。对比例4一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于有机溶剂与反应液的体积比为1:5。对比例5一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于有机溶剂与反应液的体积比为1:2。对比例6一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于有机溶剂与反应液的体积比为1:1.8。对比例7一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于有机溶剂与反应液的体积比为1:1.5。对比例8一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于有机溶剂与反应液的体积比为1:1。反应液样品用甲苯-乙腈混合溶液（乙腈和甲苯的体积比为2：1）分别以不同萃取体积进行萃取，逐级添加有机溶剂的体积，对添加不同体积的萃取液萃取后进样检测，检测结果如表5所示。从表5可以看出，萃取剂体积变化对反应液样品的萃取效果无显著性差异。从节约资源和萃取效果角度考虑，可选取100ml，即100ml萃取剂可萃取180ml左右的样品。表5不同萃取剂体积对检测结果的影响对比例8一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于流动相a为超纯水。对比例9一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于流动相a为ph=4的醋酸水溶液，流动相b为甲醇。对实施例1与对比例8-9采用高效液相色谱对反应液4，4-偶氮吡啶和丙璜舒进行测试，结果显示流动相a（超纯水）不加醋酸的条件下丙璜舒的出峰效果很差（图4所示），而加醋酸调节ph=4，流动相b换为甲醇的条件下，4，4-偶氮吡啶出现肩峰（图5所示），只有调节溶液ph值到4，流动相b为乙腈的出峰效果最好，没有拖尾，肩峰的现象出现（图6所示）。所以选择流动相a用乙酸调ph值为4，流动相b为乙腈。对比例10一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于流动相a为ph=6。对比例11一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于流动相a为ph=5。对比例12一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于流动相a为ph=4.5。对比例13一种测定反应液中4，4-偶氮吡啶和丙璜舒含量的方法，与实施例1不同之处在于流动相a为ph=3.5。对实施例1与对比例10-13采用高效液相色谱对反应液4，4-偶氮吡啶和丙璜舒进行测试，果显示，ph在5和6的条件下，丙璜舒的出峰效果很差(图7，8），在ph-4.5的条件下，出峰效果有很大改善，但峰形仍然后倾（图9），而在ph在4和3.5的条件下，丙璜舒的出峰效果很好（图10，11），但考虑酸性越强，c18柱的键合相越容易水解，影响色谱柱使用寿命，所以采用ph=4醋酸条件下作为本实验的分析方法。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12